Summary
يقدم البروتوكول نموذج ًا كاملًا من المورين الناجم عن TNBS من مرض كرون وطرق تصور مستقبلات الإستروجين بواسطة الكيمياء المناعية باستخدام الفلورات المناعية لأقسام القولون الثابتة من formalin المضمنة في البارافين.
Abstract
مرض كرون هو النوع الأكثر تشخيصا من مرض التهاب الأمعاء. التهاب مزمن النامية في الأمعاء يؤدي إلى اضطراب التمعم وتلف الغشاء المخاطي المعوي ويبدو أن يرتبط مع زيادة خطر التحول النيوبلاستيك القولون. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن هرمون الاستروجين ومستقبلات الإستروجين لا تؤثر فقط على الأنسجة الحساسة للهرمون ، ولكن أيضًا على الأنسجة الأخرى التي لا ترتبط مباشرة بهرمون الاستروجين ، مثل الرئتين أو القولون. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتلطيخ الفلور المناعي الناجح لمستقبلات هرمون الاستروجين في القولون التي تم الحصول عليها من نموذج مورين من مرض كرون الناجم عن TNBS. يتم توفير بروتوكول مفصل لتحريض مرض كرون في إعداد الفئران والأمعاء بالإضافة إلى إجراء مناعي خطوة بخطوة باستخدام أقسام الأمعاء المضمنة بالبارافين الثابتة. الأساليب الموصوفة ليست مفيدة فقط للكشف عن مستقبلات هرمون الاستروجين والاستروجين إشارة التحقيق في الجسم الحي ولكن يمكن أيضا أن تطبق على للبروتينات الأخرى التي قد تشارك في تطوير التهاب القولون.
Introduction
مرض كرون (CD) هو مرض التهاب الأمعاء (IBD) يتجلى التهاب الأمعاء المزمن. لا يفهم مسببات CD بشكل جيد ، ولكن هناك عدد قليل من العوامل الرئيسية التي يبدو أنها مسؤولة عن تطوير CD ، بما في ذلك ميكروبيوتا الأمعاء ، والعوامل الوراثية والبيئية ، مثل النظام الغذائي أو الإجهاد1. من أجل فهم أفضل لإمراض مرض كرون ، تم استخدام عدة نماذج من التهاب الأمعاء2،3،4،5،66،7., في هذه المقالة، نقدم النتائج التي تم الحصول عليها من 2,4,6-trinitrobenzene حمض السلفوين (TNBS) الناجمة عن نموذج المورين من CD.
وقد تم توثيق أن هرمون الاستروجين قادرة على تحوير التهاب الأمعاء المزمن8،9،10،11،12. النشاط البيولوجي لهرمون الاستروجين بوساطة مستقبلات الكونات ، من بينها مستقبلات الإستروجين النووية (ERs) ، أي ERα (جين ESR1)و ERα (جين ESR2)، وكذلك مستقبلات الإستروجين المقترنة بالبروتين G ، أي GPER (جين GPER1)، يشار إليها باسم ER13،14. هناك عدة طرق لتحديد مستوى مستقبلات هرمون الاستروجين، ولكن يمكن استخدام عدد قليل فقط لتصور لهم في الأمعاء.
الكيمياء المناعية (IHC) هي طريقة تستخدم على نطاق واسع في الدراسات السريرية والأساسية للكشف عن بعض المستضدات في الخلايا أو الأنسجة مع الأجسام المضادة المترافقة الفلوروكروم. يبدو أن الـ IHC طريقة مهمة في تصور بنية الأنسجة ، وكذلك في تحديد وتوطين بروتينات محددة ، والتي قد تكون حاسمة لفهم تطور التهاب القولون. هنا ، نقدم بروتوكولًا كاملًا ومصدقًا عليه للتصور المناعي الكيميائي لمستقبلات هرمون الاستروجين في الأمعاء باستخدام الفلورسينس المناعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت الدراسات على الحيوانات بموافقة اللجنة الأخلاقية المحلية (28/ŁB29/2016) وفقًا للتوجيه 2010/63/EU الصادر عن البرلمان الأوروبي ومجلس 22 سبتمبر 2010 والتوصيات المؤسسية.
