Summary
Aquí, presentamos la microscopía de fuerza atómica (AFM), operada como una herramienta de nano- y micro-indentación en células y tejidos. El instrumento permite la adquisición simultánea de la topografía de superficie 3D de la muestra y sus propiedades mecánicas, incluyendo el módulo de Young de la pared celular, así como la presión del turgencia.
Abstract
Aquí presentamos el uso de la microscopía de fuerza atómica para destetar los tejidos vegetales y recuperar sus propiedades mecánicas. Usando dos microscopios diferentes en modo de sangría, mostramos cómo medir un módulo elástico y usarlo para evaluar las propiedades mecánicas de la pared celular. Además, también explicamos cómo evaluar la presión del turgor. Las principales ventajas de la microscopía de fuerza atómica son que no es invasiva, relativamente rápida (5-20 min), y que prácticamente cualquier tipo de tejido vegetal vivo que es superficialmente plano se puede analizar sin necesidad de tratamiento. La resolución puede ser muy buena, dependiendo del tamaño de la punta y del número de medidas por unidad de área. Una limitación de este método es que sólo da acceso directo a la capa de celda superficial.
Introduction
La microscopía de fuerza atómica (AFM) pertenece a la familia de microscopía de sonda de exploración (SPM), donde una punta con un radio de unos pocos nanómetros escanea la superficie de una muestra. La detección de una superficie no se logra a través de métodos ópticos o basados en electrones, sino a través de las fuerzas de interacción entre la punta y la superficie de la muestra. Por lo tanto, esta técnica no se limita a la caracterización topográfica de una superficie de muestra (resolución 3D que puede bajar a unos pocos nanómetros), sino que también permite la medición de cualquier tipo de fuerzas de interacción como electrostática, van der Waals o fuerzas de contacto. Además, la punta se puede utilizar para aplicar fuerzas en la superficie de una muestra biológica y medir la deformación resultante, la llamada "indentación", con el fin de determinar sus propiedades mecánicas (por ejemplo, módulo de Young, propiedades viscoelásticas).
Las propiedades mecánicas de las paredes celulares de la planta son esenciales a tener en cuenta a la hora de tratar de comprender los mecanismos subyacentes a los procesos de desarrollo1,2,3. De hecho, estas propiedades se controlan estrechamente durante el desarrollo, en particular porque se requiere un ablandamiento de la pared celular para permitir que las células crezcan. AFM se puede utilizar para medir estas propiedades y estudiar la forma en que cambian entre órganos, tejidos o etapas del desarrollo.
En este artículo, describimos cómo usamos AFM para medir las propiedades mecánicas de la pared celular y la presión del turgencia. Estas dos aplicaciones se demuestran en dos microscopios AFM diferentes y se detallan aquí después.
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Protocol
1.Medida de las propiedades mecánicas de la pared celular
NOTA: Ejemplo del desarrollo de gineceo de Arabidopsis se presenta.
- Preparación de las muestras biológicas
- Recoger un brote de flores cerrado en la etapa 9 a 10 (aproximadamente 0,5 mm de largo) según la determinación de etapas publicadas para Arabidopsis4. Bajo un binocular, utilizando pinzas finas, abrir cuidadosamente el cogollo para comprobar la etapa de desarrollo y recoger el gineceo situado en el centro de la flor.
- Coloque el gineceo en cinta adhesiva de doble cara colocada en el centro de la cubierta de una pequeña placa Petri (diámetro de 5 cm).
NOTA: Como alternativa, el pegamento biocompatible también se puede utilizar para una inmovilización más eficiente de la muestra tras la sangría. - Agregue agua rápidamente hasta que la muestra esté completamente cubierta. Esto evita la deshidratación y reduce la adhesión de la punta a la muestra. Alternativamente, sumerja la muestra en medio líquido, como el cultivo de ápice de Arabidopsis medio5.
- Calibración AFM
- Ajuste la constante de resorte en voladizo k lo suficientemente alta como para permitir la deformación de la superficie de la muestra hasta la sangría deseada, pero no demasiado alta para evitar la pérdida de sensibilidad.
NOTA: Como regla general aproximada, si se conoce el módulo de Young de la muestra, el orden de magnitud de la constante de resorte se puede elegir como káE * ,donde es la sangría deseada. - Utilice una punta de extremo esférico de R a 400 nm con una distancia de 15 m de punta-voladizo.
NOTA: El radio de la punta está directamente relacionado con la resolución lateral. Generalmente, para la sangría de materiales biológicos, elija puntas redondeadas (R superiores a 10-20 nm) o sondas coloidales. Las sondas coloidales pequeñas pueden ser difíciles de usar debido a la pequeña distancia entre el extremo de la punta y el voladizo que puede tocar la superficie de la muestra. - Encienda el software y coloque la cabeza horizontalmente al menos 2-3 h antes del experimento: esto permitirá que la cabeza se termiqueye y evitará movimientos relativos en voladizo-láser inducidos térmicamente. Si el microscopio está equipado con un módulo CellHesion (ampliando el rango piezoeléctrico Z disponible a 100 m en lugar de 15 m), encienda primero su controlador y luego seleccione el modo CellHesion al iniciar el software.
- Monte el voladizo en el bloque de vidrio y monte el bloque en la cabeza. Coloque una gota de unos pocos microlitros de agua ultrapura en la punta para evitar la formación de burbujas de aire cuando la punta se sumerge en agua.
