Summary
प्रोटोकॉल क्रोन की बीमारी का एक पूर्ण मान्य टीएनबी-प्रेरित मूत्र मॉडल और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के दृश्य के लिए तरीकों को प्रस्तुत करता है, जो पैराफिन में एम्बेडेड फॉर्मेलिन-फिक्स्ड कोलन वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करता है।
Abstract
क्रोन की बीमारी भड़काऊ आंत्र रोग का सबसे निदान प्रकार है। आंत में विकसित होने वाली पुरानी सूजन पेरिस्टैलसिस विकार और आंतों के म्यूकोसा के नुकसान की ओर ले जाती है और पेट के नियोप्लास्टिक परिवर्तन के बढ़ते जोखिम से जुड़ा हुआ प्रतीत होता है। साक्ष्य जमा करने से पता चलता है कि एस्ट्रोजन और एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स न केवल हार्मोन के प्रति संवेदनशील ऊतकों को प्रभावित करते हैं, बल्कि फेफड़ों या पेट जैसे एस्ट्रोजन से सीधे संबंधित अन्य ऊतक भी प्रभावित करते हैं। यहां, हम टीएनबीएस-प्रेरित क्रोन रोग के एक मूत्र मॉडल से प्राप्त कोलन में एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के सफल इम्यूनोफ्लोरेंस धुंधला के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। चूहों और आंत की तैयारी में क्रोन की बीमारी को शामिल करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है और साथ ही फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड आंत वर्गों का उपयोग करके एक कदम-दर-कदम इम्यूनोहिस्टो रासायनिक प्रक्रिया प्रदान की जाती है। वर्णित तरीके न केवल वीवो में एस्ट्रोजन रिसेप्टर डिटेक्शन और एस्ट्रोजन सिग्नलिंग जांच के लिए उपयोगी हैं बल्कि अन्य प्रोटीन के लिए भी लागू किए जा सकते हैं जो कोलाइटिस के विकास में शामिल हो सकते हैं।
Introduction
क्रोन की बीमारी (सीडी) एक भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) है जो पुरानी आंत की सूजन के रूप में प्रकट होती है। सीडी के एटिजियोलॉजी को खराब समझा जाता है, लेकिन कुछ प्रमुख कारक हैं जो सीडी विकास के लिए जिम्मेदार दिखाई देते हैं, जिनमें आंतों के माइक्रोबायोटा, और आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारक शामिल हैं, जैसे आहार या तनाव1। क्रोन की बीमारी के रोगजनन की बेहतर समझ के लिए, आंतों की सूजन के कई मॉडलों का उपयोग2,,3,,4,,55,6,,7किया गया है। इस लेख में, हम सीडी के 2,4,4,6-ट्रिनिटरोबेंजीन सल्फोनिक एसिड (टीएनबी) प्रेरित मूत्र मॉडल से प्राप्त परिणाम प्रस्तुत करते हैं।
यह दस्तावेज दिया गया है कि एस्ट्रोजन पुरानी आंतों की सूजन8,9,,10,,11,12को कम करने में सक्षम हैं । एस्ट्रोजन की जैविक गतिविधि को कॉग्नेट रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जिनमें से परमाणु एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स (ईआरएस), यानी, ईआरα (जीन ESR1)और ERο (जीन ESR2),साथ ही जी प्रोटीन-युग्मित एस्ट्रोजन रिसेप्टर, यानी, जीपीआर (जीन GPER1),झिल्ली-बाउंड ईआर13, 14,14के रूप में संदर्भित हैं। एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के स्तर का निर्धारण करने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन आंत में उन्हें कल्पना करने के लिए केवल कुछ ही उपयोग किया जा सकता है।
