Summary
यहाँ, हम परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम), कोशिकाओं और ऊतकों पर एक नैनो और सूक्ष्म इंडेंटेशन उपकरण के रूप में संचालित प्रस्तुत करते हैं। साधन नमूना और उसके यांत्रिक गुणों के 3 डी सतह स्थलाकृति के एक साथ अधिग्रहण की अनुमति देता है, सेल दीवार यंग के मापांक के साथ ही turgor दबाव सहित.
Abstract
हम यहाँ परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए इंडेंट संयंत्र के ऊतकों और उसके यांत्रिक गुणों को ठीक प्रस्तुत करते हैं. इंडेंटेशन मोड में दो अलग-अलग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, हम दिखाते हैं कि एक लोचदार मापांक को कैसे मापें और सेल दीवार यांत्रिक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए इसका उपयोग कैसे करें। इसके अलावा, हम यह भी समझा कैसे turgor दबाव का मूल्यांकन करने के लिए. परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का मुख्य लाभ यह है कि यह गैर इनवेसिव है, अपेक्षाकृत तेजी से (5 डिग्री 20 मिनट), और है कि लगभग रहने वाले संयंत्र ऊतक है कि सतही फ्लैट के किसी भी प्रकार के उपचार के लिए आवश्यकता के बिना विश्लेषण किया जा सकता है. संकल्प बहुत अच्छा हो सकता है, टिप आकार के आधार पर और प्रति इकाई क्षेत्र माप की संख्या पर. इस विधि की एक सीमा यह है कि यह केवल सतही कोशिका परत के लिए सीधी पहुँच देता है.
Introduction
परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी (एसपीएम) परिवार से संबंधित है, जहां आमतौर पर कुछ नैनोमीटर की त्रिज्या के साथ एक टिप एक नमूने की सतह को स्कैन करता है। एक सतह का पता लगाने ऑप्टिकल या इलेक्ट्रॉन आधारित तरीकों के माध्यम से प्राप्त नहीं है, लेकिन टिप और नमूना सतह के बीच बातचीत बलों के माध्यम से. इस प्रकार, इस तकनीक के एक नमूना सतह (3 डी संकल्प जो कुछ नैनोमीटर के लिए नीचे जा सकते हैं) के स्थलाकृतिक लक्षण तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी इस तरह के इलेक्ट्रोस्टैटिक, वैन der Waals या संपर्क बलों के रूप में बातचीत बलों के किसी भी प्रकार की माप की अनुमति देता है. इसके अलावा, टिप एक जैविक नमूना की सतह पर बलों को लागू करने और जिसके परिणामस्वरूप विरूपण को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथाकथित "इंडेंटेशन", आदेश में अपने यांत्रिक गुणों का निर्धारण करने के लिए (उदा, यंग के मापांक, विस्कोलोची गुण).
पादप कोशिका की दीवारों के यांत्रिक गुणों को ध्यान में रखना आवश्यक है जब विकास प्रक्रियाओं के अंतर्निहित तंत्रों को समझने का प्रयास किया जाता है1,2,3. दरअसल, इन गुणों को विकास के दौरान कसकर नियंत्रित किया जाता है, विशेष रूप से क्योंकि कोशिका दीवार नरम कोशिकाओं को बढ़ने की अनुमति देने के लिए आवश्यक है। AFM इन गुणों को मापने और जिस तरह से वे अंगों, ऊतकों या विकासात्मक चरणों के बीच बदलने का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस पत्र में, हम वर्णन कैसे हम AFM का उपयोग करने के लिए दोनों सेल दीवार यांत्रिक गुण और turgor दबाव को मापने. इन दो अनुप्रयोगों के दो अलग AFM माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन कर रहे हैं और यहाँ के बाद विस्तृत हैं.
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Protocol
1. सेल दीवार यांत्रिक गुण के उपाय
नोट: Arabidopsis के विकासशील स्त्रीरोग का उदाहरण प्रस्तुत किया है.
- जैविक नमूनों की तैयारी
- Arabidopsis4के लिए प्रकाशित चरणों दृढ़ संकल्प के अनुसार 9 से 10 (लगभग 0.5 मिमी लंबी) चरण में एक बंद फूल की कली लीजिए । एक दूरबीन के तहत, ठीक चिमटी का उपयोग कर, ध्यान से विकास के चरण की जांच करने के लिए कली को खोलने के लिए और फूल के केंद्र में स्थित स्त्री रोग इकट्ठा।
- एक छोटे पेट्री डिश (5 सेमी के व्यास) के कवर के केंद्र में रखा डबल साइड टेप पर स्त्री रोग रखो.
नोट: एक विकल्प के रूप में, bioसंगत गोंद भी इंडेंटेशन पर नमूना के अधिक कुशल अचलीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. - तेजी से पानी जोड़ें जब तक नमूना पूरी तरह से कवर किया जाता है. यह निर्जलीकरण से बचा जाता है और नमूने के लिए टिप के आसंजन को कम कर देता है। वैकल्पिक रूप से, तरल माध्यम में नमूना डूब, जैसे Arabidopsis शीर्ष संस्कृति माध्यम5.
- एएफएम अंशांकन
- वांछित इंडेंटेशन तक नमूना सतह के विरूपण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त कैंटिलवर वसंत निरंतर k उच्च सेट करें, लेकिन संवेदनशीलता के नुकसान से बचने के लिए बहुत अधिक नहीं।
नोट: अंगूठे के किसी न किसी नियम के रूप में, यदि नमूने के यंग मापांक ज्ञात है, तो वसंत स्थिरांक के परिमाण के क्रम को ख़् म़् * केरूप में चुना जा सकता है, जहां र् वांछित इंडेंटेशन है। - 15 डिग्री मीटर टिप-कैंटिलवर दूरी के साथ एक आर $ 400 एनएम गोलाकार-समाप्त टिप का उपयोग करें।
नोट: टिप त्रिज्या सीधे पार्श्व संकल्प से संबंधित है. आम तौर पर, जैविक सामग्री पर इंडेंटेशन के लिए, गोल युक्तियाँ(आर 10-20 एनएम से अधिक) या कोलाइडयन जांच का चयन करें। छोटे कोलाइडयन जांच टिप अंत और cantilver कि नमूना सतह को छू सकता है के बीच छोटी दूरी के कारण उपयोग करने के लिए मुश्किल हो सकता है. - सॉफ्टवेयर पर स्विच करें और प्रयोग से पहले कम से कम 2-3 एच क्षैतिज रूप से सिर जगह: यह थर्मल प्रेरित cantilver-लेजर रिश्तेदार आंदोलनों से बचना होगा सिर थर्मल की अनुमति देगा। यदि माइक्रोस्कोप एक CellHesion मॉड्यूल के साथ सुसज्जित है (उपलब्ध $ piezo रेंज के बजाय 100 डिग्री मीटर के लिए विस्तार), पहले अपने नियंत्रक पर स्विच और फिर CellHesion मोड का चयन करें जब सॉफ्टवेयर शुरू.