- Coloque una muestra dura (tobogán de vidrio limpio o zafiro) y agregue 30-50 l de agua ultrapura.
NOTA: El procedimiento de calibración descrito aquí es la calibración de contacto a veces llamada. En primer lugar, se hace una curva de fuerza en una superficie rígida y plana y luego se registra el espectro de oscilación del voladizo excitado térmicamente con el fin de calcular la constante de resorte. Existen otros protocolos de calibración que se describirán brevemente en el párrafo de discusión. - Coloque la cabeza en el escenario (tenga cuidado de levantar los motores Z lo suficientemente alto). Utilice la imagen óptica para colocar aproximadamente el láser en el voladizo.
- Mueva el láser a lo largo del eje principal del voladizo monitoreando la señal de suma en el fotodiodo.
NOTA: Cuando se utilizan voladizos estándar, se debe obtener una suma superior a 0,5 V. - Mueva el láser a lo largo de la otra dirección y maximice la señal de suma para colocar el láser en el centro del voladizo. Esto minimizará la conversación cruzada entre la desviación lateral y vertical.
- Mueva el láser a lo largo del eje principal del voladizo monitoreando la señal de suma en el fotodiodo.
- Medición de la sensibilidad a la desviación
NOTA: El fotodiodo lee el desplazamiento láser y proporciona una señal en voltios. Para poder medir la desviación en la unidad métrica, se debe medir la sensibilidad a la desviación.- Fije el instrumento en Contacto > Forzar espectroscopia. Establezca un punto de consigna relativo en 2 V, la longitud Z en 0,5 m y la velocidad de extensión a 2 m/s (velocidad de muestreo a 10000 Hz) y seleccione Z Bucle cerrado.
- Abra el gestor de calibración y seleccione la parte de contacto de la curva de fuerza (que debe ser lineal) para realizar un ajuste lineal: la inversa de la pendiente da la sensibilidad de desviación. La lectura del fotodiodo ahora está calibrada en unidad métrica.
-
Determinación de la constante de resorte. En Gestor de calibración, seleccione Constante de resorte para ejecutar una adquisición de espectro térmico. Para promediar la señal durante más tiempo, seleccione el símbolo . El espectro de potencia del voladizo excitado térmicamente puede mostrar varios picos; dibujar una selección alrededor de la colocada a la frecuencia más baja para ajustarla.
NOTA: Si la melodía térmica se realiza en líquido, el pico de resonancia será más amplio y su frecuencia baja en comparación con la nominal.
- Ajuste la constante de resorte en voladizo k lo suficientemente alta como para permitir la deformación de la superficie de la muestra hasta la sangría deseada, pero no demasiado alta para evitar la pérdida de sensibilidad.
- Forzar configuración y adquisición de experimentos de espectroscopia
- Coloque la muestra en la etapa AFM y coloque la cabeza sobre la muestra.
NOTA: Asegúrese de que la cabeza se ha retraído lo suficiente como para evitar un contacto duro entre la punta y la superficie de la muestra. - Deje que el voladizo se termiqueta durante unos minutos.
- En el modo QI, acérquese con una fuerza de consigna de 50 nN.
- Establezca una longitud Z de 4 m y un área de escaneado en 80 x 80 m2 con un número de píxeles de 40 x 40. En el panel Configuración avanzada de imágenes, establezca el modo en velocidad constante. Ajuste la velocidad de extensión y retracción a 200 m/s y las frecuencias de muestreo a 25 kHz.
- Comience a escanear y utilice este escaneo rápido de baja fuerza para comprobar si la muestra se mueve. Compruebe que el área escaneada esté libre de escombros o celdas desviadas y localice una región de interés lo más plana posible para realizar las mediciones.
NOTA: Para apreciar la inclinación real de la muestra, la nivelación de línea debe establecerse en OFF o en Constant. Un ángulo de inclinación excesivo entre el eje de sangría y la superficie tendrá un efecto en el módulo medido de Young5. - Una vez que se haya localizado un área de interés, seleccione una región de 40 x 40 a 60 x 60 ám2 a su alrededor y aumente el número de píxeles para alcanzar 2 píxeles/ m. Aumente el punto de consigna a 500 nm para obtener 100-200 nm de sangría. Ajuste este valor, si es necesario, al principio del experimento. Disminuya la longitud de la Z a 2 m. Disminuya la velocidad de extensión y retracción a 100 m/s y aumente la frecuencia de muestreo a 50 kHz.
- Comience a escanear y guarde la salida (generalmente compuesta por una imagen y un archivo de datos).
- Al final del día de medición, retire el soporte de la punta y enjuáguelo suavemente con agua ultrapura y 70% EtOH.
- Seque y retire el voladizo. Para más experimentos con la misma punta, considere limpiarlo con un protocolo de limpieza en húmedo y, si es posible, un tratamiento de plasma O2 de seguimiento. No deje que el agua se seque en el voladizo y/o el soporte de la punta para evitar la cristalización de la sal.
- Coloque la muestra en la etapa AFM y coloque la cabeza sobre la muestra.
- Análisis de datos (para la versión de software de procesamiento de datos 6.x)
- Abra el software de procesamiento de datos y cargue el archivo de datos.