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) फ्लोरोक्रोम-कंजुगेड एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं या ऊतकों में कुछ एंटीजन का पता लगाने के लिए नैदानिक और बुनियादी अध्ययनों में एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। आईएचसी ऊतक संरचना दृश्य में एक महत्वपूर्ण तरीका लगता है, साथ ही विशिष्ट प्रोटीन की पहचान और स्थानीयकरण में, जो कोलाइटिस के विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। यहां, हम इम्यूनोलुओरेसेंस का उपयोग करके आंत में एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विजुअलाइजेशन के लिए एक पूर्ण और मान्य प्रोटोकॉल पेश करते हैं।
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Protocol
यूरोपीय संसद के निदेश 2010/63/ईयू और 22 सितंबर, २०१० की परिषद और संस्थागत सिफारिशों के अनुसार स्थानीय नैतिक समिति (28/ŁB29/2016) की सहमति से पशु अध्ययन किए गए ।
1. क्रोन रोग के टीएनबी-प्रेरित मूत्र मॉडल
नोट: यह प्रोटोकॉल 25-28 ग्राम वजनी पुरुष बालब/सी चूहों का उपयोग करता है। जानवरों को लगातार तापमान (22-24 डिग्री सेल्सियस) और सापेक्ष आर्द्रता 55 ± 5% पर रखा जाता है, और मानक चाउ छर्रों और नल के पानी विज्ञापन लिबिटमतक मुफ्त पहुंच के साथ 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र में बनाए रखा जाता है।
- माउस को इंडक्शन चैंबर में रखें और ढक्कन को कसकर बंद करें। आइसोफ्लोरीन (25% ओ2 1.5-2 L/min पर ओ2 प्रवाह दर के साथ) के साथ संक्षेप में माउस को एनेस्थेटाइज़ करें।
नोट: श्वसन दर लयबद्ध और सामान्य से धीमी रहना चाहिए और एक हानिकारक उत्तेजना के जवाब में नहीं बदलना चाहिए। - 0.9% नैनॉल में 0.9% एथेनॉल के 0.1 मिलीग्राम में 4 मिलीग्राम टीएनबी का उपयोग करें या 0.9% नैनॉल में 0.9% एथेनॉल का 0.1 मिलीग्राम एक कैथेटर के माध्यम से डिस्टल कोलन में वाहन नियंत्रण के रूप में।
नोट: कैथेटर को ध्यान से गुदा में लगभग 3 सेमी पेश किया जाना चाहिए। - शरीर के वजन, गुदा रक्तस्राव, मल स्थिरता और मृत्यु दर सहित नैदानिक मापदंडों के लिए दो से आठ दिन से दैनिक माउस की निगरानी करें।
- आठ दिन, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस इच्छामृत्यु।
चित्रा 1: क्रोन रोग के टीएनबी-प्रेरित मूत्र मॉडल के लिए टाइमलाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
2. कोलन का पृथक्करण और स्थूल मूल्यांकन
नोट: पेट जुदाई से एक दिन पहले, फॉस्फेट बफर लवण (पीबीएस) के 1 mL में एंटीबायोटिक के 100 μL पतला और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
- 75% इथेनॉल और बाँझ धुंध का उपयोग करपेट पर त्वचा को साफ करें।
- बाँझ कैंची और चिमटी का उपयोग कर के लिए छाती से गुदा करने के लिए पेट की दीवार काट ें।
- गुदा और सीकम के जितना संभव हो उतना क्लोज कोलन काट लें।
- पेट्री डिश पर कोलन रखें। गुदा से कोलन को सीकम अंत में काट लें। कोल्ड एंटीबायोटिक- पीबीएस सॉल्यूशन में कोलन को 2-4 बार साफ और धोएं।
- तालिका 1के अनुसार कैलिपर का उपयोग करके स्थूल मूल्यांकन करें।
नोट: ऊतक आसंजन* और erythema/रक्तस्राव#, मल रक्त# और दस्त# दृश्य मूल्यांकन के अधीन हैं । * ऊतक आसंजन तीन सूत्री पैमाने का उपयोग करमूल्यांकन (0: ऊतक आसंजन के बिना पेट, 1: मध्यम ऊतक आसंजन के साथ पेट, 2: व्यापक ऊतक आसंजन के साथ पेट); #एरिथेमा/हेमरेज, मल रक्त और दस्त की अनुपस्थिति (0) या उपस्थिति (1) के आधार पर।
| आसंजन* | एरिथेमा/नकसीर# | मल रक्त# | दस्त# | अल्सर की लंबाई | पेट की मोटाई | कोलन की लंबाई |
