Uso da microscopia de força atômica para medir propriedades mecânicas e pressão de turgor de células vegetais e tecidos vegetais

Summary

Aqui, nós apresentamos a microscopia de força atômica (AFM), operada como uma ferramenta do nano-e do micro-Indentation em pilhas e em tecidos. O instrumento permite a aquisição simultânea de topografia de superfície 3D da amostra e suas propriedades mecânicas, incluindo a parede celular módulo de Young, bem como a pressão de turgor.

Abstract

Apresentamos aqui o uso da microscopia de força atômica para recuar os tecidos vegetais e recuperar suas propriedades mecânicas. Usando dois microscópios diferentes no modo de recuo, mostramos como medir um módulo elástico e usá-lo para avaliar as propriedades mecânicas da parede celular. Além disso, também explicamos como avaliar a pressão de turgor. As principais vantagens da microscopia de força atômica são que ele é não-invasivo, relativamente rápido (5 ~ 20 min), e que virtualmente qualquer tipo de tecido vegetal que é superficialmente plana pode ser analisado sem a necessidade de tratamento. A resolução pode ser muito boa, dependendo do tamanho da ponta e do número de medições por unidade de área. Uma limitação deste método é que dá somente o acesso direto à camada superficial da pilha.

Introduction

A microscopia da força atômica (AFM) pertence à família da microscopia da sonda da exploração (SPM), onde uma ponta com um raio de geralmente alguns nanômetros examina a superfície de uma amostra. A detecção de uma superfície não é alcançada através de métodos ópticos ou baseados em elétrons, mas através das forças de interação entre a ponta e a superfície da amostra. Assim, esta técnica não se limita à caracterização topográfica de uma superfície amostral (resolução 3D que pode descer para poucos nanômetros), mas também permite a medição de qualquer tipo de força de interação, como eletrostática, Van der Waals ou forças de contato. Além disso, a ponta pode ser usada para aplicar forças na superfície de uma amostra biológica e medir a deformação resultante, o chamado "recuo", a fim de determinar suas propriedades mecânicas (por exemplo, módulo de Young, propriedades viscoelásticas).

As propriedades mecânicas das paredes das células vegetais são essenciais para serem levadas em conta ao tentarem compreender os mecanismos subjacentes aos processos de desenvolvimento^1,2,3. Certamente, estas propriedades são controladas firmemente durante o desenvolvimento, no detalhe desde que o amolecimento da parede celular é exigido para permitir que as pilhas cresçam. AFM pode ser usado para medir essas propriedades e estudar a maneira como eles mudam entre órgãos, tecidos ou estágios de desenvolvimento.

Neste artigo, nós descrevemos como nós usamos AFM para medir propriedades mecânicas da parede de pilha e a pressão do turgor. Estas duas aplicações são demonstradas em dois microscópios diferentes de AFM e são detalhadas aqui em seguida.

Protocol

1. Measure de propriedades mecânicas da parede de pilha

Nota: O exemplo do gineceu tornando-se de Arabidopsis é apresentado.