1. TNBS الناجمة عن نموذج مورين من مرض كرون
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول ذكور BALB/ C الفئران وزنها 25-28 غرام. يتم إيواء الحيوانات في درجة حرارة ثابتة (22-24 درجة مئوية) والرطوبة النسبية 55 ± 5٪، والحفاظ عليها في دورة 12 ساعة ضوء / الظلام مع حرية الوصول إلى الكريات تشاو القياسية والصنبور الإعلانية libitum.
- ضع الماوس في غرفة الحث وأغلق الغطاء بإحكام. قم بتنويم الفأرة لفترة وجيزة مع الايزوفلوران (25% O2 مع معدل تدفق O2 عند 1.5-2 لتر/دقيقة).
ملاحظة: يجب أن يبقى معدل التنفس إيقاعيًا وأبطأ من المعتاد ويجب ألا يتغير استجابة ً لتحفيز ضار. - غرس 4 ملغ من TNBS في 0.1 مل من الإيثانول بنسبة 30٪ في 0.9٪ NaCl أو 0.1 مل من الإيثانول بنسبة 30٪ في 0.9٪ NaCl كتحكم في السيارة في القولون القاصي من خلال القسطرة.
ملاحظة: يجب إدخال القسطرة بعناية حوالي 3 سم في داخل السّجس. - مراقبة الماوس يوميا من اليوم الثاني إلى الثامن للمعلمات السريرية بما في ذلك وزن الجسم، ونزيف المستقيم، واتساق البراز والوفيات.
- في اليوم الثامن، قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم.
الشكل 1: الجدول الزمني لنموذج المورين الناجم عن TNBS لمرض كرون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. فصل وتقييم ماصوسكوبي القولون
ملاحظة: يوم واحد قبل انفصال القولون، تمييع 100 ميكرولتر من المضادات الحيوية في 1 مل من الفوسفات المُلّع بالمالحة (PBS) واتركه عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- تنظيف الجلد فوق البطن باستخدام الإيثانول 75٪ والشاش المعقم.
- قطع جدار البطن من عظم الثدي إلى جُرج باستخدام مقص معقمة وملاقط.
- قطع القولون في أقرب وقت ممكن إلى بشرة والمخنس.
- ضع القولون على طبق بيتري. قطع القولون على طول من داخل الرّقان إلى نهاية الأوسيّة. تنظيف وغسل القولون 2-4 مرات في محلول المضادات الحيوية الباردة-PBS.
- إجراء تقييم العياني باستخدام الفرجار وفقا للجدول 1.
ملاحظة: التصاق الأنسجة* وإحيائم / نزيف#، دم البراز# والإسهال# تخضع للتقييم البصري. * تقييم التصاق الأنسجة باستخدام مقياس من ثلاث نقاط (0: القولون دون التصاق الأنسجة، 1: القولون مع التصاق الأنسجة المعتدلة، 2: القولون مع التصاق الأنسجة واسعة)؛ #على أساس غياب (0) أو وجود (1) من الدم / النزيف، والبراز والإسهال.
| التصاق* | اُلياما/نزيف | دم البراز# | الإسهال# | طول القرحة | سمك القولون | طول القولون |
| نقاط (0 - 2) | نقاط (0 - 1) | نقاط (0 - 1) | نقاط (0 - 1) | سم/نقاط | مم/نقطة | سم/نقاط |
| 0 – غائبة | 0 – غائبة | 0 – غائبة | 0 – غائبة | 0.5 سم = 0.5 نقطة | n مم = n نقاط | 0 – lt;10% أقصر من عنصر التحكم |
| 1 - معتدل | 1 - الحاضر | 1 - الحاضر | 0.5 – البراز طفيف / فضفاض | 1 - من 10 إلى 20٪ أقصر من عنصر التحكم | ||
| 2 - الحاضر | 1 - الحاضر | 2 - أكثر من 20٪ أقصر من عنصر التحكم |
الجدول 1: تسجيل المناظير للأمعاء من الفئران مع نموذج TNBS الناجم عن مرض كرون.
- تحويل طول القرحة بالسنتيمتر إلى مقياس نقطة ، أي أن كل 0.5 سم من القرحة تحسب ك0.5 نقطة. تحويل سمك القولون في ملليمترات إلى مقياس نقطة، أي كل ن ملم يتوافق مع n نقطة.