| अंक (0 - 2) | अंक (0 - 1) | अंक (0 - 1) | अंक (0 - 1) | मुख्यमंत्री/अंक | एमएम/अंक | मुख्यमंत्री/अंक |
| 0 - अनुपस्थित | 0 - अनुपस्थित | 0 - अनुपस्थित | 0 - अनुपस्थित | 0.5 सेमी = 0.5 अंक | एन मिमी = एन अंक | 0 - और एलटी;10% नियंत्रण से कम |
| 1 - मध्यम | 1 - वर्तमान | 1 - वर्तमान | 0.5 - मामूली/ढीला मल | 1 - नियंत्रण से 10 से 20% कम | ||
| 2 - वर्तमान | 1 - वर्तमान | 2 - नियंत्रण से 20% से अधिक कम |
तालिका 1: क्रोन की बीमारी के टीएनबी-प्रेरित मॉडल के साथ चूहों की आंत का स्थूल स्कोरिंग।
- सेंटीमीटर में अल्सर की लंबाई को प्वाइंट स्केल में कन्वर्ट करें, यानी हर 0.5 सेमी अल्सर को 0.5 पॉइंट के रूप में गिना जाता है। मिलीमीटर में कोलन की मोटाई को प्वाइंट स्केल में बदलें, यानी हर एन एमएम एन पॉइंट्स से मेल खाती है।
- कोलन की लंबाई को सेंटीमीटर में तीन सूत्री पैमाने पर परिवर्तित करें। टीएनबी-प्रेरित क्रोन रोग के साथ प्रत्येक माउस से प्राप्त पेट की लंबाई का मूल्यांकन नियंत्रण समूह (0: & 10% नियंत्रण से कम, 1: 10 से 20% नियंत्रण से कम, 2: 20% से अधिक कम तो नियंत्रण)।
- समीकरण के अनुसार कुल स्थूल स्कोर की गणना करें: कुल स्थूल स्कोर = आसंजन (अंक) + एरिथेमा/हेमरेज (अंक) + मल रक्त (अंक) + दस्त (अंक) + अल्सर की लंबाई (अंक) + पेट की मोटाई (अंक) + पेट की लंबाई (अंक)।
3. कोलन नमूना तैयार
- कोलन को 1-2 सेमी के टुकड़ों में काट लें और प्रत्येक को स्पंज पर उचित लेबल हिस्टोलॉजिकल कैसेट में रखें।
नोट: हिस्टोलॉजिकल कैसेट के लिए स्पंज तरल पैराफिन में निर्जलीकरण और ऊष्मायन के दौरान कोलन तह को रोकते हैं। - कोलन के टुकड़े को 4% फॉर्मलडिहाइड में रखें और कम से कम 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- 50%, 70%, 90%, 95%, 100% इथेनॉल, जाइलीन/100% इथेनॉल (1:1; v/v) में 1 एच ऊष्मायन के लिए ऊतक प्रोसेसर तैयार और प्रोग्राम करें, साथ ही केवल जाइलीन, साथ ही तरल पैराफिन में कम से कम 3 घंटे के ऊष्मायन के लिए।
नोट: इथेनॉल और जाइलीन की सांद्रता बढ़ाने में निर्जलीकरण किया जाना चाहिए, लेकिन इथेनॉल की एकाग्रता को संशोधित किया जा सकता है। जाइलीन/इथेनॉल मिश्रण की सिफारिश की जाती है लेकिन इसकी आवश्यकता नहीं होती है। - कोलन के टुकड़े को हिस्टोलॉजिकल बॉक्स में स्थानांतरित करें और पूर्व-प्रोग्राम किए गए ऊतक प्रोसेसर में रखें।
- टिश्यू प्रोसेसर चलाएं।
- ऊष्मायन चरणों के बाद, कोलन के टुकड़े को धातु के मोल्ड में रखें ताकि कोलन के दो सिरों को एक ईमानदार स्थिति में रखा जा सके और तरल पैराफिन के साथ मोल्ड का एक तिहाई भर ें।
- मोल्ड को कुछ सेकंड के लिए कूलिंग एरिया (-5 डिग्री सेल्सियस) में रखें और फिर मोल्ड को वार्मिंग एरिया (70 डिग्री सेल्सियस) में ले जाएं। हिस्टोलॉजिकल बॉक्स के निचले हिस्से में रखें और पूरे कोलन के टुकड़े को लिक्विड पैराफिन से कवर करें।
- ठंडा क्षेत्र में कुछ मिनट के लिए पैराफिन में पेट के टुकड़े के साथ धातु मोल्ड छोड़ दें। धातु मोल्ड को पैराफिन ब्लॉक से हटा दें और कम से कम 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- ब्लॉक से अतिरिक्त पैराफिन निकालें और इसे पूरी तरह से स्वचालित रोटरी माइक्रोटोम में डालें।
नोट: पैराफिन ब्लॉक को इस चरण से कुछ मिनट पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। - कोलन के टुकड़े को 5 माइक्रोन वर्गों में काट लें।