- Haga clic en En el botón Usar este mapa para el procesamiento por lotes para utilizar los mismos parámetros de análisis en todas las curvas del mapa.
- En Cargar proceso predefinido, seleccione Ajuste hertzos.
- Utilice la primera pestaña para verificar o cambiar los parámetros de calibración.
- En la segunda pestaña, elimine un desfase (o un desfase más una inclinación) de la línea base para establecer su valor medio en 0.
- En la tercera pestaña, calcule la posición del punto de contacto (POC) considerándola como el primer punto que cruza la fuerza 0 al bajar del valor de consigna a lo largo de la curva de extensión.
- La pestaña Posición vertical de la punta calcula el movimiento de la punta restando la desviación del voladizo de Altura medida. En este paso, utilice Altura sin suavizar (datos brutos) para el siguiente ajuste, marcando la casilla correspondiente.
- En la pestaña Ajuste de elasticidad, seleccione el modelo de ajuste adecuado. Si no se observa ninguna adherencia o una adhesión débil en curvas de retracción (correspondiente a menos del 10% de la fuerza de consigna o a la fuerza media máxima en la profundidad de sangría seleccionada), el tipo de modelo debe establecerse en Hertz/Sneddon y se debe utilizar la curva de extensión. En caso de adherencia más fuerte, el modelo DMT, que representa el modelo Derjaguin-Muller-Toporov, debe ser preferido y el ajuste debe realizarse en curvas retráctiles (consulte el manual para obtener más información sobre los modelos de contacto disponibles y las fórmulas relacionadas).
- Establezca los parámetros geométricos de la punta en función de la forma nominal de la punta. Aquí, la forma de la punta es la esfera y el radio de la punta es 400 nm.
- Establezca la relación de Poisson en 0,5, ya que se realiza convencionalmente para material biológico (correspondiente al material incompresible).
-
Ajustarse a una sangríaespecífica. De forma predeterminada, el ajuste se realiza en toda la curva. Si el ajuste tiene que hacerse hasta una sangría específica, marque primero la casilla de verificación Curva de desplazamiento; esto desplazará el origen de la curva en función de los valores de línea base y POC recién determinados.
- Agregue una segunda rutina de ajuste de elasticidad haciendo clic en el icono de la ventana principal.
- Establezca de nuevo todos los parámetros de ajuste y especifique en X min la sangría deseada. Agregue tantos pasos como sea necesario (2 a 3 pasos deben ser suficientes) para refinar la determinación de la posición DE POC y, posteriormente, la profundidad de sangría calculada. El proceso se puede guardar en este punto.
- Haga clic en Mantener y aplique a todos para iterar los pasos anteriores en todas las curvas del mapa.
- Guarde los resultados. Se obtendrá una imagen y un archivo .tsv.
2. Medida de la presión de Turgor
NOTA: Se presenta un ejemplo del meristem de inflorescencia tratado con oryzalina de Arabidopsis.
- Preparación de muestras biológicas
- Recoger el meristem de inflorescencia de Arabidopsis (IM) tratado con el fármaco despolimerizante de microtúbulos orizalina a partir de plantlet in vitro cultivado en medio que contenga el inhibidor de transporte de auxina polar 1-N-ácido naphiplphthalamic (NPA) siguiendo el método publicado 6.
- Montaje de la muestra de mensajería instantánea después de una de las dos opciones
- Para el monitoreo a largo plazo: montar la muestra en un Plato Petri que contiene el medio de cultivo de ápice de Arabidopsis (ACM)7,8 y 0.1% mezcla de conservación de plantas (PPM), para evitar la contaminación. Suspenda la punta IM por encima de la superficie ACM y apoye la base de IM con una caída de 2% de agarosa.
- Para la medición con cambios rápidos en la solución: monte la muestra en un Petri-dish que sostenga un pequeño trozo de masilla adhesiva, y selle rápidamente la brecha entre la masilla y la base de la muestra con pegamento biocompatible. Espere a que el pegamento se solidifique (menos de 2 min) y luego sumerja la muestra en ACM líquido que contenga 0,1% PPM.
NOTA: Asegúrese de que la superficie de la muestra no esté recubierta con agarosa o pegamento al fijar la base de la muestra. La medición AFM de la presión del turgor requiere que la muestra se monte de forma estable, y los métodos de montaje anteriores proporcionan una estabilidad aceptable. Dependiendo de la muestra, se pueden utilizar otros métodos de montaje, como cinta de doble cara, polilisina, etc.
- Calibración AFM
- Encienda el software de adquisición AFM y elija el modo de medición PeakForce QNM (gran amplitud).
- Realice la calibración siguiendo el mismo principio descrito en los pasos 2.1 a 2.6.
- En la ventana Comprobar parámetros, establezca Tamaño de escaneado en 0. En la ventana Rampa, establezca el tamaño de rampa entre 200 nm y 500 nm, el umbral de Trig entre 2 V y 5 V y Número de muestras en 2048 o superior.
- Alinee la punta del voladizo con la muestra de calibración y haga clic en Enfoque.
- Al entrar en contacto, vaya a la ventana Rampa y haga clic en el botón Rampa continua. En el régimen lineal de la curva, determine la pendiente haciendo clic en el botón Actualizar sensibilidad. Repita la medición de sensibilidad de desviación varias veces y actualice manualmente la calibración con el promedio de medición abriendo el detector de pestañas desde el menú Calibración.