- تحويل طول القولون في سنتيمتر على مقياس من ثلاث نقاط. يتم تقييم طول القولون التي تم الحصول عليها من كل فأر مع مرض كرون الناجم عن TNBS فيما يتعلق بمتوسط طول القولون لمجموعة التحكم (0: <10٪ أقصر من التحكم، 1: من 10 إلى 20٪ أقصر من التحكم، 2: أكثر من 20٪ أقصر ثم السيطرة).
- حساب مجموع النتيجة العيانية وفقا للمعادلة: مجموع درجة العيانية = التصاق (نقاط) + حُمية / نزف (نقاط) + دم البراز (نقاط) + الإسهال (نقاط) + طول القرحة (نقاط) + سمك القولون (نقاط) + طول القولون (نقاط).
3. إعداد عينة القولون
- قطع القولون إلى شظايا 1-2 سم ووضع كل على الإسفنج في كاسيت النسيجية المسمى بشكل مناسب.
ملاحظة: الإسفنج للكاسيت اتليسيوم منع القولون للطي أثناء الجفاف وحضانة في البارافين السائل. - وضع جزء القولون في 4٪ الفورمالديهايد واحتضان لمدة 24 ساعة على الأقل في 4 درجة مئوية.
- إعداد وبرمجة معالج الأنسجة ل1 ساعة من الحضانة في 50٪، 70٪، 90٪، 95٪، 100٪ الإيثانول، الإيثانول xylene/100٪ (1:1؛ v/v)، والزيلين فقط، وكذلك لما لا يقل عن 3 ساعة من الحضانة في البارافين السائل.
ملاحظة: يجب أن يتم الجفاف في تركيزات متزايدة من الإيثانول والزيلين، ولكن يمكن تعديل تركيز الإيثانول. يوصى بخليط الزيلين/الإيثانول ولكن ليس مطلوباً. - نقل جزء القولون إلى مربع النسيج ية ووضعها في معالج الأنسجة المبرمجة مسبقا.
- تشغيل معالج الأنسجة.
- بعد خطوات الحضانة ، ضع جزء القولون في قالب معدني بحيث يكون طرفا القولون في وضع منتصب وملء ثلث القالب بالبارافين السائل.
- ضع القالب في منطقة التبريد (-5 درجة مئوية) لبضع ثوان، ثم حرك القالب إلى منطقة الاحترار (70 درجة مئوية). مكان في الجزء السفلي من مربع النسيجية وتغطي كامل جزء القولون مع البارافين السائل.
- اترك القالب المعدني مع جزء القولون في البارافين لبضع دقائق في منطقة التبريد. إزالة القالب المعدني من كتلة البارافين واحتضان لمدة 24 ساعة على الأقل في 4 درجة مئوية.
- إزالة البارافين الزائدة من كتلة وإدراجه في ميكروتومي دوارة مؤتمتة بالكامل.
ملاحظة: قد يتم تخزين كتلة البارافين في -20 درجة مئوية لبضع دقائق قبل هذه الخطوة. - قطع جزء القولون إلى 5 مقاطع ميكرون.
- نقل قسم القولون إلى حمام مائي محمى مسبقا إلى 40 درجة مئوية.
- استخدم الشريحة الزجاجية المسماة لإزالة قسم القولون من الحمام المائي.
ملاحظة: تطفو أقسام القولون على الماء. وضع الشريحة الزجاجية المسمى في الماء تحت قسم القولون وسحب الشريحة الزجاجية بعناية. - اترك الشريحة الزجاجية لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. للتخزين على المدى الطويل، حافظ على الشريحة الزجاجية عند 4 درجات مئوية بعد 24 ساعة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة.
4. الكيمياء المناعية مع تلطيخ الفلورة المناعية
ملاحظة: لا تسمح المقطع القولون لتجف في أي خطوة أثناء الإجراء.
- إزالة البارافين عن طريق احتضان الشريحة الزجاجية في زيلين لمدة 5 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- ضع الشريحة الزجاجية في الإيثانول xylene/100٪ (1:1؛ v/v) لمدة 5 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- إعادة ترطيب قسم القولون في سلسلة من تركيزات الإيثانول المتناقصة ، أي 70 ٪ ، 50 ٪ ، 30 ٪ و 10 ٪ الإيثانول لمدة 5 دقيقة. كرر كل خطوة ثلاث مرات.