1. Preparação das amostras biológicas
   1. Colete um botão de flor fechado no estágio 9 a 10 (aproximadamente 0,5 milímetros de comprimento) de acordo com a determinação publicada dos estágios para Arabidopsis⁴. um binocular, usando pinças finas, cuidadosamente abrir o botão para verificar o estágio de desenvolvimento e recolher o gineceu localizado no centro da flor.
   2. Põr o gineceu na fita lateral dobro coloc no centro da tampa de um prato de Petri pequeno (diâmetro de 5 cm).
      Nota: Como alternativa, cola biocompatível também pode ser usado para a imobilização mais eficiente da amostra após o recuo.
   3. Adicione rapidamente água até que a amostra esteja completamente coberta. Isso evita a desidratação e reduz a aderência da ponta à amostra. Alternativamente, mergulhe a amostra em meio líquido, como o meio de cultura Arabidopsis Apex⁵.
2. Calibração AFM
   1. Definir a mola cantilever k constante alta o suficiente para permitir a deformação da superfície da amostra até o recuo desejado, mas não muito alto para evitar a perda de sensibilidade.
      Nota: Como regra geral, se o módulo de Young da amostra é conhecido, a ordem de magnitude da constante de mola pode ser escolhida como k≈E * δ, onde δ é o recuo desejado.
   2. Use uma ponta esférica de R = 400 nm com uma distância de ponta-cantilever de 15 μm.
      Nota: O raio da ponta está diretamente relacionado à resolução lateral. Geralmente, para o recuo em materiais biológicos, escolha pontas arredondadas (R maior do que 10-20 nanômetro) ou pontas de prova coloidal. As pontas de prova coloidal pequenas podem ser complicadas de usar-se devido à distância pequena entre a extremidade da ponta e o cantilever que podem tocar na superfície da amostra.
   3. Ligue o software e coloque a cabeça horizontalmente pelo menos 2-3 h antes do experimento: Isto permitirá que a cabeça para queimar e evitará os movimentos relativos termicamente induzidos do cantilever-laser. Se o microscópio estiver equipado com um módulo CellHesion (estendendo a faixa de Z piezo disponível para 100 μm em vez de 15 μm), ligue o seu controlador primeiro e, em seguida, selecione o modo CellHesion ao iniciar o software.
   4. Monte o cantilever no bloco de vidro e monte o bloco na cabeça. Coloque uma gota de alguns microlitros de água ultrapura na ponta para evitar a formação de bolhas de ar quando a ponta é mergulhada em água.
   5. Coloque uma amostra dura (lâmina de vidro limpa ou safira) e adicione 30-50 μL de água ultrapura.
      Nota: O procedimento de calibração descrito aqui é a calibração de contato às vezes chamada. Em primeiro lugar, uma curva de força é feita em uma superfície rígida e plana e, em seguida, o espectro de oscilação do cantilever termicamente animado é gravado a fim de calcular a constante de mola. Outros protocolos de calibração existem e serão brevemente descritos no parágrafo de discussão.
   6. Coloque a cabeça no palco (tenha cuidado para levantar os motores Z alto o suficiente). Use a imagem óptica para colocar aproximadamente o laser no cantilever.
      1. Mova o laser ao longo do eixo principal do cantilever monitorando o sinal de soma no fotodiodo.
         Nota: Quando os cantimanhas padrão são usados, uma soma maior do que 0,5 V deve ser obtida.
      2. Mova o laser ao longo da outra direção e maximizar o sinal de soma, a fim de posicionar o laser no meio do cantilever. Isso minimizará o cross-talk entre a deflexão lateral e vertical.
   7. Medição da sensibilidade de deflexão
      Nota: O fotodiodo lê o deslocamento do laser e fornece um sinal nos volts. A fim de poder medir a deflexão na unidade métrica, a sensibilidade da deflexão deve ser medida.
      1. Ajuste o instrumento em contato → espectroscopia de força. Defina um ponto de ajuste relativo para 2 V , comprimento z para 0,5 μm e aumente a velocidade para 2 μm/s (taxa de amostragem para 10000 Hz) e selecione z closed loop.
      2. Abra o Gerenciador de calibração e selecione a parte de contato da curva de força (que deve ser linear) para fazer um ajuste linear: o inverso da inclinação dá a sensibilidade de deflexão. A leitura do fotodiodo está agora calibrada na unidade métrica.
   8. Determinação da constante da mola. No Gerenciador de calibração, selecione constante de mola para executar uma aquisição de espectro térmico. Para a média do sinal por mais tempo, selecione o símbolo ∞. O espectro de potência do cantilever termicamente excitado pode mostrar vários picos; Desenhe uma seleção em torno de uma colocada em menor frequência para ajustá-la.
      Nota: Se a sintonia térmica é realizada em líquido, o pico de ressonância será mais amplo e sua freqüência baixou em comparação com um nominal.
3. Set-up e aquisição de experimentos de espectroscopia de força
   1. Coloque a amostra na fase AFM e coloque a cabeça sobre a amostra.
      Nota: Certifique-se de que a cabeça foi retraído o suficiente para evitar um contato duro entre a ponta e a superfície da amostra.
   2. Deixe o cantilever queimar por alguns minutos.
   3. No modo QI , aproxime-se com uma força setpoint de 50 nn.
   4. Defina um comprimento Z de 4 μm e uma área de digitalização para 80 x 80 μm² com um número de pixels de 40 x 40. No painel de Configurações avançadas de imagem , defina o modo como velocidade constante. Defina estender e retrair a velocidade para 200 μm/s e taxas de amostragem para 25 kHz.
   5. Comece a digitalizar e use esta varredura rápida de baixa força para verificar se a amostra se move. Verifique se a área digitalizada está livre de detritos ou de células desviadas e localize uma região de interesse tão plana quanto possível para realizar as medições.
      Nota: A fim apreciar a inclinação real da amostra, o nivelamento da linha deve ser ajustado a desligado ou a constante. Um ângulo de inclinação excessivo entre o eixo de recuo e a superfície terá um efeito na medida do módulo de Young⁵.
   6. Uma vez que uma área de interesse foi localizada, selecione uma região de 40 x 40 para 60 x 60 μm² em torno dele e aumente o número de pixel para alcançar 2 pixels/μm. Aumente o setpoint para 500 nm para obter 100-200 nm de recuo. Ajuste esse valor, se necessário, no início do experimento. Diminua o comprimento Z para 2 μm. diminua a extensão e retrair a velocidade para 100 μm/s e aumente a taxa de amostragem para 50 kHz.
   7. Inicie a digitalização e salve a saída (geralmente composta por uma imagem e um arquivo de dados).
   8. No final do dia de medição, retire o suporte da ponta e enxague suavemente com água ultrapura e 70% EtOH.
   9. Seque e retire o cantilever. Para mais experimentos com a mesma ponta, considere limpá-lo com um protocolo de limpeza úmida e, se possível, um tratamento de plasma O₂ de acompanhamento. Não deixe a água secar no cantilever e/ou no suporte da ponta para evitar a cristalização do sal.
4. Análise de dados (para versão de software de processamento de dados 6. x)
   1. Abra o software de processamento de dados e carregue o arquivo de dados.
   2. Clique em usar este mapa para o botão de processamento em lote, a fim de usar os mesmos parâmetros de análise em todas as curvas do mapa.
   3. Em carregar processo pré-definido, selecione ajuste Hertz.
   4. Use a primeira guia para verificar ou alterar os parâmetros de calibração.
   5. Na segunda guia, remova um deslocamento (ou um deslocamento mais uma inclinação) da linha de base para definir seu valor médio como 0.
   6. Na terceira guia, estimar a posição de ponto de contato (POC), considerando-o como o primeiro ponto cruzando a força 0 ao descer do valor de SetPoint ao longo da curva de estender.
   7. A posição vertical da ponta da aba calcula o movimento da ponta subtraindo a deflexão do cantilever da altura medida. Nesta etapa, use a altura unsmoothed (dados brutos) para o ajuste a seguir, marcando a caixa de seleção correspondente.
   8. Na guia ajuste de elasticidade , selecione o modelo de ajuste apropriado. Se nenhuma ou fraca aderência for visível nas curvas de retrair (correspondendo a menos de 10% da força do ponto de ajuste ou à força média máxima na profundidade de recuo selecionada), o tipo de modelo deve ser definido como hertz/Sneddon e estender a curva deve ser usado. Em caso de adesão mais forte, o modelo DMT, que representa o modelo Derjaguin-Muller-Toporov, deve ser preferido e o ajuste deve ser realizado em curvas de retrair (consulte o manual para obter detalhes sobre os modelos de contato disponíveis e fórmulas relacionadas).
      1. Ajuste os parâmetros geométricos da ponta baseados na forma nominal da ponta. Aqui, a forma da ponta é esfera e raio da ponta é 400 nanômetro.
      2. Defina a proporção de Poisson para 0,5, pois é feita convencionalmente para material biológico (correspondente ao material incompressível).
   9. Ajuste até recuo específico. Por padrão, o ajuste é executado em toda a curva. Se o ajuste tiver que ser feito até um recuo específico, primeiro verifique a caixa de seleção Shift Curve ; Isso irá deslocar a origem da curva com base em valores de linha de base e POC recém-determinados.
      1. Adicione uma segunda rotina de ajuste de elasticidade clicando no ícone na janela principal.
      2. Defina novamente todos os parâmetros de ajuste e especifique em X min o recuo desejado. Adicione quantos passos forem necessários (2 a 3 passos devem ser suficientes) para refinar a determinação da posição POC e, subsequentemente, a profundidade de recuo calculada. O processo pode ser salvo neste momento.
   10. Clique em manter e aplique a todos para iterar as etapas anteriores em todas as curvas do mapa.
   11. Salve os resultados. Uma imagem e um. tsv arquivos serão obtidos.