- कांच ब्लॉक पर कैन्टीलवर माउंट और सिर पर ब्लॉक माउंट। टिप पर अल्ट्राप्योर पानी के कुछ माइक्रोलीटर की एक बूंद रखें ताकि जब टिप पानी में डूबा हो तो हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए।
- एक कठिन नमूना रखें (साफ ग्लास स्लाइड या नीलम) और ultrapure पानी के 30-50 डिग्री एल जोड़ें।
नोट: अंशांकन प्रक्रिया यहाँ वर्णित कभी कभी कहा जाता है संपर्क अंशांकन है. सबसे पहले, एक बल वक्र एक कठोर और सपाट सतह पर किया जाता है और फिर थर्मल उत्तेजित कैन्टीलवर के दोलन स्पेक्ट्रम वसंत स्थिरांक की गणना करने के लिए दर्ज किया जाता है। अन्य अंशांकन प्रोटोकॉल मौजूद हैं और संक्षिप्त चर्चा अनुच्छेद में वर्णित किया जाएगा। - मंच पर सिर रखें (बहुत अधिक उच्च मोटर्स उठाने के लिए सावधान रहें)। ऑप्टिकल छवि का प्रयोग मोटे तौर पर cantilver पर लेजर जगह है.
- कैटिलर के मुख्य अक्ष के साथ लेजर ले जाएँ photodiode पर योग संकेत की निगरानी.
नोट: जब मानक कैन्टीलवर का उपयोग किया जाता है, तो 0.5 ट से अधिक राशि प्राप्त की जानी चाहिए। - अन्य दिशा के साथ लेजर ले जाएँ और cantilver के बीच में लेजर की स्थिति के क्रम में योग संकेत को अधिकतम। यह पार्श्व और ऊर्ध्वाधर विक्षेप के बीच पार बात कम से कम होगा.
- कैटिलर के मुख्य अक्ष के साथ लेजर ले जाएँ photodiode पर योग संकेत की निगरानी.
- विक्षेप संवेदनशीलता का मापन
नोट: photodiode लेजर विस्थापन पढ़ता है और वोल्ट में एक संकेत प्रदान करता है. मीट्रिक इकाई में विक्षेप को मापने में सक्षम होने के लिए, विक्षेप संवेदनशीलता को मापा जाना चाहिए।- संपर्क में साधन सेट करें - बल स्पेक्ट्रोस्कोपी| एक सापेक्ष समुच्चय को 2 ट, र् लंबाई से 0ण्5 उ तक सेट करें तथा गति को 2 उध (नमूनादर से 10000 भ्र) तक बढ़ाएँ तथा बंद लूपका चयन करें।
- अंशांकन प्रबंधक खोलें और एक रेखीय फिट बनाने के लिए बल वक्र (कि रैखिक होना चाहिए) के संपर्क भाग का चयन करें: ढलान का व्युत्क्रम विक्षेप संवेदनशीलता देता है। फोटोडिओड पठन अब मीट्रिक इकाई में कैलिब्रेट किया गया है।
-
वसंत निरंतर का निर्धारण| अंशांकन प्रबंधकमें, थर्मल स्पेक्ट्रम अधिग्रहण चलाने के लिए स्प्रिंग स्थिरांक का चयन करें। लंबे समय तक सिग्नल का औसत करने के लिए, $ चिह्न का चयन करें. थर्मल उत्साहित cantilver की बिजली स्पेक्ट्रम कई चोटियों दिखा सकते हैं; इसे फिट करने के लिए सबसे कम आवृत्ति पर रखा एक के आसपास एक चयन आकर्षित।
नोट: यदि तापीय धुन द्रव में की जाती है, तो अनुनाद शिखर व्यापक होगा तथा इसकी आवृत्ति नाममात्र की तुलना में कम होगी।
- वांछित इंडेंटेशन तक नमूना सतह के विरूपण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त कैंटिलवर वसंत निरंतर k उच्च सेट करें, लेकिन संवेदनशीलता के नुकसान से बचने के लिए बहुत अधिक नहीं।
- फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोग सेट-अप और अधिग्रहण
- AFM मंच पर नमूना प्लेस और नमूने पर सिर जगह है.
नोट: सुनिश्चित करें कि सिर टिप और नमूना सतह के बीच एक कठिन संपर्क से बचने के लिए काफी वापस ले लिया गया है. - कैन्टीलवर को कुछ मिनट के लिए थर्मल ाकाा कर ां दो.
- QI मोड में, 50 nN के एक Setpoint बल के साथ दृष्टिकोण.
- 40 x 40 के पिक्सेल की संख्या के साथ 80 x 80 डिग्री उ2 के लिए 4 डिग्री उ उ और स्कैन क्षेत्रफल की लंबाई सेट करें। उन्नत इमेजिंग सेटिंग्स पैनल में, मोड को स्थिर गति पर सेट करें. सेट विस्तार और 200 m/s और नमूना दरों को 25 kHz करने के लिए गति वापस लेने.
- स्कैनिंग शुरू और नमूना चलता रहता है, तो जाँच के लिए इस तेजी से कम बल स्कैनिंग का उपयोग करें। सत्यापित करें कि स्कैन क्षेत्र मलबे या विक्षेपित कोशिकाओं से मुक्त है और माप करने के लिए संभव के रूप में फ्लैट के रूप में ब्याज के एक क्षेत्र का पता लगाने।
नोट: आदेश में वास्तविक नमूना झुकाव की सराहना करने के लिए, लाइन leveling बंद करने के लिए या लगातारकरने के लिए सेट किया जाना चाहिए। इंडेंटेशन अक्ष और सतह के बीच अत्यधिक झुकाव कोण का मापांक यंग के मापांक5पर प्रभाव पड़ेगा। - एक बार ब्याज का एक क्षेत्र स्थित किया गया है, 40 x 40 से 60 x 60 $m2 के एक क्षेत्र का चयन करें इसके चारों ओर और पिक्सेल संख्या बढ़ाने के लिए 2 पिक्सेल / प्रयोग के आरंभ में यदि आवश्यक हो, तो इस मान को समायोजित करें. $ लंबाई को घटाकर 2 डिग्री उ. कमी बढ़ाकर 100 उध/
- स्कैनिंग शुरू करने और आउटपुट को बचाने (आम तौर पर एक छवि और एक डेटा फ़ाइल द्वारा रचित).
- माप दिन के अंत में, टिप धारक को हटा दें और इसे अल्ट्राप्यूरेट पानी और 70% EtOH के साथ धीरे से कुल्ला।
- सूखी और cantilver हटा दें. एक ही टिप के साथ आगे के प्रयोगों के लिए, यह एक गीला सफाई प्रोटोकॉल के साथ सफाई पर विचार करें और, यदि संभव हो तो, एक अनुवर्ती प्लाज्मा ओ2 उपचार. नमक क्रिस्टलीकरण से बचने के लिए कैन्टीलवर और/या टिप धारक पर पानी को सूखा न दें।
- AFM मंच पर नमूना प्लेस और नमूने पर सिर जगह है.
- डेटा विश्लेषण (6.x डेटा प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर संस्करण के लिए)
- डेटा संसाधन सॉफ़्टवेयर खोलें और डेटा फ़ाइल लोड करें.
- मानचित्र के सभी वक्रों पर समान विश्लेषण पैरामीटर का उपयोग करने के लिए बैच प्रोसेसिंग बटन के लिए इस मानचित्र का उपयोग करें पर क्लिक करें.
- लोड पूर्व निर्धारित प्रक्रियामें, हर्ट्ज फिटका चयन करें।
- अंशांकन पैरामीटर को सत्यापित करने या परिवर्तित करने के लिए पहले टैब का उपयोग करें.