- شطف الشريحة الزجاجية تحت الماء الجاري لمدة 5 دقيقة.
- سخني محفظ استرجاع المستضد (10 مم من سيتر الصوديوم؛ 0.05% توين 20، درجة الحموضة 6.0) إلى 95-98 درجة مئوية وسخن الشريحة الزجاجية في محلول استرجاع مستضد الغليان لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: خطوة استرداد المستضد اختياري ولكن موصى به. يجب تحسين حل كشف القناع اعتمادًا على الأجسام المضادة المستخدمة في التجربة. - رسم دائرة حول قسم القولون باستخدام قلم كاره للماء.
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ولكن موصى بها. القلم الكاره للماء يمنع النفايات من الكواشف عن طريق الحفاظ على السائل المجمعة في حجم صغير داخل ملحوظ الدائرة. - احتضان القسم في محلول الماء 3٪ من بيروكسيديز الهيدروجين لمدة 10 دقيقة.
- غسل في محلول الغسيل (50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4؛ 150 mM NaCl؛ 0.05٪ Tween 20) لمدة 5 دقيقة.
- احتضان في محلول الحجب (5٪ مصل الماعز العادي؛ 50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4؛ 150 mM NaCl؛ 0.05٪ تريتون X-100) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: في محلول الحجب، يجب أن يكون المصل العادي من نفس النوع مثل الجسم المضاد الثانوي. في المراحل التي تتطلب الحضانة، ضع الشريحة الزجاجية في غرفة رطوبة لمنع التبخر المفرط. - قم بإزالة محلول الحجب وإضافة 20-50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية ضد ERα أو ERα أو GPER المخفف في 1٪ من الزلفير المصلي البقري مع 50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4، 150 mM NaCl، 0.05٪ تريتون X-100.
ملاحظة: يتم عرض المخففات الموصى بها للأجسام المضادة الأولية في الجدول 2.
| نوع الجسم المضاد | الأجسام المضادة ضد | الكلونية | الأنواع المضيفة | تفاعل الأنواع | التخفيف |
| الاساسي | ERα | بوليكلونال | الارنب | الانسان | 1:100 |
| الماوس | |||||
| السلحفاه | |||||
| كابيبارا | |||||
| ERа | بوليكلونال | الارنب | الانسان | ||
| القرد | |||||
| الفئران | |||||
| الماوس | |||||
| الاغنام | |||||
| خنزير | |||||
| GPER | بوليكلونال | الارنب | الانسان | ||
| الفئران | |||||
| الماوس | |||||
| الثانويه | DyLight 650 | بوليكلونال | الماعز | الارنب | 1:250 |
الجدول 2: خصائص الأجسام المضادة.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في الظلام.
- إزالة محلول الأجسام المضادة وغسل في محلول الغسيل (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% Tween 20) لمدة 5 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- أضف 20-50 ميكرولتر من DyLight 650 جسممضاد ثانوي مخفف في 1٪ من الزلال المصل البقري (يحتوي على 50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4، 150 mM NaCl، 0.05٪ تريتون X-100). احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع صبغة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
ملاحظة: يظهر التخفيف الموصى به للجسم المضاد الثانوي في الجدول 2. - إزالة محلول الأجسام المضادة وغسل في محلول الغسيل (50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4، 150 mM NaCl، 0.05٪ Tween 20) لمدة 5 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- إضافة 2٪ DiOC6 (3) المخفف في 50 mM تريس-HCl، ودرجة الحموضة 7.4، 150 mM NaCl واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- إزالة الحل وغسل في محلول الغسيل (50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4، 150 mM NaCl، 0.05٪ Tween 20) لمدة 5 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- إضافة بضع قطرات من السائل القائم على الجلسرين مع DAPI مباشرة على قسم القولون وتغطي بعناية مع شريحة غطاء. احتضان قسم القولون لمدة 24 ساعة على الأقل عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء عند تغطية الأنسجة مع شريحة الغطاء. - تحليل قسم القولون تحت المجهر البؤري يضم أهداف 20x أو 63x والغمر النفط باستخدام برامج مخصصة.