2. medida da pressão de turgor

Nota: Um exemplo do meristema de inflorescência oryzalin-Tratado de Arabidopsis é apresentado.

1. Preparação da amostra biológica
   1. Colete Arabidopsis inflorescência meristema (IM) tratada com o microtúter despolimerizando a medicina Orizalina de in vitro plantlet cultivado em meio contendo o inibidor de transporte de auxina polar 1-N-naftilphthalamic Acid (NPA) após o método publicado a ⁶.
   2. Montagem de amostra de IM seguindo uma das duas opções
      1. Para a monitoração a longo prazo: Monte a amostra em um prato de Petri que contem o meio de cultura do vértice de Arabidopsis (ACM)^7,8 e 0,1% mistura da preservação de planta (ppm), para impedir a contaminação. Suspenda a ponta IM acima da superfície ACM e apoie a base de IM com uma gota de agarose de 2%.
      2. Para a medida com mudanças rápidas da solução: Monte a amostra em um petri-prato que prende um pedaço pequeno de Mastic adesivo, e sele rapidamente a abertura entre o Mastic e a base da amostra com colagem bio-compatible. Aguarde a colagem para solidificar (menos de 2 min), em seguida, submergir a amostra em líquido ACM contendo 0,1% PPM.
         Nota: Certifique-se de que a superfície da amostra não é revestida com agarose ou cola ao fixar a base da amostra. A medida de AFM da pressão do turgor exige a amostra de ser montada estàvel, e os métodos de montagem precedentes fornecem a estabilidade aceitável. Dependendo da amostra, outros métodos de montagem podem ser usados, como fita dupla face, poli-lisina, etc.
2. Calibração AFM
   1. Ative o software de aquisição AFM e escolha o modo de medição Peakforce QNM (grande amplitude) .
   2. Realize a calibração seguindo o mesmo princípio descrito nas etapas 2,1 a 2,6.
   3. Na janela verificar parâmetros , defina tamanho da digitalização como 0. Na janela de rampa , defina o tamanho da rampa entre 200 nm e 500 nm, limiar de Trig entre 2 v e 5 v e número de amostras para 2048 ou superior.
   4. Alinhe a ponta do cantilever com a amostra de calibração e clique em abordagem.
   5. Após o contato, vá para a janela de rampa e clique no botão rampa contínua. No regime linear da curva, determine a inclinação clicando no botão Atualizar sensibilidade . Repita a medida da sensibilidade da deflexão diversas vezes e atualize manualmente a calibração com a média da medida abrindo o detetor da aba da calibraçãodo menu.
   6. Retrair a cabeça AFM e retire a amostra de calibração.
      Nota: Sugere-se para retrair completamente a cabeça de AFM escolhendo o estágio da aba → inicializar para impedir o contato duro acidental em cima da mudança da amostra.
3. Set-up e aquisição de experimentos de espectroscopia de força
   1. Se a amostra ainda não estiver submersa, mergulhe-a com o ACM líquido contendo PPM.
   2. No software de aquisição, especifique os parâmetros de medição da seguinte forma:
      1. Na janela do parâmetro da verificação , ajuste a constante da mola à constante manufacturado da mola do cantilever ou à constante determinada da mola como na etapa 2,8. Neste exemplo, ele é definido em 42 N/m.
      2. Ajuste o raio da ponta a 400 nanômetro neste exemplo.
      3. Defina a proporção de Poisson de amostra para 0,5, uma vez que a água contribui principalmente para a pressão de turgor.
      4. Ajuste a amostra/linha a 128 para assegurar a aquisição rápida.
      5. Defina a taxa de digitalização para 0,2 Hz.
      6. Definir tamanho da digitalização para 1 μm.
         Nota: Definir taxa de digitalização e tamanho de digitalização pequeno pode efetivamente impedir AFM dano de amostra acionado por varredura. Recomenda-se reduzir estes dois parâmetros em cima de toda a mudança da amostra.
      7. Na janela da rampa , ajuste o tamanho da rampa a 5 μm.
         Nota: É melhor ajustar o tamanho da rampa maior do que a profundidade de recuo pretendida para uma melhor aquisição de linha de base.
      8. Defina o limiar Trig para o máximo.
      9. Defina o número de amostras para 4608.
      10. Opcionalmente, na guia microscópio → parâmetros de engajamento , reduza os seguintes parâmetros para evitar dano de amostra induzido por contato forte. Set Peak Force Engage SetPoint para 0,3 v (padrão 0,5 v). Defina envolver int. Gain para 0,5 (padrão 0,75). Definir SPM acoplar passo a 4 μm (padrão 15 μm).
   3. Coloque e alinhe a amostra a cabeça do AFM e aproxime-se até que o cantilever esteja submerso, mas não em contato com a superfície da amostra.
      Nota: Enquanto se aproxima, levemente soprar na superfície do líquido ACM até que uma ponte líquida é formada entre o cantilever e a superfície líquida. Isso geralmente impede o contato duro.
   4. Com cuidado, aproxime-se manualmente para a amostra. Quando a sonda estiver relativamente próxima da superfície da amostra, clique em abordagem.
   5. Em cima do contato, Aumente gradualmente o tamanho da varredura e/ou a taxa da varredura até um contrapeso desejado sem danificar a amostra e/ou o cantilever.
      Nota: O tamanho da digitalização é limitado pela curvatura superficial e rugosidade da amostra. No caso de IM tratada com oryzalina, 50 x 50 μm² Scan área pode ser alcançada com taxa de digitalização de 0,3 Hz.