- Retirar el cabezal AFM y retirar la muestra de calibración.
NOTA: Se sugiere retraer completamente la cabeza de AFM eligiendo la pestaña Etapa - Inicializar para evitar el contacto duro accidental tras el cambio de muestra.
- Forzar configuración y adquisición de experimentos de espectroscopia
- Si la muestra aún no está sumergida, sumerjala con ACM líquido que contenga PPM.
- En el software de adquisición, especifique los parámetros de medición de la siguiente manera:
- En la ventana Comprobar parámetro, establezca constante de resorte en la constante de muelle fabricada del voladizo o en la constante de muelle determinada como en el paso 2.8. En este ejemplo, se fija en 42 N/m.
- Fije el radio de la punta a 400 nm en este ejemplo.
- Establezca la relación de Muestra Poisson en 0,5, ya que el agua contribuye principalmente a la presión del turgencia.
- Establezca Muestra/Línea en 128 para garantizar una rápida adquisición.
- Establezca la velocidad de escaneo en 0,2 Hz.
- Establezca el tamaño de Escaneado en 1 m.
NOTA: Establecer la velocidad de escaneo y el tamaño de escaneado pequeño puede prevenir eficazmente el daño de la muestra desencadenada por aFM. Se recomienda reducir estos dos parámetros en cualquier cambio de muestra. - En la ventana Rampa, establezca el tamaño de la rampa en 5 m.
NOTA: Es mejor establecer el tamaño de rampa más grande que la profundidad de sangría prevista para una mejor adquisición de línea base. - Establezca el umbral de trig en el máximo.
- Establezca Número de muestras en 4608.
- Opcionalmente, en la pestaña Microscopio - Parámetros de interacción, reduzca los siguientes parámetros para evitar daños fuertes en la muestra inducidos por el contacto. Establezca El punto de consigna de activación de fuerza máxima en 0,3 V (predeterminado 0,5 V). Establezca Engage int. gain en 0.5 (predeterminado 0.75). Establezca el paso de activación de SPM en 4 m (predeterminado de 15 m).
- Coloque y alinee la muestra debajo de la cabeza de AFM y acérquese hasta que el voladizo esté sumergido pero no en contacto con la superficie de la muestra.
NOTA: Mientras se acerca, sople ligeramente sobre la superficie del ACM líquido hasta que se forme un puente líquido entre el voladizo y la superficie líquida. Esto generalmente evita el contacto duro. - Con cuidado, acérquese manualmente hacia la muestra. Cuando el sondeo esté relativamente cerca de la superficie de muestra, haga clic en Enfoque.
- Al contacto, aumente gradualmente el tamaño del escaneo y/o la velocidad de escaneo hasta un equilibrio deseado sin dañar la muestra y/o el voladizo.
NOTA: El tamaño de escaneado está limitado por la curvatura de la superficie y la rugosidad de la muestra. En el caso de IM tratadacon oryzalin, se puede lograr un área de escaneo de 50 x 50 m2 con una velocidad de escaneo de 0,3 Hz. - Durante el escaneo, determine si la región de medición es la deseada. Reubique si es necesario. Cuando esté satisfecho, haga clic en el botón Apuntar y disparar para iniciar la ventana de apuntar y disparar.
- Antes de grabar el escaneo, elija un canal de imagen adecuado que pueda facilitar una identificación clara de los contornos de celda. A menudo, Error de fuerza pico, Módulo DMT, Módulo LogDMT o Disipación es adecuado. Especifique guardar directorio y nombre de archivo. A continuación, haga clic en Rampa en el siguiente análisis para iniciar la grabación.
NOTA: Una cadena de un punto y tres números se agregarán automáticamente después de su nombre de archivo designado (como .000). Este número aumenta automáticamente en 1 al realizar cada repetición de escaneo guardada. - Cuando se complete el análisis, la interfaz del software se redirigirá automáticamente a la ventana de rampa. Haga clic en la imagen escaneada para especificar las posiciones que desea aplicar sangría.
NOTA: Antes de registrar las sangrías, es mejor elegir varios puntos de referencia para realizar sangrías de prueba haciendo clic solamenteen rampa, en caso de que se requiera la alternancia de parámetros (para el tamaño de la rampa, la posiciónpiezoeléctrica, etc.). La profundidad de la sangría debe ser mayor que el espesor de la pared celular (idealmente determinado por separado por microscopía electrónica de transmisión). - Elija al menos tres sitios de sangría por celda cerca de su centro de bary y repita la sangría tres veces por sitio. Esto produciría al menos nueve curvas de fuerza por celda para su posterior análisis. Cuando esté satisfecho con la ubicación del sitio de sangría, haga clic en Rampa y captura. Las curvas de sangría de fuerza se guardan automáticamente en el directorio designado.
- Cuando se completen las rampas, reubique en una posición diferente para la medición de baldosas, o retraiga el cabezal de escaneado y cambie la muestra.
- Cuando haya terminado, limpie el voladizo como en los pasos 1.3.8 y 1.3.9.
- Análisis de datos
- En el software de análisis, abra el archivo *.mca. Esto muestra la posición de cada curva de fuerza en la imagen escaneada. Si lo desea, preseleccione curvas de fuerza para el análisis.