ملاحظة: يسرد الجدول 3 خصائص الفلوروكرومات المستخدمة في هذه الدراسة.
| نوع فلوروش | الطول الموجي (نانومتر) | صبغ | |
| الاثاره | الانبعاثات | ||
| DAPI | 405 | 460 – 480 | الازرق |
| DiOC6 (3) | 485 | 538 – 595 | الاخضر |
| DyLight 650 | 654 | 660 – 680 | الاحمر |
الجدول 3: خصائص الفلوروكرومات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خصائص تنظير القولون في الفئران مع مرض كرون الناجم عن TNBS
تظهر الصور التمثيلية للنقطتين المأخوذة من التحكم والفئران المعالجة من TNBS في الشكل 2. في الفئران التي لديها نموذج TNBS الناجم عن مرض كرون ، يتم تقليل طول القولون بينما يتم زيادة عرض القولون.
الشكل 2: القولون التمثيلي الذي تم الحصول عليه من فئران التحكم (التحكم) والفئران المعالجة من TNBS (TNBS). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وترد المعلمات العيانية المقيّمة في الجدول 1. إدارة TNBS للفئران يؤدي إلى زيادة في مجموع درجة المجسّة القولونية(الشكل 3A)وطول الالتهاب(الشكل 3B)نسبة إلى الفئران السيطرة.
الشكل 3: مجموع درجة العيانية من القولون (A) وإجمالي طول التهاب القولون (B) في الفئران السيطرة (السيطرة) والفئران TNBS المعالجة (TNBS). عشرة فئران لكل مجموعة تم إجراء تحليل إحصائي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه يليه اختبار نيومان-كوليس بعد الولادة. وترد البيانات على أنها تعني ± SEM؛ ***p < 0.001 TNBS مقابل التحكم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
التحقق من صحة الأجسام المضادة لمستقبلات هرمون الاستروجين
تم إجراء التحقق من خصوصية الأجسام المضادة لمستقبلات هرمون الاستروجين المستخدمة في الدراسة باستخدام خلايا MCF-7. تم اختيار خلايا MCF-7 على أساس دراسات سابقة حيث وجد العديد من الباحثين المستقلين أن مستقبلات هرمون الاستروجين موجودة في مستويات مرنا والبروتين. كما هو مبين في الشكل 4، تسمح الأجسام المضادة المستخدمة في الدراسة بالكشف عن كل من مستقبلات الإستروجين النووية ، أي ERα(الشكل 4A)و ERα(الشكل 4B)، وكذلك مستقبلات الإستروجين المرتبطة بالغشاء ، أي GPER(الشكل 4C)في خلايا MCF-7. يتم توطين مستقبلات هرمون الاستروجين النووي في السيتوبلازم والنوى، والإشارة من تلطيخ GPER موجودة فقط في السيتوبلازم من خلايا MCF-7.
الشكل 4: صور تمثيلية لتلطيخ الفلور المناعي لـ ERα (A) وERα (B) وGPER (C) في خلايا MCF-7. وصف مفصل في الجزء العلوي من الصور. مقياس القضبان: 10 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بالإضافة إلى السيطرة الإيجابية ، تم أيضًا إجراء تحكم سلبي ، حيث تم استخدام الجسم المضاد الثانوي فقط. ويبين الشكل 5 صورة لخلايا MCF-7 الملطخة فقط بأجسام مضادة ثانوية مترافقة مع الفلوروكروم والسائل القائم على الجلسرين مع DAPI.
الشكل 5: صورة تمثيلية لتلطيخ الفلور المناعي لـ DyLight 650 في خلايا MCF-7. يتوفر وصف إضافي فوق الصورة. مقياس القضبان: 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
توطين مستقبلات هرمون الاستروجين في نموذج المورين الناجم عن TNBS لمرض كرون
تم العثور على إشارة سيتوبلازمية قوية من ERα في قسم القولون التي تم الحصول عليها من الفئران والفئران السيطرة مع مرض كرون الناجم عن TNBS(الشكل 6A). ومع ذلك ، يبدو أن فقط في الأمعاء التي تم الحصول عليها من الفئران السيطرة كان ERα المترجمة في السيتوبلازم خلية الكبلي. كما كشف المجهر التكوالبؤر عن توطين السيتوبلازمي للERβ في قسم القولون من كل من التحكم والفئران المعالجة من TNBS(الشكل 6B). وبالمثل ، تم توثيق توطين السيتوبلازممنGPER في قسم القولون التي تم الحصول عليها من الفئران السيطرة والفئران TNBS المعالجة(الشكل 6C).