- कोलन सेक्शन को पानी के स्नान के लिए 40 डिग्री सेल्सियस तक पहले से स्थानांतरित करें।
- पानी के स्नान से कोलन अनुभाग को हटाने के लिए लेबल ग्लास स्लाइड का उपयोग करें।
नोट: पेट के वर्गपानी पर तैरते हैं। कॉलोल सेक्शन के नीचे पानी में लेबल ग्लास स्लाइड डालें और ग्लास स्लाइड को ध्यान से वापस लें। - कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए ग्लास स्लाइड छोड़ दें। लॉन्ग टर्म स्टोरेज के लिए कमरे के तापमान पर 24 घंटे के ऊष्मायन के बाद ग्लास स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
4. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री इम्यूनोहिस्टोसेस धुंधला के साथ
नोट: प्रक्रिया के दौरान किसी भी कदम पर कोलन अनुभाग को सूखने की अनुमति न दें।
- 5 मिन के लिए जाइलीन में ग्लास स्लाइड इनक्यूबेटकरके साथ पैराफिन निकालें इस स्टेप को तीन बार दोहराएं।
- कांच की स्लाइड को जाइलीन/100% इथेनॉल (1:1; v/v) में 5 मिन के लिए रखें । इस कदम को तीन बार दोहराएं ।
- कम इथेनॉल सांद्रता की एक श्रृंखला में कोलन अनुभाग को फिर से हाइड्रेट करें, यानी 70%, 50%, 30% और 5 मिन के लिए 10% इथेनॉल। प्रत्येक चरण को तीन बार दोहराएं।
- 5 मिन के लिए चल रहे पानी के नीचे ग्लास स्लाइड कुल्ला।
- प्रीहीट एंटीजन रिट्रीवल बफर (10 mM सोडियम साइट्रेट; 0.05% ट्वीन 20, पीएच 6.0) से 95-98 डिग्री सेल्सियस तक और 10 मिन के लिए उबलते एंटीजन रिट्रीवल सॉल्यूशन में ग्लास स्लाइड को गर्म करें।
नोट: एंटीजन पुनर्प्राप्ति कदम वैकल्पिक लेकिन अनुशंसित है। प्रयोग में इस्तेमाल किए जाने वाले एंटीबॉडी के आधार पर अनमास्किंग सॉल्यूशन को अनुकूलित किया जाना चाहिए। - हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके कोलन अनुभाग के चारों ओर एक चक्र बनाएं।
नोट: यह कदम वैकल्पिक है लेकिन अनुशंसित है। हाइड्रोफोबिक पेन सर्कल के अंदर एक छोटी मात्रा में जमा तरल को रखकर अभिकर्मकों की बर्बादी को रोकता है। - 10 मिन के लिए हाइड्रोजन पेरिक्सिडाज़ के 3% पानी के समाधान में अनुभाग को इनक्यूबेट करें।
- 5 मिन के लिए वॉशिंग सॉल्यूशन (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4; 150 एमएम एनसीएल; 0.05% ट्वीन 20) में धोएं।
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान (5% सामान्य बकरी सीरम; 50 एम एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4; 150 एमएम एनसीएल; 0.05% ट्राइटन एक्स-100) में इनक्यूबेट।
नोट: अवरुद्ध समाधान में, सामान्य सीरम माध्यमिक एंटीबॉडी के समान प्रजातियों से होना चाहिए। उन चरणों में जहां ऊष्मायन की आवश्यकता होती है, अत्यधिक वाष्पीकरण को रोकने के लिए ग्लास स्लाइड को आर्द्रता कक्ष में रखें। - अवरुद्ध समाधान निकालें और 50 एम ट्राई-एचसीएल, पीएच 7.4, 150 एमएम नैल, 0.05% ट्राइटन एक्स-100 के साथ 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन में पतला ERα, ERο या GPER के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के 20-50 μL जोड़ें।
नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी के अनुशंसित कमजोर पड़ने टेबल 2में दिखाए जाते हैं ।
| एंटीबॉडी प्रकार | एंटीबॉडी के खिलाफ | क्लोनलिटी | मेजबान प्रजातियां | प्रजातियों की प्रतिक्रियाशीलता | कमजोर पड़ना |
| प्राथमिक | ईआरα | पॉलीक्लोनल | खरगोश | मानव | 1:100 |
| माउस | |||||
| कछुआ | |||||