   6. Durante a digitalização, determine se a região de medição é a desejada. Realocar se necessário. Quando satisfeito, clique no botão apontar e disparar para iniciar o apontar e disparar janela.
   7. Antes de gravar a digitalização, escolha um canal de imagem apropriado que possa facilitar a identificação clara dos contornos das células. Frequentemente, o erro Peak Force, o módulo DMT, o módulo LogDMT ou a dissipação são adequados. Especifique salvar diretório e nome do arquivo. Em seguida, clique em rampa na próxima digitalização para iniciar a gravação.
      Nota: Uma seqüência de um ponto e três números serão adicionados automaticamente após o nome do arquivo designado (como. 000). Este número aumenta automaticamente em 1 após cada repetição de digitalização guardada.
   8. Quando a digitalização estiver concluída, a interface do software será automaticamente redirecionada para a janela de rampa . Clique na imagem digitalizada para especificar as posições a serem recuadas.
      Nota: Antes de gravar recuos, é melhor escolher vários pontos de referência para realizar recuos de teste clicando apenas em rampa, caso a alternância de parâmetros seja necessária (para o tamanho da rampa, posição piezo, etc.). A profundidade de recuo precisa ser maior do que a espessura da parede celular (idealmente determinada separadamente pela microscopia eletrônica de transmissão).
   9. Escolha pelo menos três sites de recuo por célula perto de seu barycenter e repita o recuo três vezes por site. Isto renderia pelo menos nove curvas da força por a pilha para uma análise mais adicional. Quando estiver satisfeito com o posicionamento do site de recuo, clique em rampa e captura. As curvas de recuo de força são salvas automaticamente no diretório designado.
   10. Quando as rampas são concluídas, realocar para uma posição diferente para medição de telha, ou retrair a cabeça de digitalização e alterar a amostra.
   11. Quando terminar, limpe o cantilever como nas etapas 1.3.8 e 1.3.9.
4. Análise de dados
   1. No software de análise, abra o arquivo *. MCA. Isso mostra a posição de cada curva de força na imagem digitalizada. Se desejado, pré-selecione as curvas de força para análise.
   2. Abra uma curva de força a ser analisada, geralmente no formato de x0000y. 00Z, onde x é o nome de arquivo especificado no diretório Save enquanto y e z são números registrados automaticamente indicando a sequência de recuo e o número da digitalização.
   3. Clique no botão de correção de linha de base e arraste as linhas de traço azul na curva de força até estender início da linha de base de origem e estender a parada de linha de base de origem estão em 0% e 80%, respectivamente. Clique em executar.
      Nota: Como alternativa, estender a parada da linha de base de origem pode ser definida em valores diferentes, contanto que ainda esteja dentro da linha de base e não além do ponto de contato.
   4. Clique no botão filtro Boxcar e clique em executar para curva de força suave.
   5. Clique no botão recuo .
      1. Na janela de entrada , defina a curva ativa para estender.
      2. Ajuste o método do ajuste ao modelo linearized e inclua a força da adesão a Sim.
      3. Defina limite de ajuste de força máximo para 99% e limite de ajuste de força mín para 75%.
      4. Ajuste o modelo apto à rigidez (linear).
         Nota: Esta configuração irá calcular a rigidez aparente k para a dedução de pressão turgor. Neste exemplo, os limites de ajuste refletem um ajuste de rigidez de cerca de 1,5 μm de profundidade de recuo.
   6. Curvas de força podem ser analisadas em lote. Clique no botão histórico de execução , especifique o diretório do relatório e adicione todas as outras curvas de força que exijam o mesmo tratamento. Quando estiver satisfeito, clique em executar. Por padrão, o ajuste será armazenado como um arquivo *. txt.
   7. Quando k é montado em lote, clique em histórico → 5 recuo para retornar à janela de recuo.
      1. Altere o limite máximo de ajuste de força para 10% e limite de ajuste mínimo de força para 0%.
      2. Ajuste o modelo apto a hertzian (esférico).
         Nota: isto irá calcular a parede celular módulo de Young E para dedução de pressão de turgor. Neste exemplo, os limites de ajuste refletem um ajuste hertziano (usando sonda esférica) de cerca de 0,4 μm de profundidade de recuo.
   8. Repita a etapa 2.4.6 para ajuste de lote para E.
   9. Abra o arquivo *. 00Z (z é o número de digitalização registrado automaticamente) para exibir os diferentes canais de digitalização. Na janela de canal de altura , clique em botão de seção . Isso permitirá a medição da curvatura superficial da amostra necessária para a dedução da pressão de turgor.
      1. Desenhe uma linha através do eixo longo de uma célula, mova os limites da linha de traço para as bordas da célula e registre o valor do raio r₁. Repita este para o eixo curto para recuperar o raio r₂. Calcule a curvatura média da superfície da célula κ_M e a curvatura gaussiana κ_G usando a medição de dois raios da seguinte maneira:
         E 
   10. Deduce turgor pressão P usando o modelo de casca fina publicado⁹ da seguinte maneira:
        