الشكل 6: صور تمثيلية لتلطيخ الفلور المناعي لـ ERα (A) وERа (B) وGPER (C) في قسم القولون التي تم الحصول عليها من فئران التحكم (التحكم) والفئران المعالجة من TNBS (TNBS). يتوفر وصف إضافي فوق كل صورة. أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر؛ أشرطة مقياس التكبير: 25 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من النماذج الحيوانية لفحص الفيزيولوجيا المرضية IBD ، بما في ذلك النماذج الوراثية أو المناعية أو العفوية ، وكذلك النماذج المستحثة كيميائيًا15. ومن بين عدة أنواع من النماذج الحيوانية من التهاب القولون، النماذج المستحثة كيميائيا مثل النموذج الناجم عن TNBS الموصوفة في هذا البروتوكول، غير مكلفة نسبيا وسهلة الحصول عليها. نموذج Murine الناجم عن TNBS من التهاب القولون لديه العديد من الأعراض السريرية المتعلقة بالأساس المرضي لمؤتمر نزع السلاح. تتميز الحيوانات التي بها التهاب القولون المستحث بتكوين البراز غير متناسق والإسهال الدموي وفقدان وزن الجسم. ومع ذلك ، هذا لا يعني أن هذا النموذج يمكن استخدامه لدراسة الـ ETiopathogenesis CD حصريًا. يوصى بالنموذج الذي يسببه TNBS واستخدامه بشكل شائع ، على سبيل المثال ، للفحص العلاجي المحتمل. في حالة التهاب القولون الناجم كيميائيا بعض النقاط الحرجة تحتاج إلى تسليط الضوء. وTNBS يجب أن تكون مخففة في الإيثانول، مما يزعج الحاجز المخاطي ويسمح TNBS لاختراق من خلال جدار الأمعاء والتفاعل مع البروتينات ذات الوزن الجزيئي عالية، مما يؤدي إلى استجابة المناعة الخلوية بوساطة22،16،,17. وينبغي تحسين كل من جرعة TNBS وتركيز الإيثانول لسلالة الماوس والوزن. قد تسبب جرعة TNBS وتركيز الإيثانول عالية جدًا في الوفيات المفرطة ، مما يمنع إجراء مزيد من التحليل. ومن ناحية أخرى، فإن جرعة TNBS وتركيز الإيثانول منخفضجداً قد يسبب انعدام الاستجابة وإطالة أمد التجربة دون داع.
يمكن فحص الأمعاء التي تم الحصول عليها من الفئران المصابة بالتهاب القولون الناجم عن TNBS ليس فقط على المستوى العياني ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، ولكن يمكن استخدامها أيضًا للتحليل الكيميائي الحيوي والجزيئي. أحد الأساليب المفيدة لدراسة كل من التعبير والتوطين هو تقنية هيهيتوموكيميائية مناعية مع استخدام الفلورالمناعي. ومع ذلك، يجب تضمين بعض الخطوات الهامة في إعداد وتنفيذ IHC لأقسام القولون المورين البارافين ثابت- الرسمية. الخطوة المحورية الأولى ، أي إعداد القولون يحدد جودة النتائج. وقت التثبيت، الذي يعتمد على سمك الأنسجة يجب أن يكون الأمثل. مرحلة أخرى حاسمة هي الجفاف ، والتي ينبغي أن تؤديها بلطف من قبل احتضان متعددة في زيادة تركيزات الإيثانول. وأخيرا، فإن تحديد المواقع الصحيح من القولون في القالب أمر ضروري لتوليد المقاطع العرضية الصحيحة. إعداد الأنسجة ليست القضية الهامة الوحيدة في الكيمياء الهيستوكيميائية المناعية. على الرغم من أن استرجاع المستضد اتّسال هو خطوة اختيارية، في المقاطع البارافين المثبتة في الشكلالرسمي يبدو من الضروري. أثناء التثبيت مع الفورمالديهايد، يتم إنشاء جسور الميثيلين بين البروتينات والبروتين عبر ربط أقنعة مواقعالمستضد18. هناك طريقتان رئيسيتان، تقوم على الحرارة أو الأنزيمية الناجمة عن (التربسين، البيبسين أو البروتينات K) استرجاع المستضد. استرجاع