- दूसरे टैब में, इसके औसत मान 0 पर सेट करने के लिए आधार रेखा से ऑफ़सेट (या ऑफ़सेट प्लस एक झुकाव) निकालें।
- तीसरे टैब में, विस्तार वक्र के साथ सेटपॉइंट मान से नीचे आने पर 0 बल को पार करने वाले प्रथम बिंदु के रूप में विचार करके संपर्क के बिंदु (पीओसी) स्थिति का अनुमान लगाइए।
- टैब अनुलंब टिप स्थिति ऊंचाई मापा से cantilver विक्षेप घटाकर टिप आंदोलन की गणना करता है. इस चरण पर, संबंधित चेकबॉक्स की जाँच करके, निम्न फ़िट के लिए Unsmothed ऊँचाई (raw डेटा) का उपयोग करें.
- लोच फिट टैब में, उपयुक्त फ़िट मॉडल का चयन करें। यदि कोई या कमजोर आसंजन वापस लेने के वक्रों पर दिखाई देता है (सेकम 10% से कम सेटपॉइंट बल के अनुरूप या चयनित इंडेंटेशन गहराई पर अधिकतम औसत बल के लिए), तो मॉडल प्रकार हर्ट्ज/Sneddon पर सेट किया जाना चाहिए और वक्र का विस्तार किया जाना चाहिए। मजबूत आसंजन के मामले में, DMT मॉडल, जो Derzauin-Muller-Toporov मॉडल के लिए खड़ा है, पसंद किया जाना चाहिए और फिट वापस लेने घटता पर किया जाना चाहिए (उपलब्ध संपर्क मॉडल और संबंधित सूत्र पर विवरण के लिए मैनुअल को देखें).
- नाममात्र टिप आकार के आधार पर टिप ज्यामितीय पैरामीटर सेट करें। यहाँ, टिप आकार क्षेत्र है और टिप त्रिज्या 400 एनएम है.
- यह पारंपरिक रूप से जैविक सामग्री के लिए किया जाता है के रूप में 0.5 करने के लिए Poison के अनुपात सेट (असंपीड्य सामग्री के अनुरूप).
-
विशिष्ट इंडेंटेशन के लिए फ़िटकरें| डिफ़ॉल्ट रूप से, फिट पूरे वक्र पर किया जाता है. फिट एक विशिष्ट इंडेंटेशन करने के लिए किया जा करने के लिए है, तो पहले शिफ्ट वक्र चेक बॉक्स की जाँच करें; यह नए निर्धारित आधार रेखा और POC मानों के आधार पर वक्र के मूल को बदल देगा।
- मुख्य विंडो पर आइकन पर क्लिक करके एक दूसरी लोच फिट दिनचर्या जोड़ें.
- सभी फिट मापदंडों को फिर से सेट करें और X मिनट में वांछित इंडेंटेशन निर्दिष्ट करें। POC स्थिति और बाद में परिकलित इंडेंटेशन गहराई के निर्धारण को परिष्कृत करने के लिए आवश्यक (2 से 3 चरणों के लिए पर्याप्त होना चाहिए) के रूप में कई चरणों जोड़ें। प्रक्रिया इस बिंदु पर सहेजा जा सकता है।
- रखें पर क्लिक करें और नक्शे के सभी घटता पर पिछले चरणों को पुनरावृत्ति करने के लिए सभी के लिए लागू होते हैं।
- परिणाम सहेजें। एक छवि और एक .tsv फ़ाइलें प्राप्त की जाएँगी.
2. Turgor दबाव के उपाय
नोट: अरबिडोप्सिस के ओरिजालिन-उपचारित पुष्पक्रम मेरिस्टम का एक उदाहरण प्रस्तुत किया गया है।
- जैविक नमूने की तैयारी
- प्रकाशित विधि के बाद प्रकाशित विधि के बाद ध्रुवीय ऑक्सिन ट्रांसपोर्ट इनहिबिटर 1-एन-नैथ्थिलथैलेमिक एसिड (एनपीए) वाले माध्यम पर उगाए गए इन विट्रो प्लांटलेट से माइक्रोट्युब depolymerizing दवा ओरिजालिन के साथ इलाज किया गया Arabidopsis पुष्पक्रम (आईएम) लीजिए 6.
- दो विकल्पों में से एक के बाद IM नमूना माउंट करना
- लंबी अवधि की निगरानी के लिए: प्रदूषण को रोकने के लिए Arabidopsisशीर्ष संस्कृति माध्यम (एसीएम) 7,8 और 0.1% संयंत्र संरक्षण मिश्रण (पीपीएम) युक्त एक पेट्री-डिश में नमूना माउंट करें। ACM सतह के ऊपर IM टिप निलंबित और 2% agarose की एक बूंद के साथ IM के आधार का समर्थन करते हैं.
- तेजी से समाधान परिवर्तन के साथ माप के लिए: चिपकने वाला mastic का एक छोटा सा टुकड़ा पकड़े एक पेट्री-डिश में नमूना माउंट, और जल्दी से जैव संगत गोंद के साथ mastic और नमूना आधार के बीच अंतर सील. गोंद के लिए प्रतीक्षा करें ठोस करने के लिए (कम से कम 2 मिनट), तो तरल ACM में नमूना डूब 0.1% पीपीएम युक्त.
नोट: सुनिश्चित करें कि नमूना सतह agarose या गोंद के साथ लेपित नहीं है जब नमूना आधार फिक्सिंग. Turgor दबाव के AFM माप नमूना stably घुड़सवार होने की आवश्यकता है, और पिछले बढ़ते तरीकों स्वीकार्य स्थिरता प्रदान करते हैं. नमूने के आधार पर, अन्य बढ़ते तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे डबल-साइडेड टेप, पॉली-लाइसिन, आदि।
- एएफएम अंशांकन
- AFM अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चालू करें और PeakForce QNM (बड़े आयाम) माप मोड का चयन करें.
- चरण 2.1 से 2.6 में वर्णित एक ही सिद्धांत का पालन अंशांकन करें।
- चेक पैरामीटर विंडो में, 0 करने के लिए स्कैन आकार सेट करें। रैंप विंडो में, 200 एनएम और 500 एनएम के बीच रैंप आकार सेट, 2 वी और 5 वी और 2048 या उच्चतर करने के लिए नमूनों की संख्या के बीच ट्रिग सीमा।
- अंशांकन नमूने के साथ कैन्टीलवर टिप संरेखित करें और दृष्टिकोणपर क्लिक करें।
- संपर्क पर, रैंप खिड़की पर जाने के लिए और बटन सतत रैंपपर क्लिक करें। वक्र के रैखिक शासन पर, अद्यतन संवेदनशीलता बटन पर क्लिक करके ढलान निर्धारित करते हैं. विक्षेप संवेदनशीलता माप को कई बार दोहराएँ और मेनू अंशांकनसे टैब डिटेक्टर खोलकर माप औसत के साथ अंशांकन को मैन्युअल रूप से अद्यतन करें.
- AFM सिर वापस लें और अंशांकन नमूना हटा दें.
नोट: यह पूरी तरह से टैब स्टेज का चयन करके AFM सिर वापस लेने के लिए सुझाव दिया है - नमूना परिवर्तन पर आकस्मिक कठिन संपर्क को रोकने के लिए प्रारंभ करें.
- फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोग सेट-अप और अधिग्रहण
- यदि नमूना अभी तक जलमग्न नहीं है, तो इसे पीएम युक्त तरल एसीएम के साथ जलमग्न कर दें।
- प्राप्ति सॉफ़्टवेयर में, माप पैरामीटर निम्नानुसार निर्दिष्ट करें:
- चेक पैरामीटर विंडो में, कैंटिलवर के निर्मित वसंत स्थिरांक या चरण 2.8 के रूप में निर्धारित वसंत स्थिरांक के लिए स्प्रिंग स्थिरांक सेट करें। इस उदाहरण में, यह 42 छधm पर सेट किया गया है।
- इस उदाहरण में युक्ति त्रिज्या को 400 दउ पर सेट करें.
- सेट नमूना Poison के अनुपात 0.5 करने के लिए, के बाद से पानी turgor दबाव के लिए मुख्य रूप से योगदान देता है.
- तेजी से अधिग्रहण सुनिश्चित करने के लिए नमूना/लाइन को 128 पर सेट करें।
- 0.2 हर्ट्ज के लिए स्कैन दर सेट करें।
- स्कैन आकार को 1 डिग्री उ पर सेट करें.
नोट: स्कैन दर सेट कर रहा है और आकार छोटा स्कैन प्रभावी रूप से AFM स्कैन-ट्रिगर नमूना क्षति को रोक सकता है। यह किसी भी नमूना परिवर्तन पर इन दो मापदंडों को कम करने की सिफारिश की है. - रैंप विंडो में, रैंप आकार को 5 डिग्री मी पर सेट करें।
नोट: यह बेहतर बेहतर आधारभूत अधिग्रहण के लिए इरादा इंडेंटेशन गहराई से बड़ा रैंप आकार की स्थापना है। - अधिकतम करने के लिए Trig सीमा सेट करें।
- नमूनों की संख्या 4608 पर सेट करें.
- वैकल्पिक रूप से, माइक्रोस्कोप में - सगाई पैरामीटर टैब, मजबूत संपर्क प्रेरित नमूना क्षति को रोकने के लिए निम्नलिखित मानकों को कम. सेट पीक फोर्स संलग्न Setpoint करने के लिए 0.3 V (डिफ़ॉल्ट 0.5 V) सेट संलग्न int. लाभ करने के लिए 0.5 (डिफ़ॉल्ट 0.75). सेट SPM 4 डिग्री (डिफ़ॉल्ट 15 डिग्री मी) के लिए कदम संलग्न हैं।
- प्लेस और AFM सिर के तहत नमूना संरेखित करें, और दृष्टिकोण जब तक cantilever जलमग्न है, लेकिन नमूना सतह के साथ संपर्क में नहीं है.
नोट: जबकि आ, हल्के से तरल एसीएम की सतह पर झटका जब तक एक तरल पुल cantilver और तरल सतह के बीच का गठन किया है. यह आमतौर पर कठिन संपर्क को रोकता है. - देखभाल के साथ, मैन्युअल रूप से नमूने की ओर दृष्टिकोण. जब जांच नमूना सतह के अपेक्षाकृत करीब है, दृष्टिकोणक्लिक करें.
- संपर्क करने पर, धीरे-धीरे स्कैन आकार और / या स्कैन दर में वृद्धि जब तक नमूना और /
नोट: स्कैन आकार सतह वक्रता और नमूने की खुरदरापन द्वारा सीमित है। ओरिजालिन-उपचारित आईएम के मामले में, 50 x 50 डिग्री मी2 स्कैन क्षेत्र0 0ण्3 भ्र की स्कैन दर से प्राप्त किया जा सकता है। - स्कैनिंग करते समय, निर्धारित करें कि माप क्षेत्र वांछित है या नहीं. यदि आवश्यक हो तो स्थानांतरित करें। संतुष्ट होने पर, बिंदु आरंभ करने और विंडो शूट करने के लिए बटन प्वाइंट और शूट करें पर क्लिक करें।
- स्कैन रिकॉर्डिंग से पहले, सेल आकृति की स्पष्ट पहचान की सुविधा हो सकती है कि एक उपयुक्त छवि चैनल का चयन करें। अक्सर, पीक बल त्रुटि, DMT Modulus, LogDMT मॉड्यूलस या क्षय उपयुक्त है. निर्देशिका और फ़ाइल नाम सहेजें निर्दिष्ट करें. फिर रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए अगले स्कैन पर रैंप पर क्लिक करें।
नोट: आपके निर्दिष्ट फ़ाइल नाम (जैसे .000) के बाद एक डॉट और तीन संख्याओं की एक स्ट्रिंग स्वचालित रूप से जोड़ दी जाएगी. प्रत्येक सहेजे गए स्कैन पुनरावृत्ति पर यह संख्या स्वचालित रूप से 1 से बढ़ जाती है। - स्कैन पूरा हो गया है, जब सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस स्वचालित रूप से रैंप विंडो पर पुनः निर्देशित किया जाएगा। इंडेंट करने के लिए स्थान निर्दिष्ट करने के लिए स्कैन की गई छवि पर क्लिक करें.
नोट: इंडेंटेशन रिकॉर्ड करने से पहले, केवल रैंपपर क्लिक करके परीक्षण इंडेंट करने के लिए कई स्थलों का चयन करना बेहतर है, यदि पैरामीटर परिवर्तन की आवश्यकता होती है (रैम्प आकार, पिजोस्थिति, आदि के लिए)। इंडेंटेशन गहराई सेल दीवार मोटाई से बड़ा होने की जरूरत है (आदर्श रूप से संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा अलग से निर्धारित). - इसके barycenter के पास प्रति कक्ष कम से कम तीन इंडेंटेशन साइट्स चुनें, और प्रति साइट तीन बार इंडेंटेशन दोहराएँ. यह आगे के विश्लेषण के लिए प्रति सेल में कम से कम नौ बल वक्रों की उपज होगी। इंडेंटेशन साइट प्लेसमेंट से संतुष्ट होने पर, रैम्पपर क्लिक करें और कैप्चर करें. बल-इंडेंट वक्र स्वचालित रूप से निर्दिष्ट निर्देशिका में सहेजे जाते हैं।
- रैंप पूरा कर रहे हैं, टाइल माप के लिए एक अलग स्थिति में स्थानांतरित, या स्कैन सिर और नमूना बदलने वापस ले।
- समाप्त होने पर, 1.3.8 और 1.3.9 चरणों में के रूप में cantilver साफ.
- डेटा विश्लेषण
- विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में, *.mca फ़ाइल खोलें। यह स्कैन की गई छवि पर प्रत्येक बल वक्र की स्थिति को दर्शाता है। यदि वांछित, पूर्व चयन बल विश्लेषण के लिए घटता है.
- विश्लेषण करने के लिए एक बल वक्र खोलें, आमतौर पर x000y.00zके प्रारूप में, जहाँ x बचत निर्देशिका में निर्दिष्ट फ़ाइल नाम है, जबकि y और z स्वचालित रूप से संख्याओं को इंगित करते हुए संख्याओं को पंजीकृत किया जाता है।
- आधार रेखा सुधार बटन क्लिक करें और स्रोत आधार रेखा प्रारंभ और विस्तृत करें स्रोत आधार रेखा बंद करें 0% और 80% पर हैं, क्रमशः जब तक बल वक्र पर नीले डैश रेखा खींचें। निष्पादितकरें क्लिक करें.