       Com
       
       onde t é a espessura da parede celular determinada por por exemplo, microscopia eletrônica.
       Nota: A dedução da pressão de turgor é um processo de encaixe, onde as iterações são exigidas. Quatro iterações geralmente são capazes de reproduzir produto estável, no entanto, mais iterações podem ser feitas (por exemplo 100 vezes).
   11. Calcule a média e, k e P por célula. Além disso, registre a variabilidade intracelular (por exemplo, desvio padrão) para a documentação.

Representative Results

Figura 1a e Figura 1b mostram uma captura de tela ilustrando o resultado das etapas 1.3.4 a 1.3.6 do protocolo, usado para localizar uma região de interesse onde adquirir o mapa de QI. Vale ressaltar que a região de interesse foi escolhida para não estar em uma superfície inclinada (ou seja, o mais plana possível). Na verdade, como observado por Routier et al.⁵, se o eixo de recuo não for perpendicular à superfície, o módulo de Young medido pode ser subestimado. Esse efeito é visível no canto superior direito dos painéis C ou D da Figura 1, onde parte da borda das células parece mais suave do que o restante da célula. Os artefactos induzidos por este efeito será muito mais forte no caso de meristems, onde o ângulo de inclinação local pode facilmente superar 40 ° sobre 50 x 50 μm² áreas de digitalização. Em nosso laboratório, atualmente estamos desenvolvendo um algoritmo, baseado na abordagem descrita por Routier et al.⁵, para corrigir esses artefatos (papel em preparação). Figura 1C e Figura 1D mostram os mapas do módulo de Young obtidos após a análise detalhada no quarto parágrafo do protocolo. Em particular, o painel C representa o módulo de Young obtido analisando todo o recuo, até o ponto de ajuste de força definido pelo usuário, enquanto o painel D mostra o resultado da análise do primeiro 100 nm de recuo (conforme descrito na etapa 1.4.9). Aqui, os 2 mapas parecem muito semelhantes, porque durante a experiência de set-up, o SetPoint foi escolhido a fim de obter indentações média em torno de 100 nm. A variação do recuo analisado pode, às vezes, levar a um melhor realce da amostra heterogeneidades, que pode ser útil para identificar a localização ou para fornecer informações sobre o comportamento das estruturas internas (por exemplo, Costa et al.¹⁰)