| कैपीबारा | |||||
| ईआरए | पॉलीक्लोनल | खरगोश | मानव | ||
| बंदर | |||||
| चूहा | |||||
| माउस | |||||
| भेड़ | |||||
| सुअर | |||||
| गपर | पॉलीक्लोनल | खरगोश | मानव | ||
| चूहा | |||||
| माउस | |||||
| द्वितीयक | डीलाइट 650 | पॉलीक्लोनल | बकरी | खरगोश | 1:250 |
तालिका 2: एंटीबॉडी की विशेषताएं।
- अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट।
- एंटीबॉडी समाधान निकालें और धोने के समाधान में धोने (५० mM Tris-HCl, पीएच ७.४; १५० mM NaCl; ०.०५% ट्वीन 20) के लिए 5 मिन । इस कदम को तीन बार दोहराएं ।
- 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (50 एम एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 150 एमएम नैल, 0.05% ट्राइटन एक्स-100) में पतला DyLight 650 माध्यमिक एंटीबॉडी के 20-50 माइक्रोन जोड़ें। माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए रंगे के साथ संयुग्मित।
नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी की अनुशंसित कमजोर पड़ने तालिका 2में दिखाया गया है । - एंटीबॉडी समाधान निकालें और धोने के समाधान में धोने (50 एमएम Tris-HCl, पीएच 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% ट्वीन 20) 5 मिन के लिए। इस कदम को तीन बार दोहराएं।
- 50 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 150 मीटर नैक में 2% DiOC6 (3) पतला और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट जोड़ें।
- 5 मिन के लिए समाधान निकालें और वॉशिंग सॉल्यूशन (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 150 एमएम एनएसीएल, 0.05% ट्वीन 20) में धोएं। इस कदम को तीन बार दोहराएं।
- सीधे कोलन सेक्शन पर DAPI के साथ ग्लाइसेरोल-आधारित तरल की कुछ बूंदें जोड़ें और कवर स्लाइड के साथ ध्यान से कवर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 24 घंटे के लिए कोलन अनुभाग इनक्यूबेट करें।
नोट: कवर स्लाइड के साथ ऊतक को कवर करते समय हवा के बुलबुले से बचें। - समर्पित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 20x या 63x उद्देश्यों और तेल विसर्जन की विशेषता वाले कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत कोलन अनुभाग का विश्लेषण करें।
नोट: तालिका 3 इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोक्रोम की विशेषताओं को सूचीबद्ध करती है।
| फ्लोरोहोम प्रकार | तरंगदैर्ध्य (एनएम) | डाई | |
| उत्तेजना | उत्सर्जन | ||
| डीपीआई | 405 | 460 – 480 | नीला |
| DiOC6 (3) | 485 | 538 – 595 | हरा |
| डीलाइट 650 | 654 | 660 – 680 | लाल |
तालिका 3: फ्लोरोक्रोम की विशेषताएं।
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Representative Results
टीएनबी-प्रेरित क्रोन रोग के साथ चूहों में कोलोन की स्थूल विशेषताएं
नियंत्रण और टीएनबी-इलाज चूहों से लिया कोलन की प्रतिनिधि छवियों चित्र 2में दिखाया गया है । क्रोन की बीमारी के टीएनबी-प्रेरित मॉडल वाले चूहों में, कोलन की लंबाई कम हो जाती है जबकि कोलन की चौड़ाई बढ़ जाती है।
चित्रा 2: नियंत्रण चूहों (नियंत्रण) और टीएनबी-इलाज चूहों (टीएनबी) से प्राप्त प्रतिनिधि कोलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
मूल्यांकन किए गए स्थूल मापदंड तालिका 1में दिए गए हैं । चूहों के लिए टीएनबी का प्रशासन नियंत्रण चूहों के सापेक्ष कुल उपनिवेश स्थूल स्कोर(चित्रा 3ए)और सूजन लंबाई(चित्रा 3बी)में वृद्धि की ओर जाता है।