नोट: वैकल्पिक रूप से, स्रोत आधार रेखा रोकें विस्तृत करें विभिन्न मानों पर सेट किया जा सकता है, जब तक कि यह अभी भी आधार रेखा के भीतर है और संपर्क बिंदु से बाहर नहीं है. - Boxcar फ़िल्टर बटन क्लिक करें और बल वक्र को चिकना करने के लिए निष्पादित करें क्लिक करें.
- इंडेंटेशन बटन क्लिक करें.
- इनपुट विंडो में, सक्रिय वक्र को विस्तृत करने के लिए सेट करें.
- फ़िट विधि को linearized मॉडल में सेट करें और Adhesion Force को हाँमें शामिल करें.
- अधिकतम बल फिट सीमा को 99% और न्यूनतम फोर्स फिट बाउंडसीमा को 75% तक सेट करें।
- कठोरता (लाइनर) के लिए फिट मॉडल सेट करें।
नोट: इस सेटअप turgor दबाव कटौती के लिए स्पष्ट कठोरता कश्मीर की गणना करेगा. इस उदाहरण में, फिट सीमाएं लगभग 1.5 डिग्री मीटर इंडेंटेशन गहराई के एक कठोरता फिट को प्रतिबिंबित करती हैं।
- बल वक्रों का बैच में विश्लेषण किया जा सकता है। इतिहास चलाएँ बटन क्लिक करें, रिपोर्ट निर्देशिका निर्दिष्ट करें और समान उपचार की आवश्यकता वाले अन्य सभी बल वक्र जोड़ें. संतुष्ट होने पर, चलाएँक्लिक करें. डिफ़ॉल्ट रूप से, फ़िट को *.txt फ़ाइल के रूप में संग्रहीत किया जाएगा.
- जब k बैच फिट किया गया हो, तो इंडेंटेशन विंडो पर वापस जाने के लिए इतिहास ] 5 इंडेंटेशन क्लिक करें.
- अधिकतम बल फ़िट सीमा को 10% और न्यूनतम बल फ़िट बाउंड सीमा को 0% तक बदलें.
- हर्ट्जियन (स्फीरिकल) के लिए फिट मॉडल सेट करें।
नोट: यह टरगोर दबाव कटौती के लिए सेल दीवार यंग के मापांक ई की गणना करेगा। इस उदाहरण में, फ़िट सीमाएँ लगभग 0.4 डिग्री मीटर इंडेंटेशन गहराई के हर्ट्जियन फ़िट (गोलीय जांच का उपयोग करके) को प्रतिबिंबित करती हैं.
- ईके लिए बैच फिट के लिए चरण 2.4.6 दोहराएँ.
- *.00z फ़ाइल खोलें (z स्वचालित रूप से पंजीकृत स्कैन संख्या है) विभिन्न स्कैन चैनल प्रदर्शित करने के लिए. ऊँचाई चैनल विंडो में, अनुभाग बटन क्लिक करें. यह नमूना की सतह वक्रता है कि turgor दबाव कटौती के लिए आवश्यक है की माप की अनुमति देगा.
- एक कक्ष के लंबे अक्ष पर एक रेखा आरेखित करें, डैश रेखा सीमाओं को कक्ष किनारों पर ले जाएँ, और Radius मान r1को रिकॉर्ड करें. त्रिज्या त2को पुनः प्राप्त करने के लिए लघु अक्ष के लिए इसे दोहराएँ। दो रेडी माप का उपयोग करते हुए सेल की सतह माध्य वक्रता की गणना करें-
और
- एक कक्ष के लंबे अक्ष पर एक रेखा आरेखित करें, डैश रेखा सीमाओं को कक्ष किनारों पर ले जाएँ, और Radius मान r1को रिकॉर्ड करें. त्रिज्या त2को पुनः प्राप्त करने के लिए लघु अक्ष के लिए इसे दोहराएँ। दो रेडी माप का उपयोग करते हुए सेल की सतह माध्य वक्रता की गणना करें-
- पतली-शेल मॉडल का उपयोग करके टर्गोर दबाव पी को निम्नानुसार9 प्रकाशित किया गया है:
साथ
जहां टी सेल दीवार मोटाई उदा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जाता है।
नोट: टगर दबाव की कटौती एक उपयुक्त प्रक्रिया है, जहां पुनरावृत्तियों की आवश्यकता होती है। चार पुनरावृत्तियां आम तौर पर स्थिर उत्पाद को पुन: उत्पन्न करने में सक्षम हैं, हालांकि अधिक पुनरावृत्तियां की जा सकती हैं (उदाहरण के लिए 100 बार)। - परिकलित करें माध्य म्, k तथा च प्रति सेल। इसके अलावा, प्रलेखन के लिए इंट्रासेल्यूलर परिवर्तनशीलता (उदाहरण के लिए, मानक विचलन) रजिस्टर करें।
और
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Representative Results
चित्र 1A और चित्र 1B प्रोटोकॉल के चरण 1.3.4 से 1.3.6 के परिणाम का चित्रण करते हुए एक स्क्रीनशॉट दिखाते हैं, जिसका उपयोग रुचि के उस क्षेत्र का पता लगाने के लिए किया जाता है जहां क्यूआई मानचित्र प्राप्त करना है। यह उल्लेखनीय है कि ब्याज के क्षेत्र के क्रम में एक झुका सतह पर नहीं चुना गया है (यानी, के रूप में संभव के रूप में फ्लैट). वास्तव में, जैसा कि रूटियर एट अल 5 द्वारा देखा गया है, यदि इंडेंटेशन अक्ष सतह के लंबवत नहीं है, तो युवा के मापांक को कम करके आंका जा सकता है। यह प्रभाव चित्र 1के C या D पैनल ों के ऊपरी-दाएँ कोने पर दिखाई देता है, जहां कोशिकाओं की सीमा का हिस्सा बाकी कक्ष की तुलना में नरम दिखता है. इस प्रभाव से प्रेरित कलाकृतियां मेरिस्टेम के मामले में कहीं अधिक मजबूत होंगी, जहां स्थानीय झुकाव कोण आसानी से 50 x 50 डिग्री मीटर2 स्कैन क्षेत्रों से 40 डिग्री अधिक दूर हो सकता है। हमारी प्रयोगशाला में, हम वर्तमान में एक एल्गोरिथ्म विकसित कर रहे हैं, Routier एट अल द्वारा वर्णित दृष्टिकोण के आधार पर,उनकलाकृतियों को सही करने के लिए (तैयारी में कागज). चित्र 1C और चित्र 1D प्रोटोकॉल के चौथे पैराग्राफ में विस्तृत विश्लेषण के बाद प्राप्त यंग के मापांक मानचित्रों को दर्शाते हैं। विशेष रूप से, पैनल सी पूरे इंडेंटेशन का विश्लेषण प्राप्त युवा मापांक का प्रतिनिधित्व करता है, उपयोगकर्ता परिभाषित बल setpoint तक, जबकि पैनल डी इंडेंट के पहले 100 एनएम के विश्लेषण के परिणाम से पता चलता है (के रूप में चरण 1.4.9 में वर्णित). यहाँ, 2 नक्शे अत्यधिक समान दिखते हैं, क्योंकि प्रयोग सेट-अप के दौरान, 100 एनएम के आसपास औसत इंडेंटेशन प्राप्त करने के लिए सेटपॉइंट चुना गया है। विश्लेषण इंडेंटेशन की भिन्नता कभी कभी बेहतर नमूना विषमताओं को उजागर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, कि स्थान की पहचान करने के लिए या आंतरिक संरचनाओं के व्यवहार पर जानकारी प्रदान करने के लिए उपयोगी हो सकता है (उदाहरण के लिए, कोस्टा एट अल.10)