- Abra una curva de fuerza que se analizará, normalmente en el formato x0000y.00z, donde x es el nombre de archivo especificado en el directorio de guardado, mientras que y y z se registran automáticamente números que denotan la secuencia de sangría y el número de exploración.
- Haga clic en el botón Corrección de línea base y arrastre las líneas de guión azul en la curva de fuerza hasta que Extender inicio de línea base de origen y Extender detención de línea base de origen estén en 0% y 80%, respectivamente. Haga clic en Ejecutar.
NOTA: Como alternativa, Extend Source Baseline Stop se puede establecer en valores diferentes, siempre y cuando todavía esté dentro de la línea base y no más allá del punto de contacto. - Haga clic en el botón Filtro de Boxcar y haga clic en Ejecutar para suavizar la curva de fuerza.
- Haga clic en el botón Sangría.
- En la ventana Entrada, establezca la Curva activa en Extender.
- Establezca el Método de ajuste en Modelo linealizado e Incluya fuerza de adhesión en Sí.
- Establece Límite de Ajuste de Fuerza Máxima en 99% y Límite de Ajuste de Fuerza Mínima en 75%.
- Establezca Ajustar modelo en Rigidez (Lineal).
NOTA: Esta configuración calculará la rigidez aparente k para la deducción de la presión del turgor. En este ejemplo, los límites de ajuste reflejan un ajuste de rigidez de alrededor de 1,5 m de profundidad de sangría.
- Las curvas de fuerza se pueden analizar por lotes. Haga clic en el botón Ejecutar historial, especifique el directorio de informes y agregue todas las demás curvas de fuerza que requieran el mismo tratamiento. Cuando esté satisfecho, haga clic en Ejecutar. De forma predeterminada, el ajuste se almacenará como un archivo *.txt.
- Cuando k está ajustado por lotes, haga clic en Historial 5 Sangría para volver a la ventana de sangría.
- Cambia Límite de Ajuste de Fuerza Máxima a 10% y Límite de Ajuste de Fuerza Mínima a 0%.
- Establezca Ajustar modelo en Hertziano (esférico).
NOTA: Esto calculará la pared celular Módulo E de Young para la deducción de presión de turgor. En este ejemplo, los límites de ajuste reflejan un ajuste hertziano (mediante sonda esférica) de alrededor de 0,4 m de profundidad de sangría.
- Repita el paso 2.4.6 para el ajuste por lotes para E.
- Abra el archivo *.00z (z es el número de escaneo registrado automáticamente) para mostrar los diferentes canales de escaneado. En la ventana Canal de altura, haga clic en el botón Sección. Esto permitirá la medición de la curvatura de la superficie de la muestra que se requiere para la deducción de la presión del turgencia.
- Dibuje una línea a través del eje largo de una celda, mueva los límites de la línea de guión a los bordes de la celda y registre el valor de Radio r1. Repita esto para que el eje corto recupere el radio r2. Calcular la curvatura media de la superficie de la celda:M y curvatura gaussiana ,G, utilizando la medición de dos radios de la siguiente manera:
Y
- Dibuje una línea a través del eje largo de una celda, mueva los límites de la línea de guión a los bordes de la celda y registre el valor de Radio r1. Repita esto para que el eje corto recupere el radio r2. Calcular la curvatura media de la superficie de la celda:M y curvatura gaussiana ,G, utilizando la medición de dos radios de la siguiente manera:
- Deducir la presión de turgencia P utilizando el modelo de carcasa delgada publicado9 de la siguiente manera:
Con
donde t es el espesor de la pared celular determinado por, por ejemplo, microscopía electrónica.
NOTA: La deducción de la presión del turgencia es un proceso de ajuste, donde se requieren iteraciones. Por lo general, cuatro iteraciones son capaces de reproducir productos estables, sin embargo, se pueden hacer más iteraciones (por ejemplo, 100 veces). - Calcular la media E, k y P por celda. Además, registre la variabilidad intracelular (por ejemplo, desviación estándar) para la documentación.