A curva de força na Figura 2 mostra dois efeitos que valem a pena mencionar. Em primeiro lugar, pode-se notar que, se a parte de aproximação da curva de força realmente termina na força de SetPoint de 500 nN, o movimento de ponta descendente continua indo, o que significa que a força final aplicada pela ponta é maior do que o esperado (aqui 1.000 nN). Isto é devido ao fato de que o loop de feedback monitorando a deflexão do cantilever não atua instantaneamente, então seu tempo de reação finita introduz um atraso entre detecção de limiar de deflexão e parada de movimento piezo. Além disso, especialmente quando se utiliza CellHesion que move o suporte da amostra, inércia das peças em movimento entra em jogo, tornando este tempo lag mais. Este problema pode ser limitado usando a cabeça piezo, caso em que o usuário deve ser muito cuidadoso no caso de medições em amostras muito ásperas ou inclinadas, ou reduzindo a velocidade da rampa, que de qualquer maneira limita a resolução e/ou o número de amostras digitalizadas ( Além disso, para mapas muito lentos, o crescimento da amostra pode se tornar um problema). Geralmente, se as curvas de força são suficientemente distantes uma da outra (com base no modelo de recuo de escolha, o raio da área recuada pode ser calculado dada a profundidade de recuo e usado como distância mínima de separação), as medições realizadas em diferentes as posições ao longo da amostra não devem ser correlacionadas e se a análise é realizada na curva de aproximação, superar o limiar de força não deve ser um problema. Enfim, se a amostra é delicada ou se as varreduras repetidas são feitas na mesma área, o cientista pode querer tentar minimizar este overshoot. Infelizmente, não há uma regra de ouro para determinar a quantidade deste overshoot, uma vez que depende do piezo usado, nas velocidades de rampa, mas também em Propriedades do material: o mais rígido do material, mais rápido a variação do sinal de deflexão no tempo e , dado um tempo de resposta finito do gabarito, maior o overshoot.

A segunda coisa a notar é a ondulação na curva de retrair destacada pela elipse. Tal ondulação pode ser um indicador de movimento da amostra/vibrando a ação da ponta. Neste caso, o usuário pode tentar mudar a área escaneada (às vezes a outra parte do microscópio mas a ponta pode tocar na amostra, ou a amostra pode ser insuficientemente bem fixada a seu apoio) ou a amostra se diversos deles foram preparados no mesmo apoio. Se o recurso está sempre lá, é melhor mudar o método de fixação, neste caso, mudando da fixação de fita dupla face para colas biocompatíveis.

A Figura 3 retrata a determinação dos parâmetros-chave para a dedução da pressão de turgor. Cada parâmetro, exceto para a espessura de parede celular¹¹ que foi determinado separadamente pela microscopia de elétron para ser ~ 740 nm, pode ser recuperado de VARREDURAS AFM e recuos. Seguindo o processo de encaixe na etapa 2.4.10, a pressão do turgor é deduzada para ser 1,50 MPa para esta curva da força. O agrupamento de todas as dezoito curvas de força nesta célula produz valores médios de E = 6,77 ± 1, 2 MPa, k = 14,18 ± 2,45 N/m e P = 1,45 ± 0,29 MPa (média ± desvio padrão).

Figura 1 : Mapas de topografia (altura medida) tipicamente adquiridos durante um experimento. (A) um primeiro mapa de baixa resolução/baixa força é gravado para encontrar uma região adequada para digitalizar. (B) é adquirido um mapa de força menor de alta resolução/maior para o cálculo do módulo de Young (na área destacada pelo quadrado pontilhado preto). (C) os mapas de módulo de Young calculados a partir do mapa B, conforme detalhado na etapa 1,4. Aqui, o mapa do módulo de Young foi obtido analisando todo o recuo em cada curva de força. (D) o mapa de módulo de Young obtido analisando apenas o primeiro 100 nm de recuo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Exemplo de curva de força. No azul a aproximação, no vermelho o segmento do retrair. Força máxima (localizada na curva de retrair) é diferente do ponto de ajuste de força por causa do tempo de reação do loop de feedback finito e por causa da inércia. A ondulação na curva do retrair pode ser representativa de uma deficiência na fixação da amostra a seu apoio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Medidas de AFM para a dedução da pressão do turgor. (A) o mapa do módulo de DMT mostra o contorno desobstruído da pilha para supervisionar o posicionamento de locais Deep-Indentation perto do barycenter da pilha. Os sites de recuo são marcados por cruzes. (B) curva de força de recuo profundo na posição da Cruz Vermelha em a. Parede celular o módulo de Young e (verde) e a rigidez aparente k da amostra (vermelho) são montados em diferentes regimes da curva, conforme detalhado na etapa 2,4. R ² denota o coeficiente de determinação dos ajustes. (C) mapa de altura com eixos longos e curtos determinados manualmente de a, representados por linhas brancas, da mesma célula analisada nos painéis a e B. (D) altura perfil dos eixos longos e curtos da célula no painel C (azul, eixo longo vermelho, eixo curto) e o fitte d raios de curvatura (r₁ e r₂). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O surgimento de formas em plantas é determinado principalmente pela taxa coordenada e direção do crescimento durante o tempo e o espaço. Células vegetais são envoltos em uma parede celular rígida feita de uma matriz polissacarídico, que cola-los juntos. Em conseqüência, a expansão da pilha é controlada pelo equilíbrio entre a pressão do turgor que puxa na parede de pilha, e a rigidez da parede de pilha que resiste a esta pressão. A fim compreender os mecanismos que são subjacentes ao desenvolvimento, é importante poder medir ambas as propriedades mecânicas da parede de pilha assim como a pressão do turgor em tecidos ou em pilhas diferentes de um órgão dado. Como demonstrado neste artigo, o AFM é o método de escolha neste contexto.