चित्र 2 में बल वक्र दो प्रभावों को दर्शाता है जो उल्लेख के योग्य हैं। सबसे पहले, यह देखा जा सकता है कि यदि बल वक्र का प्रणाम भाग वास्तव में 500 एनएन के सेटपॉइंट बल पर समाप्त होता है, तो नीचे की ओर की नोक गति जारी रहती है, जिसका अर्थ है कि टिप द्वारा अनुप्रयुक्त अंतिम बल अपेक्षित से अधिक है (यहाँ 1,000 एन.एन.)। यह इस तथ्य के कारण है कि कैन्टीलवर विक्षेप की निगरानी करने वाला फीडबैक लूप तत्काल कार्य नहीं करता है, इसलिए इसके परिमित अभिक्रिया समय विक्षेपण थ्रेशोल्ड का पता लगाने और पाइजो आंदोलन स्टॉप के बीच अंतराल का परिचय देता है। इसके अलावा, विशेष रूप से जब CellHesion जो नमूना धारक चलता है का उपयोग कर, चलती भागों की जड़ता खेलने में आता है, इस समय अंतराल लंबे समय तक बना रही है. इस मुद्दे को सिर piezo का उपयोग करके सीमित किया जा सकता है, जो मामले में उपयोगकर्ता बहुत किसी न किसी या झुका नमूने पर माप के मामले में वास्तव में सावधान रहना चाहिए, या रैंप वेग को कम करने से, जो वैसे भी संकल्प को सीमित करता है और / इसके अलावा भी धीमी गति से नक्शे के लिए, बढ़ नमूना एक मुद्दा बन सकता है). आम तौर पर, यदि बल वक्र एक-दूसरे से पर्याप्त हैं (पसंद के इंडेंटेशन मॉडल के आधार पर, इंडेंट किए गए क्षेत्र की त्रिज्या की गणना इंडेंट गहराई को देखते हुए की जा सकती है और न्यूनतम पृथक्करण दूरी के रूप में उपयोग की जा सकती है), तो विभिन्न में किए गए माप नमूने के साथ पदों सहसंबद्ध नहीं किया जाना चाहिए और यदि विश्लेषण दृष्टिकोण वक्र पर किया जाता है, बल सीमा पर काबू पाने के एक मुद्दा नहीं होना चाहिए. वैसे भी, अगर नमूना नाजुक है या दोहराया स्कैन एक ही क्षेत्र पर किया जाता है, वैज्ञानिक इस overshoot को कम करने की कोशिश करना चाहते हो सकता है. दुर्भाग्य से, इस ओवरशूट की मात्रा निर्धारित करने के लिए अंगूठे का कोई नियम नहीं है, क्योंकि यह इस्तेमाल किए गए पाइजो पर निर्भर करता है, रैंप वेग पर, लेकिन सामग्री के गुणों पर भी: सामग्री को कठोर, समय में विक्षेप संकेत की तेजी से भिन्नता और , एक परिमित प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया समय दिया, उच्च overshoot.
दूसरी बात को नोटिस करने के लिए दीर्घवृत्त द्वारा प्रकाश डाला वापस लेने वक्र पर लहराते है. इस तरह लहराते टिप की कार्रवाई के तहत चलती नमूना चलती का एक संकेत हो सकता है / इस मामले में, उपयोगकर्ता स्कैन क्षेत्र को बदलने की कोशिश कर सकते हैं (कभी कभी माइक्रोस्कोप के अन्य भाग लेकिन टिप नमूना स्पर्श कर सकते हैं, या नमूना अपर्याप्त अच्छी तरह से अपने समर्थन करने के लिए तय किया जा सकता है) या नमूना अगर उनमें से कई एक ही समर्थन पर तैयार किया गया है. यदि सुविधा हमेशा वहाँ है, यह निर्धारण विधि बदलने के लिए बेहतर है, इस मामले में दो तरफा टेप निर्धारण से bioसंगत गोंद के लिए स्विचन.
चित्र 3 turgor दबाव कटौती के लिए प्रमुख मानकों के निर्धारण को दर्शाया गया है. सेल दीवार मोटाई11 जो अलग से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया गया था के अलावा हर पैरामीटर $ 740 एनएम होने के लिए, AFM स्कैन और indentations से प्राप्त किया जा सकता है. चरण 2.4.10 में फिटिंग प्रक्रिया के बाद, टर्गर दाब इस बल वक्र के लिए 1.50 MPa होने के लिए deduced है। इस कक्ष में सभी अठारह बल वक्रों को एकत्रित करने से म् के औसत मान ों की प्राप्ति होती है - 6ण्77 र् 1ण्02 MPa, k ] 14.18 ] 2.45 N/m और P ] 1.45 - 0ण्29 MPa (mean ] मानक विचलन).
चित्र 1 : शीर्ष लेखा मानचित्र (ऊँचाई मापित) आमतौर पर किसी प्रयोग के दौरान प्राप्त की गई. (क) स्कैन करने के लिए उपयुक्त क्षेत्र खोजने के लिए पहला निम्न रिज़ॉल्यूशन/कम बल मानचित्र रिकॉर्ड किया जाता है। (ख) यंग के मापांक (काले डॉटेड वर्ग द्वारा हाइलाइट किए गए क्षेत्र पर) की गणना के लिए एक छोटा उच्च रिज़ॉल्यूशन/उच्च बल मानचित्र प्राप्त किया जाता है। (ग) यंग के मापांक मानचित्रों की गणना बी मानचित्र से की गई है, जैसा कि चरण 1-4 में विस्तृत है। यहाँ, यंग का मापांक मानचित्र प्रत्येक बल वक्र पर पूरे इंडेंटेशन का विश्लेषण करते हुए प्राप्त किया गया है। (घ) यंग का मापांक मानचित्र केवल प्रथम 100 दउ इंडेंट का विश्लेषण करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : बल वक्र का उदाहरण. नीले रंग में दृष्टिकोण, लाल वापस लेने खंड में. बल अधिकतम (प्रतिकर्ष वक्र पर स्थित) परिमित प्रतिक्रिया लूप अभिक्रिया समय तथा जड़त्व के कारण बल समुच्चय से भिन्न होता है। वापस लेने वक्र में लहराते अपने समर्थन करने के लिए नमूना निर्धारण में एक कमी का प्रतिनिधि हो सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : turgor दबाव कटौती के लिए AFM माप. (क) डीएमटी मापांक मानचित्र सेल बैरीसेंटर के निकट गहन-इंडेंटेशन स्थलों की स्थिति की निगरानी करने के लिए स्पष्ट सेल समोच्च को दर्शाता है। इंडेंट साइटों पार द्वारा चिह्नित कर रहे हैं. (ख) एमें रेडक्रॉस स्थिति में गहरे इंडेंटेशन का बल वक्र . सेल दीवार यंग के मापांक ई (हरा) और नमूना स्पष्ट कठोरता कश्मीर (लाल) चरण 2.4 में विस्तृत के रूप में वक्र के विभिन्न सरकारों में फिट कर रहे हैं। आर 2 फिट के निर्धारण के गुणांक को दर्शाता है। (C) हाइट मैप, जिसमें मैन्युअल रूप से निर्धारित लंबा और छोटा अक्ष हैं, जिन्हें सफेद रेखाओं द्वारा चित्रित किया गया है, उसी सेल का विश्लेषण पैनल A और B. (D) कक्ष C (नीले, लंबे अक्ष लाल, लघु अक्ष) और फिटे में कक्ष के लंबे और छोटे अक्षों की ऊँचाई प्रोफ़ाइल वक्रता की डी त्रिज्या (त1 और त2)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
पौधों में आकृतियों का उद्भव मुख्य रूप से समय और स्थान के दौरान समन्वित दर और विकास की दिशा द्वारा निर्धारित किया जाता है। पादप कोशिकाओं को पॉलीसैकेर्डिक मैट्रिक्स से बनी एक कठोर कोशिका दीवार में रखा जाता है, जो उन्हें एक साथ सजे ताक पर रख देती है। नतीजतन, सेल विस्तार सेल दीवार पर खींच turgor दबाव के बीच संतुलन द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और सेल दीवार की कठोरता इस दबाव का विरोध. अंतर्निहित विकास तंत्र को समझने के लिए, सेल दीवार यांत्रिक गुणों के साथ-साथ विभिन्न ऊतकों या किसी दिए गए अंग की कोशिकाओं में टगर दबाव दोनों को मापने में सक्षम होना महत्वपूर्ण है। के रूप में इस कागज में प्रदर्शन किया, AFM इस संदर्भ में पसंद की विधि है.