Y
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Representative Results
La Figura 1A y la Figura 1B muestran una captura de pantalla que ilustra el resultado de los pasos 1.3.4 a 1.3.6 del protocolo, utilizado para localizar una región de interés donde adquirir el mapa QI. Vale la pena mencionar que la región de interés ha sido elegida para no estar sobre una superficie inclinada (es decir, lo más plana posible). En realidad, como se notó en Routier et al.5, si el eje de sangría no es perpendicular a la superficie, el módulo de Young medido puede ser subestimado. Este efecto es visible en la esquina superior derecha de los paneles C o D de la Figura1, donde parte del borde de las celdas se ve más suave que el resto de la celda. Los artefactos inducidos por este efecto serán mucho más fuertes en el caso de los meristems, donde el ángulo de inclinación local puede superar fácilmente 40 o más de 50 x 50 ám2 áreas de exploración. En nuestro laboratorio, actualmente estamos desarrollando un algoritmo, basado en el enfoque descrito por Routier et al.5, para corregir esos artefactos (papel en preparación). La Figura 1C y la Figura 1D muestran los mapas de módulos de Young obtenidos después del análisis detallado en el cuarto párrafo del protocolo. En particular, el panel C representa el módulo de Young obtenido analizando toda la sangría, hasta el punto de consigna de fuerza definido por el usuario, mientras que el panel D muestra el resultado del análisis de los primeros 100 nm de sangría (como se describe en el paso 1.4.9). Aquí, los 2 mapas parecen muy similares, porque durante la configuración del experimento, el punto de consigna se ha elegido para obtener las sangrías medias alrededor de 100 nm. La variación de la sangría analizada a veces puede conducir a una mejor característica de las heterogeneidades de la muestra, que pueden ser útiles para identificar la ubicación o para proporcionar información sobre el comportamiento de las estructuras internas (por ejemplo, Costa et al.10)
La curva de fuerza en la Figura 2 muestra dos efectos que vale la pena mencionar. En primer lugar, se puede notar que si la parte de aproximación de la curva de fuerza termina realmente en la fuerza de consigna de 500 nN, el movimiento de la punta hacia abajo continúa, lo que significa que la fuerza final aplicada por la punta es mayor de lo esperado (aquí 1.000 nN). Esto se debe al hecho de que la supervisión del bucle de retroalimentación de la desviación del voladizo no actúa instantáneamente, por lo que su tiempo de reacción finito introduce un desajuste entre la detección del umbral de desviación y la parada del movimiento piezoeléctrico. Además, especialmente cuando se utiliza CellHesion que mueve el soporte de la muestra, entra en juego la inercia de las partes móviles, haciendo que este tiempo se retrase más tiempo. Este problema puede limitarse mediante el uso del piezo de cabeza, en cuyo caso el usuario debe tener mucho cuidado en el caso de las mediciones en muestras muy ásperas o inclinadas, o mediante la reducción de la velocidad de rampa, que de todos modos limita la resolución y / o el número de muestras escaneadas ( además, para mapas demasiado lentos, el crecimiento de la muestra puede convertirse en un problema). Generalmente, si las curvas de fuerza están lo suficientemente lejos unas de otras (basadas en el modelo de sangría de elección, el radio del área con sangría se puede calcular dada la profundidad de sangría y se utiliza como distancia de separación mínima), las mediciones realizadas en diferentes las posiciones a lo largo de la muestra no deben correlacionarse y si el análisis se realiza en la curva de aproximación, la superación del umbral de fuerza no debe ser un problema. De todos modos, si la muestra es delicada o si se realizan exploraciones repetidas en la misma área, el científico puede tratar de minimizar este exceso. Desafortunadamente, no hay una regla general para determinar la cantidad de este rebasamiento, ya que depende del piezo utilizado, de las velocidades de rampa, sino también de las propiedades del material: cuanto más rígido sea el material, más rápida será la variación de la señal de desviación en el tiempo y , dado un tiempo de respuesta de retroalimentación finito, mayor será el rebasamiento.
La segunda cosa a notar es el agitamiento en la curva de retracción resaltado por la elipse. Tal agitación puede ser un indicador de la muestra moviéndose / vibrando bajo la acción de la punta. En este caso, el usuario puede intentar cambiar el área escaneada (a veces otra parte del microscopio, pero la punta puede tocar la muestra, o la muestra puede estar insuficientemente bien fijada a su soporte) o la muestra si varios de ellos se han preparado en el mismo soporte. Si la característica siempre está ahí, es mejor cambiar el método de fijación, en este caso cambiar de la fijación de cinta de doble cara a pegamentos biocompatibles.
La Figura 3 muestra la determinación de los parámetros clave para la deducción de la presión del turgencia. Todos los parámetros, excepto el espesor de la pared celular11, que fue determinado por separado por microscopía electrónica a 740 nm, se pueden recuperar de los escaneos y hendiduras AFM. Siguiendo el proceso de ajuste en el paso 2.4.10, la presión del turgencia se deduce a ser 1.50 MPa para esta curva de fuerza. Al agrupar las dieciocho curvas de fuerza en esta celda, se producen valores medios de E a 6,77 a 1,02 MPa, k a 14,18 a 2,45 N/m y a 1,45 a 0,29 MPa (media de desviación estándar).
Figura 1 : Mapas topográficos (Altura medida) normalmente adquiridos durante un experimento. (A) Se registra un primer mapa de baja resolución/fuerza baja para encontrar una región adecuada para escanear. (B) Se adquiere un mapa de alta resolución/fuerza superior más pequeño para el cálculo del módulo de Young (en el área resaltada por el cuadrado de puntos negro). (C) Mapas de módulos de Young calculados a partir del mapa B, como se detalla en el paso 1.4. Aquí, el mapa del módulo del Joven se ha obtenido analizando toda la sangría en cada curva de fuerza. (D) El mapa del módulo de Young obtenido analizando sólo los primeros 100 nm de sangría. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Ejemplo de curva de fuerza. En azul el enfoque, en rojo el segmento de retracto. La fuerza máxima (situada en la curva de retracción) es diferente del punto de consigna de fuerza debido al tiempo de reacción del bucle de realimentación finito y a la inercia. El agitamiento en la curva de retracción puede ser representativo de una deficiencia en la fijación de la muestra a su soporte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Mediciones de AFM para la deducción de presión de turgor. (A) el mapa del módulo DMT muestra el contorno de celda claro para supervisar el posicionamiento de los sitios de sangría profunda cerca del baricentro de celdas. Los sitios de sangría están marcados por cruces. (B) Forzar la curva de sangría profunda en la posición de cruz roja en A. Pared celular El módulo E de Young (verde) y la rigidez aparente de la muestra k (rojo) se ajustan en diferentes regímenes de la curva como se detalla en el paso 2.4. R 2 denota el coeficiente de determinación de los ajustes. (C) Mapa de altura con ejes largos y cortos determinados manualmente de a, representados por líneas blancas, de la misma celda analizada en los paneles A y B. (D) Perfil de altura de los ejes largos y cortos de la celda en el Panel C (azul, rojo eje largo, eje corto) y el fitte d radios de curvatura (r1 y r2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La aparición de formas en las plantas está determinada principalmente por la tasa coordinada y la dirección del crecimiento durante el tiempo y el espacio. Las células vegetales están encerradas en una pared rígida de células hecha de una matriz polisacárdica, que las pega. Como resultado, la expansión celular se controla mediante el equilibrio entre la presión del turgencia tirando de la pared celular, y la rigidez de la pared celular resistiéndose a esta presión. Con el fin de entender los mecanismos subyacentes al desarrollo, es importante ser capaz de medir tanto las propiedades mecánicas de la pared celular, así como la presión del cúspide en diferentes tejidos o células de un órgano dado. Como se demuestra en este documento, AFM es el método de elección en este contexto.