Existem várias etapas críticas no protocolo. O primeiro é a preparação do tecido que deve ser rápido o suficiente para evitar a desidratação. Isto pode ser crítico em particular se quisermos medir a pressão de turgor. Muito importante também é uma correta fixação da amostra ao seu substrato: uma amostra instável pode levar a efeitos muito óbvios, como um movimento macroscópico que pode ser facilmente detectado opticamente, ou uma forte deformação de curvas de força. De qualquer forma, amostra de vibração ou dobra pode ser sutil para detectar, introduzindo artefactos nos resultados. Por fim, outra etapa crítica diz respeito à escolha dos parâmetros de recuo. Isso é determinante para a qualidade dos resultados.

Ao medir propriedades mecânicas em grandes áreas (sobre tamanhos da varredura de 40-50 μm), as diferenças da altura podem ser elevadas, fazendo a difícil controlar corretamente a superfície e realizando curvas da força sem alcangar os limites da escala piezo de Z. A fim superar esta edição, um módulo de CellHesion foi usado. Este módulo acrescenta um piezo Z adicional, localizado no estágio amostral, tendo uma faixa de 100 μm, que permite a aquisição de grandes áreas sem se aproximar perigosamente dos limites de Z piezo.

A primeira limitação do método é que só podemos medir camadas superficiais de células. No entanto, recentemente, autores utilizaram AFM nas seções^detecido^12,13,14. Embora isto deva ser feito no material fixo, pode dar o acesso às propriedades mecânicas de camadas profundas da pilha. Alternativamente, também foram realizados recuos mais profundos para inferir propriedades mecânicas de tecidos internos em amostras vivas, embora com maior sacrifício na resolução espacial¹⁵. Uma segunda limitação pode ser ligada à geometria da amostra, pois uma superfície com inclinação íngreme pode ser problemática, uma vez que a ponta não é mais perpendicular à amostra. Temos de restringir o leque de ângulos em que as medidas são fiáveis e estamos actualmente a desenvolver um algoritmo para corrigir potenciais artefactos ligados a este fenómeno. Além disso, alguns tecidos são cobertos com tricomas que podem bloquear as medições. Finalmente, o recuo mede propriedades mecânicas em um sentido perpendicular a respeito da superfície da pilha e nós podemos saber se este pode facilmente ser lig à extensibilidade da parede de pilha associada à capacidade de crescimento. Vários estudos sugerem que é o caso^15,16.

Vale a pena fazer aqui uma observação mais geral sobre a medida/aplicação das forças por AFM. Como descrito na seção de protocolo, a fim de poder transformar deslocamentos do laser no fotodiodo às forças, uma calibração tem que ser executada. Nesta calibração um parâmetro, a sensibilidade da deflexão, permite converter deslocamentos do laser à deflexão real do cantilever (medido geralmente no nanômetro), assim que este fator calibra tensões da saída do fotodiodo (ao longo dos eixos verticais) aos deslocamentos em Nm. O segundo fator é a constante de mola K, medida em N/m, que converte deflexões verticais em unidades de força (geralmente nN), uma vez que as cantilever flexíveis se comportam como molas. Mesmo que o procedimento pareça simples, uma calibração robusta e reprodutível de K para medições de espectroscopia de força AFM ainda é um problema, devido a diferentes fontes de erro que podem afetar as diferentes etapas do procedimento. Por exemplo, a medição da sensibilidade de deflexão percebendo uma curva de força em uma superfície rígida, pode levar a valores incorretos se a ponta desliza sobre a superfície, ou se a superfície não está perfeitamente limpa ou também se a carga superficial induzir repulsão eletrostática. Em todos os casos anteriores, a parte de contato da curva de força será deformada (inclinada mais ou curvada em vez de linear).

O procedimento de contato descrito na seção de protocolo é apenas um dos vários procedimentos de calibração existentes. Há pelo menos 2 métodos mais que podem ser usados de forma relativamente fácil e barata: o método Sader (também chamado de não-contato quando implementado em algum software AFM) ou o método de referência cantilever. Sader método¹⁷ foi originalmente desenvolvido por John Sader para cantimanhas em forma de V e, em seguida, para os retangulares¹⁸ e não precisa da aquisição de uma curva de força em um substrato rígido. Em vez disso, o usuário precisa especificar (fora da temperatura como no método de contato), o comprimento e a largura do cantilever e a densidade e viscosidade do fluido onde o cantilever é (geralmente ar, água ou uma água-como fluidos). Então um espectro térmico é adquirido e a sensibilidade da deflexão e a constante da mola são medidas. Este método é vantajoso ao usar pontas muito afiadas ou funcionalizados que podem ser danificadas que fazem uma curva da força em um substrato duro.