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं। पहले एक ऊतक की तैयारी है जो निर्जलीकरण से बचने के लिए पर्याप्त तेजी से होना चाहिए है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है अगर हम turgor दबाव को मापने के लिए चाहते हैं. बहुत महत्वपूर्ण भी अपने सब्सट्रेट करने के लिए नमूना का एक सही निर्धारण है: एक अस्थिर नमूना एक स्थूल आंदोलन है कि आसानी से ऑप्टिकली पता लगाया जा सकता है की तरह बहुत स्पष्ट प्रभाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, या बल घटता का एक मजबूत विरूपण. वैसे भी, नमूना कंपन या झुकने का पता लगाने के लिए सूक्ष्म हो सकता है, परिणामों में कलाकृतियों को शुरू. अंत में, एक और महत्वपूर्ण कदम इंडेंटेशन पैरामीटर के चुनाव से संबंधित है। यह परिणामों की गुणवत्ता के लिए निर्धारक है.
बड़े क्षेत्रों पर यांत्रिक गुणों को मापने जब (40-50 मीटर स्कैन आकार से अधिक), ऊंचाई मतभेद उच्च हो सकता है, यह मुश्किल ठीक से सतह को ट्रैक करने के लिए और $ piezo रेंज की सीमा तक पहुँचने के बिना बल घटता साकार करने के लिए कर सकते हैं. इस समस्या को हल करने के लिए, एक CellHesion मॉड्यूल का उपयोग किया गया है। इस मॉड्यूल एक अतिरिक्त कहते हैं - piezo, नमूना चरण में स्थित है, एक 100 डिग्री मीटर रेंज है, जो बड़े क्षेत्रों के अधिग्रहण की अनुमति देता है खतरनाक रूप से आ के बिना - piezo सीमा.
विधि की पहली सीमा यह है कि हम केवल सतही कोशिका परतों को माप सकते हैं। हालांकि, हाल ही में लेखकों ऊतक वर्गों12,13,14पर AFM का इस्तेमाल किया है. हालांकि यह निश्चित सामग्री पर किया जाना चाहिए, यह गहरी सेल परतों के यांत्रिक गुणों के लिए पहुँच दे सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, आंतरिक ऊतकों के यांत्रिक गुणों का अनुमान लगाने के लिए भी गहन इंडेंटेशन किए गए हैं, हालांकि स्थानिक संकल्प15पर बड़ा बलिदान के साथ। एक दूसरी सीमा टिप नमूना करने के लिए कोई और अधिक सीधा है के बाद से एक खड़ी ढलान के साथ एक सतह समस्याग्रस्त किया जा सकता है, नमूना ज्यामिति के लिए जोड़ा जा सकता है। हम कोण है जिसके भीतर उपाय विश्वसनीय हैं और हम वर्तमान में इस घटना से जुड़े संभावित कलाकृतियों को सही करने के लिए एक एल्गोरिथ्म विकसित कर रहे हैं की सीमा को प्रतिबंधित करने की जरूरत है. इसके अलावा, कुछ ऊतकों को ट्राइकोम्स के साथ कवर किया जाता है जो माप को ब्लॉक कर सकते हैं। अंत में, इंडेंटेशन कोशिका की सतह के बारे में एक सीधा दिशा में यांत्रिक गुणों को मापता है और हम आश्चर्य कर सकते हैं कि क्या इसे विकास क्षमता से जुड़े सेल वॉल एक्स्टेंसिबिलिटी से आसानी से जोड़ा जा सकता है। कई अध्ययनों से पता चलता है कि यह मामला15,16है .
यह यहाँ AFM द्वारा बलों की माप /अनुप्रयोग के बारे में एक अधिक सामान्य अवलोकन करने लायक है. प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में, बलों के लिए photodiode पर लेजर विस्थापन को बदलने में सक्षम होने के लिए, एक अंशांकन किया जाना है. इस अंशांकन एक पैरामीटर में, विक्षेप संवेदनशीलता, लेजर विस्थापन वास्तविक cantilver विक्षेप करने के लिए परिवर्तित करने के लिए अनुमति देता है (आम तौर पर एनएम में मापा), तो इस कारक photodiode उत्पादन voltages calibrates (लम्बवत अक्षों के साथ) में एनएम. दूसरा कारक वसंत स्थिरांक K है, जिसे छधम में मापा जाता है, जो बल इकाइयों (आमतौर पर एन एन) में ऊर्ध्वाधर कैन्टीलवर विक्षेपों को परिवर्तित करता है, क्योंकि लचीली कैन्टीलवर्स स्प्रिंग्स की तरह व्यवहार करते हैं। प्रक्रिया सरल प्रकट होता है, भले ही AFM बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के लिए कश्मीर की एक मजबूत और reproduible अंशांकन अभी भी एक मुद्दा है, प्रक्रिया के विभिन्न चरणों को प्रभावित कर सकते हैं जो विभिन्न त्रुटि स्रोतों के कारण. उदाहरण के लिए, विक्षेप संवेदनशीलता का माप एक कठोर सतह पर एक बल वक्र को साकार करने, गलत मूल्यों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं अगर टिप सतह पर फिसल जाता है, या यदि सतह पूरी तरह से साफ नहीं है या भी अगर सतह आवेश इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण प्रेरित. पिछले मामलों के सभी में, बल वक्र के संपर्क भाग विकृत हो जाएगा (फिर झुका या रैखिक के बजाय घुमावदार).