Hay varios pasos críticos en el protocolo. La primera es la preparación del tejido que debe ser lo suficientemente rápida como para evitar la deshidratación. Esto puede ser crítico en particular si queremos medir la presión del turgor. Muy importante es también una fijación correcta de la muestra a su sustrato: una muestra inestable puede conducir a efectos muy obvios como un movimiento macroscópico que se puede detectar fácilmente ópticamente, o una fuerte deformación de las curvas de fuerza. De todos modos, la vibración o flexión de la muestra puede ser sutil de detectar, introduciendo artefactos en los resultados. Por último, otro paso crítico se refiere a la elección de los parámetros de sangría. Esto es determinante para la calidad de los resultados.
Al medir las propiedades mecánicas en áreas grandes (más de 40-50 m tamaños de escaneado), las diferencias de altura pueden ser altas, lo que dificulta el seguimiento adecuado de la superficie y la realización de curvas de fuerza sin alcanzar los límites del rango piezoeléctrico Z. Para superar este problema, se ha utilizado un módulo CellHesion. Este módulo añade un piezo Z adicional, situado en la etapa de la muestra, que tiene un rango de 100 m, que permite la adquisición de grandes áreas sin acercarse peligrosamente a los límites piezoicos Z.
La primera limitación del método es que sólo podemos medir capas de celda superficiales. Sin embargo, recientemente los autores han utilizado AFM en las secciones de tejido12,13,14. Aunque esto debe hacerse en material fijo, puede dar acceso a las propiedades mecánicas de las capas de células profundas. Alternativamente, también se han realizado hendiduras más profundas para inferir las propiedades mecánicas de los tejidos internos en muestras vivas, aunque con mayor sacrificio en la resolución espacial15. Una segunda limitación se puede vincular a la geometría de la muestra, ya que una superficie con una pendiente pronunciada puede ser problemática ya que la punta ya no es perpendicular a la muestra. Tenemos que restringir la gama de ángulos dentro de los cuales las medidas son fiables y actualmente estamos desarrollando un algoritmo para corregir artefactos potenciales vinculados a este fenómeno. Además, algunos tejidos están cubiertos de tricomas que pueden bloquear las mediciones. Por último, la sangría mide las propiedades mecánicas en una dirección perpendicular con respecto a la superficie celular y podemos preguntarnos si esto se puede vincular fácilmente a la extensibilidad de la pared celular asociada a la capacidad de crecimiento. Varios estudios sugieren que es el caso15,16.
Vale la pena hacer aquí una observación más general sobre la medición/aplicación de fuerzas por Parte de AFM. Como se describe en la sección de protocolo, para poder transformar los desplazamientos láser en el fotodiodo en fuerzas, se debe realizar una calibración. En esta calibración un parámetro, la sensibilidad de desviación, permite convertir los desplazamientos láser a la desviación en voladizo real (generalmente medida en nm), por lo que este factor calibra los voltajes de salida de fotodiodo (a lo largo de los ejes verticales) a los desplazamientos en Nm. El segundo factor es la constante de resorte K, medida en N/m, que convierte las desviaciones verticales del voladizo en unidades de fuerza (generalmente nN), ya que los voladizos flexibles se comportan como muelles. Incluso si el procedimiento parece simple, una calibración robusta y reproducible de K para las mediciones de espectroscopia de fuerza AFM sigue siendo un problema, debido a diferentes fuentes de error que pueden afectar a los diferentes pasos del procedimiento. Por ejemplo, la medición de la sensibilidad de desviación realizando una curva de fuerza en una superficie rígida, puede conducir a valores incorrectos si la punta se desliza sobre la superficie, o si la superficie no está perfectamente limpiao o también si la carga superficial induce la repulsión electrostática. En todos los casos anteriores, la parte de contacto de la curva de fuerza se deformará (más inclinada o curvada en lugar de lineal).