Ambos os métodos anteriores referem-se à aquisição do espectro de oscilação de um cantilever termicamente excitado. Quando os cantialavancos rígidos são usados na temperatura ambiente, a amplitude média da oscilação pode ser mais baixa do que 0,1 nanômetro, fazendo o pico da ressonância menor e mais difícil de detectar. Enfim, pelo menos para ambos os instrumentos utilizados neste papel, o pico de ressonância pode realmente ser detectado no ar e na água e montado para medir a constante de mola (Considerando que quando a medição é feita em líquido, a freqüência de ressonância desloca-se para baixo valores e o pico amplia).

Um terceiro método não usa uma melodia térmica, mas em vez disso, um cantilever de referência ou uma estrutura elástica de referência, com uma constante de mola conhecida (geralmente com uma incerteza em torno ou abaixo de 5%), a fim de determinar o cantilever K. Neste caso uma primeira curva da força precisa de ser adquirida em um substrato duro a fim medir a sensibilidade da deflexão (que vem outra vez junto com todos os artefactos possíveis que afetam a forma da curva). Em seguida, o substrato rígido é substituído pelo cantilever de referência (geralmente um cantilever sem ponta com uma constante de mola calibrada) e outra (ou poucos outros) curva de força é realizada, gravando novamente o valor da sensibilidade de deflexão. A constante da mola do cantilever é calculada então como:

onde K_ref é a constante de mola do cantilever de referência, S_ref a sensibilidade de deflexão medida sobre ela, L é o seu comprimento e S_Stiff é a sensibilidade de deflexão medida no Stiff Substrato. ΔL é o deslocamento entre a ponta e o final do cantilever de referência e depende do alinhamento feito pelo usuário e, finalmente, α é o ângulo de inclinação do cantilever, especificado pelo fabricante AFM. O mesmo método pode ser usado em estruturas elásticas projetadas especificamente para a calibração do cantilever ou do indenter. A vantagem dessas estruturas (que são geralmente circulares) é que K em seu centro é constante e não depende de qualquer parâmetro geométrico ou no posicionamento preciso da ponta AFM neles, assim removendo l e Δl da fórmula anterior.

O usuário AFM tem que ter em mente que todos esses métodos de calibração são afetados por diferentes fontes de erro (determinação de sensibilidade de deflexão em primeiro e terceiro, o uso de sintonia térmica no caso de cantimanhas rígidas para o primeiro e segundo e geométricos parâmetros e alinhamento para o terceiro, bem como a precisão de calibração de K_ref no caso de cantilever de referência é usado) e que os métodos de contato são potencialmente prejudiciais para a ponta (especialmente o terceiro, onde a calibração impõe o uso de dois amostras diferentes). Isto implica que a constante da mola estará determinada sempre até uma determinada precisão e assim que será as forças medidas/aplicadas (veja Sikora¹⁹ para uma revisão detalhada de métodos diferentes da calibração e de sua precisão. Isso significa que as pressões de moduli e turgor de Young também serão afetadas pela calibração do cantilever. De qualquer forma, outras fontes de erro ainda mais importantes estão envolvidas no cálculo dessas quantidades (como o uso de modelos simplificados para a determinação do módulo de Young), por isso será sempre um desafio obter valores absolutos desses tipos de medições. O que é importante é obter valores que são da ordem de magnitude certa e que são coerentes entre si, o que significa que se o experimento for repetido pelo mesmo usuário na mesma amostra, os valores devem ser compatíveis. A fim obtê-lo, a calibração deve ser feita com cuidado, e as fontes de erro devem ser minimizadas (por exemplo limitando tanto quanto possivelmente ruído acústico/vibrações). Uma estratégia possível focada em aumentar a coerência das calibrações repetidas foi recentemente proposta em um artigo de Schillers et al.²⁰, onde graças à colaboração de 11 laboratórios europeus, um protocolo (chamado snap) para compensar erros em a determinação da sensibilidade da deflexão foi desenvolvida. Neste papel os autores usam cantimanhas diretamente calibradas para suas medidas, de qualquer maneira o mesmo protocolo pode ser aplicado aos cantialavancos não-calibrados, simplesmente calibrando os a primeira vez com o método da escolha e então Considerando a primeira mola constante como o valor de referência ("calibrado").

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth medium
1,000x vimatin stock solution			used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)	Sigma-Aldrich/Merck	132-66-1	add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
Agar-agar	Sigma-Aldrich/Merck	9002-18-0	add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
Agarose	Merck Millipore	9012-36-6	used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium	Duchefa Biochimie	DU0742.0025	For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich/Merck	13477-34-4	add to Arabidopsis medium, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM	Duchefa Biochimie	M0221.0025	Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L.
N6-benzyladenine (BAP)	Sigma-Aldrich/Merck	1214-39-7	used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Oryzalin	Sigma-Aldrich/Merck	19044-88-3	for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
Plant preservation mixture (PPM)	Plant Cell Technology		used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide	Duchefa Biochimie	1310-58-3	used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
Sucrose	Duchefa Biochimie	57-50-1	used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM	Bruker		The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion	JPK (Bruker)		The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix	UHU	D1620
Reference elasitic structure	NanoIdea	2Z00026
Reprorubber-Thin Pour	Flexbar	16135	biocompatible glue.
Spherical AFM tips	Nanoandmore	SD-SPHERE-NCH-S-10	Tips used for measuring mechanical properties.