प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित संपर्क कार्यविधि केवल कई मौजूदा अंशांकन कार्यविधियों में से एक है. वहाँ कम से कम 2 और तरीकों है कि एक अपेक्षाकृत आसान और सस्ती तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है: Sader विधि (भी गैर संपर्क कहा जाता है जब कुछ AFM सॉफ्टवेयर में लागू) या संदर्भ cantilver विधि. Sader विधि17 मूल रूप से वी के आकार cantilevers के लिए जॉन सदर द्वारा विकसित किया गया है और फिर आयताकार लोगों के लिए18 और एक कठोर सब्सट्रेट पर एक बल वक्र के अधिग्रहण की जरूरत नहीं है. इसके बजाय, उपयोगकर्ता को निर्दिष्ट करने की जरूरत है (संपर्क विधि के रूप में तापमान से बाहर), cantilver की लंबाई और चौड़ाई और घनत्व और तरल पदार्थ की चिपचिपापन जहां cantilver है (आम तौर पर हवा, पानी या एक पानी की तरह तरल पदार्थ). फिर एक थर्मल स्पेक्ट्रम का अधिग्रहण किया है और दोनों विक्षेप संवेदनशीलता और वसंत स्थिरांक मापा जाता है. इस विधि बहुत तेज या functionalized सुझाव है कि एक कड़ी सब्सट्रेट पर एक बल वक्र कर क्षतिग्रस्त हो सकता है का उपयोग करते समय फायदेमंद है.
पिछले दोनों तरीके एक तापीय रूप से उत्तेजित कैन्टीलवर के दोलन स्पेक्ट्रम के अधिग्रहण से संबंधित हैं। जब कमरे के तापमान पर कठोर कैन्टीलवर्स का उपयोग किया जाता है, तो मतलब दोलन आयाम 0.1 एनएम से कम हो सकता है, जिससे अनुनाद शिखर छोटा और अधिक मुश्किल हो सकता है। वैसे भी, कम से कम दोनों इस कागज में इस्तेमाल उपकरणों के लिए, अनुनाद शिखर वास्तव में हवा में और पानी में पता लगाया जा सकता है और वसंत निरंतर को मापने के लिए फिट (विचार है कि जब माप तरल में किया जाता है, अनुनाद आवृत्ति कम की ओर बदलाव मूल्यों और शिखर चौड़ी).
एक तीसरी विधि एक थर्मल धुन का उपयोग नहीं करता है, लेकिन इसके बजाय एक संदर्भ cantilver या एक संदर्भ लोचदार संरचना, एक ज्ञात वसंत निरंतर के साथ (आम तौर पर चारों ओर या नीचे एक अनिश्चितता के साथ 5%), क्रम में cantilver Kनिर्धारित करने के लिए. इस मामले में विक्षेप संवेदनशीलता को मापने के लिए एक कठोर सब्सट्रेट पर पहले बल वक्र प्राप्त करने की आवश्यकता होती है (जो वक्र के आकार को प्रभावित करने वाली सभी संभव कलाकृतियों के साथ फिर से आता है)। फिर कड़ी सब्सट्रेट संदर्भ cantilver द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है (आम तौर पर एक टिप कम cantilver एक calibrated वसंत निरंतर के साथ) और एक और (या कुछ अन्य) बल वक्र किया जाता है, फिर से विक्षेप संवेदनशीलता के मूल्य रिकॉर्डिंग. कैन्टीलवर वसंत स्थिरांक तो के रूप में गणना की जाती है:
जहाँ केref संदर्भ कैन्टीलवर का वसंत स्थिरांक है, एस उस पर मापा विक्षेप संवेदनशीलता ref, एल इसकी लंबाई है और Sकड़ी कड़ी पर मापा विक्षेप संवेदनशीलता है सब्सट्रेट. [L टिप और संदर्भ cantilver के अंत के बीच ऑफसेट है और उपयोगकर्ता द्वारा किए गए संरेखण पर निर्भर करता है और अंत में - cantilver के झुकाव कोण, AFM निर्माता द्वारा निर्दिष्ट है. एक ही विधि लोचदार संरचनाओं विशेष रूप से cantilver या indenter अंशांकन के लिए डिजाइन पर इस्तेमाल किया जा सकता है. उन संरचनाओं का लाभ (जो आम तौर पर परिपत्र कर रहे हैं) यह है कि उनके केंद्र में कश्मीर स्थिर है और किसी भी ज्यामितीय पैरामीटर पर या उन पर AFM टिप की सटीक स्थिति पर निर्भर नहीं करता है, तो हटाने एल और जेडएल पिछले सूत्र से.
AFM उपयोगकर्ता को ध्यान में रखना है कि उन सभी अंशांकन विधियों विभिन्न त्रुटि स्रोतों से प्रभावित होते हैं (पहले और तीसरे में विक्षेप संवेदनशीलता निर्धारण, पहली और दूसरी और ज्यामितीय के लिए कड़ी cantilevers के मामले में थर्मल धुन का उपयोग पैरामीटर और संरेखण तीसरे के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मामले में कश्मीरref के अंशांकन सटीकता का उपयोग किया जाता है) और है कि संपर्क विधियों टिप के लिए संभावित रूप से हानिकारक हैं (विशेष रूप से तीसरे, जहां अंशांकन दो का उपयोग लगाता है अलग अलग नमूने). इसका मतलब यह है कि वसंत निरंतर हमेशा एक निश्चित परिशुद्धता के लिए निर्धारित किया जाएगा और इसलिए मापा / लागू बलों हो जाएगा (विभिन्न अंशांकन विधियों और उनकी परिशुद्धता की एक व्यापक समीक्षा के लिए सिकोरा19 देखें. इसका मतलब यह है कि युवा moduli और turgor दबाव भी cantilver अंशांकन से प्रभावित हो जाएगा. वैसे भी, अन्य और भी अधिक महत्वपूर्ण त्रुटि स्रोतों शामिल हैं जब उन मात्रा की गणना (युवा मापांक निर्धारण के लिए सरलीकृत मॉडल के उपयोग की तरह) तो यह हमेशा एक चुनौती के लिए माप के उन प्रकार के बाहर पूर्ण मूल्यों को प्राप्त होगा. क्या महत्वपूर्ण है कि परिमाण के सही क्रम के हैं और जो एक दूसरे के साथ सुसंगत हैं मूल्यों को प्राप्त करने के लिए है, जिसका अर्थ है कि अगर प्रयोग एक ही नमूने पर एक ही उपयोगकर्ता द्वारा दोहराया जाता है, मान संगत होना चाहिए. इसे प्राप्त करने के लिए, अंशांकन सावधानी से किया जाना चाहिए, और त्रुटि स्रोतों को कम से कम किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए संभवतः ध्वनिक शोर /कंपन के रूप में ज्यादा सीमित करने के लिए)। एक संभव रणनीति बार-बार अंशांकन के सामंजस्य को बढ़ाने के लिए ध्यान केंद्रित हाल ही में Schillers एट अल द्वारा एक कागज में प्रस्तावित किया गया है20,जहां 11 यूरोपीय प्रयोगशालाओं के सहयोग के लिए धन्यवाद, एक प्रोटोकॉल (SNAP कहा जाता है) में त्रुटियों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए विक्षेप संवेदनशीलता निर्धारण विकसित किया गया है. इस कागज में लेखकों को उनके माप के लिए सीधे calibrated cantilevers का उपयोग करें, वैसे भी एक ही प्रोटोकॉल गैर कैलिब्रेटेड cantilevers के लिए लागू किया जा सकता है, बस उन्हें पसंद की विधि के साथ पहली बार कैलिब्रेट करने और फिर पहले वसंत पर विचार संदर्भ ("कैलिब्रेट ेड") मान के रूप में स्थिर.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम उनके तकनीकी सहायता के लिए PLATIM टीम को धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही साथ Arezki Boudaoud और सहायक विचार विमर्श के लिए आरडीपी प्रयोगशाला में Biophysic टीम के सदस्यों.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth medium | |||
| 1,000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| Agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| Agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2 mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| Oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| Plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| Sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
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