El procedimiento de contacto descrito en la sección de protocolo es sólo uno de varios procedimientos de calibración existentes. Hay al menos 2 métodos más que se pueden utilizar de una manera relativamente fácil y económica: el método Sader (también llamado sin contacto cuando se implementa en algún software AFM) o el método en voladizo de referencia. El método Sader17 ha sido desarrollado originalmente por John Sader para voladizos en forma de V y luego para los rectangulares18 y no necesita la adquisición de una curva de fuerza en un sustrato rígido. En su lugar, el usuario debe especificar (fuera de la temperatura como en el método de contacto), la longitud y anchura del voladizo y la densidad y viscosidad del fluido donde está el voladizo (generalmente aire, agua o fluidos similares al agua). A continuación, se adquiere un espectro térmico y se miden la sensibilidad de desviación y la constante de resorte. Este método es ventajoso cuando se utilizan puntas muy afiladas o funcionalizadas que pueden dañarse haciendo una curva de fuerza en un sustrato rígido.
Ambos métodos anteriores se relacionan con la adquisición del espectro de oscilación de un voladizo excitado térmicamente. Cuando se utilizan voladizos rígidos a temperatura ambiente, la amplitud media de oscilación puede ser inferior a 0,1 nm, lo que hace que el pico de resonancia sea más pequeño y más difícil de detectar. De todos modos, al menos para ambos instrumentos utilizados en este papel, el pico de resonancia se puede detectar en el aire y en el agua y se monta para medir la constante de resorte (teniendo en cuenta que cuando la medición se realiza en líquido, la frecuencia de resonancia cambia hacia una valores y el pico se amplía).
Un tercer método no utiliza una melodía térmica, sino un voladizo de referencia o una estructura elástica de referencia, con una constante de resorte conocida (generalmente con una incertidumbre alrededor o por debajo del 5%), con el fin de determinar el voladizo K. En este caso es necesario adquirir una curva de primera fuerza sobre un sustrato rígido para medir la sensibilidad a la desviación (que vuelve a aparecer junto con todos los artefactos posibles que afectan a la forma de la curva). A continuación, el sustrato rígido se sustituye por el voladizo de referencia (generalmente un voladizo sin punta con una constante de resorte calibrado) y se realiza otra curva de fuerza (o algunas otras), registrando de nuevo el valor de la sensibilidad de desviación. La constante de resorte en voladizo se calcula como:
donde Kref es la constante de resorte del voladizo de referencia, Sref la sensibilidad de desviación medida en él, L es su longitud y Srígido es la sensibilidad de desviación medida en la rigidez Sustrato. El desplazamiento es el desfase entre la punta y el final del voladizo de referencia y depende de la alineación realizada por el usuario y, finalmente, el ángulo de inclinación del voladizo, especificado por el fabricante de AFM. El mismo método se puede utilizar en estructuras elásticas diseñadas específicamente para la calibración de voladizos o indentadores. La ventaja de esas estructuras (que son generalmente circulares) es que K en su centro es constante y no depende de ningún parámetro geométrico o del posicionamiento preciso de la punta AFM en ellas, por lo que la eliminación de L y L de la fórmula anterior.
El usuario de AFM tiene que tener en cuenta que todos esos métodos de calibración se ven afectados por diferentes fuentes de error (determinación de la sensibilidad de desviación en primer y tercer lugar, el uso de la melodía térmica en el caso de voladizos rígidos para el primero y segundo y geométrico parámetros y alineación para el tercero, así como la precisión de calibración de Kref en el caso de referencia voladizo se utiliza) y que los métodos de contacto son potencialmente perjudiciales para la punta (especialmente la tercera, donde la calibración impone el uso de dos diferentes muestras). Esto implica que la constante de resorte siempre se determinará hasta una cierta precisión y así serán las fuerzas medidas/aplicadas (ver Sikora19 para una revisión exhaustiva de los diferentes métodos de calibración y su precisión. Esto significa que los módulos y las presiones de turgor de Young también se verán afectados por la calibración del voladizo. De todos modos, otras fuentes de error aún más importantes están involucradas al calcular esas cantidades (como el uso de modelos simplificados para la determinación de módulos de Young) por lo que siempre será un desafío para obtener valores absolutos de ese tipo de mediciones. Lo que es importante es obtener valores que son del orden correcto de magnitud y que son coherentes entre sí, lo que significa que si el experimento es repetido por el mismo usuario en la misma muestra, los valores deben ser compatibles. Para obtenerla, la calibración debe realizarse con cuidado y se deben minimizar las fuentes de error (por ejemplo, limitando tanto como posiblemente ruido acústico/vibraciones). Una posible estrategia centrada en aumentar la coherencia de las calibraciones repetidas ha sido propuesta recientemente en un documento por Schillers et al.20, donde gracias a la colaboración de 11 laboratorios europeos, un protocolo (llamado SNAP) para compensar los errores en se ha desarrollado la determinación de la sensibilidad a la desviación. En este artículo los autores utilizan voladizos calibrados directamente para sus mediciones, de todos modos el mismo protocolo se puede aplicar a los voladizos no calibrados, simplemente calibrando la primera vez con el método de elección y luego considerando el primer resorte constante como valor de referencia ("calibrado").
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al equipo de PLATIM por su apoyo técnico, así como a Arezki Boudaoud y a los miembros del equipo de Biophysic en el laboratorio rdp por sus útiles debates.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth medium | |||
| 1,000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| Agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| Agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2 mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| Oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| Plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| Sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
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