चित्रा 3: नियंत्रण चूहों (नियंत्रण) और टीएनबी-इलाज चूहों (टीएनबी) में कोलन (ए) और कुल उपनिवेश सूजन लंबाई (बी) का कुल स्थूल स्कोर। प्रति समूह दस चूहे। न्यूमैन-केल्स पोस्ट-हॉक टेस्ट के बाद एक-तरफा एनोवा का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया। डेटा का मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; ***पी एंड एलटी; 0.001 टीएनबी बनाम नियंत्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
एस्ट्रोजन रिसेप्टर एंटीबॉडी सत्यापन
अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एस्ट्रोजन रिसेप्टर एंटीबॉडी की विशिष्टता का सत्यापन एमसीएफ-7 कोशिकाओं का उपयोग करके किया गया था। एमसीएफ-7 कोशिकाओं को पिछले अध्ययनों के आधार पर चुना गया जिसमें कई स्वतंत्र शोधकर्ताओं ने पाया कि एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर पर मौजूद हैं । जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है, अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी दोनों परमाणु एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स यानी ईआरα(चित्रा 4ए)और ईआरआर(चित्रा 4बी)के साथ-साथ झिल्ली से बंधे एस्ट्रोजन रिसेप्टर, यानी एमसीएफ-7 कोशिकाओं में जीपर(चित्रा 4सी)का पता लगाने की अनुमति देते हैं। परमाणु एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स साइटोप्लाज्म और नाभिक में स्थानीयकृत हैं, और GPER धुंधला से संकेत केवल MCF-7 कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में मौजूद है ।
चित्र4: एमसीएफ-7 कोशिकाओं में ERα (A), ERο (बी) और GPER (सी) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला की प्रतिनिधि छवियां । छवियों के शीर्ष पर विस्तृत विवरण। स्केल बार: 10 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
सकारात्मक नियंत्रण के अलावा, एक नकारात्मक नियंत्रण भी किया गया था, जिसमें केवल माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। चित्रा 5 एमसीएफ-7 कोशिकाओं की एक छवि से पता चलता है केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग फ्लोरोक्रोम और Glycerol आधारित तरल के साथ DAPI के साथ ।
चित्रा 5: एमसीएफ-7 कोशिकाओं में DyLight 650 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला की प्रतिनिधि छवि। छवि के ऊपर अतिरिक्त विवरण उपलब्ध है। स्केल बार: 20 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
क्रोन की बीमारी के टीएनबी-प्रेरित मूत्र मॉडल में एस्ट्रोजन रिसेप्टर स्थानीयकरण
ERα का एक मजबूत साइटोप्लाज्मिक संकेत टीएनबीएस-प्रेरित क्रोन रोग(चित्रा 6ए)के साथ नियंत्रण चूहों और चूहों से प्राप्त पेट अनुभाग में पाया गया था। हालांकि, ऐसा लगता है कि केवल नियंत्रण चूहों से प्राप्त आंत में गोबलेट सेल साइटोप्लाज्म में ERα स्थानीयकृत था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने नियंत्रण और टीएनबी-इलाज चूहों(चित्रा 6बी)दोनों के कोलन अनुभाग में ईआरए के साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण का भी खुलासा किया। इसी तरह, जीपर के साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण को नियंत्रण चूहों और टीएनबी-इलाज चूहों(चित्रा 6सी)से प्राप्त पेट अनुभाग में प्रलेखित किया गया था।