المستضد اتّسح الحرارة، الذي يتم ّ في المخزن المؤقت للسيترات الصوديوم، أو مُحَقّي حمض إثيليندياميناتتراستيك (EDTA) أو مُعَدّ ة تريس-EDTA، يُستخدم على نطاق أوسع لأنه لا يؤثر على مورفولوجيا الخلايا. يجب تعديل نوع المنضد والشروط تجريبيًا. تجدر الإشارة إلى أنه في بعض الأحيان يتم تحديد طريقة استرجاع المستضد من قبل الأجسام المضادة المستخدمة في التجارب. Permeabilization هو شرط يعتمد على المستضد فحصها، ومطلوب خصوصا للبروتينات داخل الخلايا. هناك العديد من النهج التي تستخدم المذيبات (الأسيتون أو الميثانول) وقاسية (تريتون X-100 أو NP-40) وكذلك خفيفة (Tween 20 أو saponin) المنظفات. في هذا البروتوكول اثنين من المنظفات، وتستخدم في وقت واحد، أي تريتون X-100 وTween 20 اعتمادا على الخطوة. وينبغي التأكيد على أن permeabilization يجب أن يكون الأمثل اعتمادا على الأجسام المضادة المستخدمة. إن حجب المواقع غير المحددة الملزمة مهم بشكل خاص أثناء التحليل الكيميائي المناعي. وتشمل حلول الحجب المصل العادي أو الزلال المصل البقري أو حتى حلول الحجب الجاهزة للاستخدام. ويوصي البروتوكول الحالي باستخدام كل من المصل العادي والألبومين المصل البقري. كما سبق ذكره في البروتوكول ، يجب أن يحتوي محلول الحجب على مصل طبيعي من نفس النوع مثل الجسم المضاد الثانوي.
وأخيراً، يمكن توسيع نطاق الكشف عن الـ IHC عن طريق الفلور المناعي كما هو موضح في هذا البروتوكول ليشمل تلطيخ البروتينات الأخرى في دراسات التفاعل بين البروتين والبروتين. عند البحث عن توطين البروتينات المختارة، يجب استيفاء شروط معينة. وينبغي اختيار الفلوروكرومات على أساس الإثارة وأطياف الانبعاثات. وهذه الخطوة حاسمة للقضاء على التداخلات الطيفية ويجب أن تؤدي في مرحلة التخطيط للتجربة. في هذا البروتوكول يتم استخدام ثلاثة فلوروكرومات، أي DyLight 650 الأجسام المضادة الثانوية، DAPI وDiOC6 (3). كما هو مبين في الجدول 3، لوحظ DyLight 650 المستخدمة للكشف عن مستقبلات هرمون الاستروجين كصبغة حمراء مع 654 نانومتر الإثارة والانبعاثات في 660-680 نانومتر. لوصمة الخلايا النوى والغشاء الداخلي، يستخدم DyLight 650 جنبا إلى جنب مع علامة DAPI النووية وDiOC6 (3) علامة الغشاء. ويلاحظ DAPI كصبغة زرقاء مع 405 نانومتر الإثارة والانبعاثات في 460-480 نانومتر. في المقابل ، لوحظ DiOC6 (3) كصبغة خضراء مع إثارة 485 نانومتر والانبعاثات في 538-595 نانومتر. وينبغي أن يؤديها تلطيخ البروتين المقبل بعد الخطوة 4.14., بدءا من خطوة حظر (انظر الخطوة 4.9.). بالنسبة لبروتينين ، يوصى باستخدام الأجسام المضادة الملطخة من أنواع مختلفة. هذا النهج يجعل من الممكن استبعاد ربط الأجسام المضادة الثانوية الصباغية إلى البروتين الملطخ سابقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد نُشر العمل بفضل الدعم المالي الذي تقدمه سلطات جامعة لودز: نائب رئيس الجامعة للبحث العلمي، ونائب رئيس الجامعة للتعاون الوطني والدولي، وعميد كلية البيولوجيا وحماية البيئة. تم دعم داميان جاسينك بمنح (2017/24/T/NZ5/00045 و 2015/17/N/NZ5/NZ5/00336) من المركز الوطني للعلوم، بولندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y.
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn's disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