चित्र6: नियंत्रण चूहों (नियंत्रण) और टीएनबी-इलाज चूहों (टीएनबी) से प्राप्त पेट अनुभाग में ईआरα (ए), ईआरए (बी) और GPER (सी) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला की प्रतिनिधि छवियां। प्रत्येक छवि के ऊपर अतिरिक्त विवरण उपलब्ध है। स्केल बार: 50 माइक्रोन; ज़ूम स्केल बार: 25 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
आईबीडी रोगविज्ञान परीक्षा के लिए कई पशु मॉडल हैं, जिनमें आनुवंशिक, इम्यूनोलॉजिकल या सहज मॉडल, साथ ही रासायनिक रूप से प्रेरित मॉडलशामिलहैं। कोलाइटिस के कई प्रकार के पशु मॉडलों में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित टीएनबी-प्रेरित मॉडल जैसे रासायनिक रूप से प्रेरित मॉडल, अपेक्षाकृत सस्ती और प्राप्त करने में आसान हैं। कोलाइटिस के टीएनबी-प्रेरित मूत्र मॉडल में सीडी के रोग आधार से संबंधित कई नैदानिक लक्षण हैं। प्रेरित कोलाइटिस वाले जानवरों को असंगत मल गठन, खूनी दस्त और शरीर के वजन की हानि की विशेषता है। हालांकि, इसका मतलब यह नहीं है कि इस मॉडल का उपयोग विशेष रूप से सीडी एटिओपैथोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। टीएनबी-प्रेरित मॉडल की सिफारिश की जाती है और आमतौर पर संभावित चिकित्सीय स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है। रासायनिक रूप से प्रेरित कोलाइटिस के मामले में कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं पर प्रकाश डाला जाना चाहिए। टीएनबी को इथेनॉल में पतला किया जाना चाहिए, जो म्यूकोसल बाधा को परेशान करता है और टीएनबी को आंत की दीवार के माध्यम से प्रवेश करने और उच्च आणविक वजन प्रोटीन के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है, जिससे सेलुलर मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया2,,16,,17होती है। माउस तनाव और वजन के लिए टीएनबी खुराक और इथेनॉल एकाग्रता दोनों को अनुकूलित किया जाना चाहिए। बहुत अधिक टीएनबी खुराक और इथेनॉल एकाग्रता अत्यधिक मृत्यु दर का कारण बन सकती है, जो आगे के विश्लेषण को रोकती है। दूसरी ओर, बहुत कम टीएनबी खुराक और इथेनॉल एकाग्रता खराब प्रतिक्रिया का कारण बन सकती है और अनावश्यक रूप से प्रयोग को लम्बा कर सकती है।
टीएनबी-प्रेरित कोलाइटिस के साथ चूहों से प्राप्त आंत की जांच न केवल स्थूल स्तर पर की जा सकती है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, बल्कि इसका उपयोग जैव रासायनिक और आणविक विश्लेषण के लिए भी किया जा सकता है। अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण दोनों का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण इम्यूनोहिस्टोकेमिकल तकनीक है जिसमें इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग किया जाता है। हालांकि, फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड मूत्र पेट के वर्गों के लिए आईएचसी की तैयारी और कार्यान्वयन में कुछ महत्वपूर्ण कदमों को शामिल किया जाना चाहिए। पहला निर्णायक कदम यानी कोलन की तैयारी परिणामों की गुणवत्ता तय करती है। निर्धारण समय, जो ऊतक मोटाई पर निर्भर करता है अनुकूलित किया जाना है। एक अन्य महत्वपूर्ण चरण निर्जलीकरण है, जिसे इथेनॉल की सांद्रता बढ़ाने में कई ऊष्मायनों द्वारा धीरे से किया जाना चाहिए। अंत में, सही क्रॉस-सेक्शन उत्पन्न करने के लिए मोल्ड में कोलन की सही स्थिति आवश्यक है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में टिश्यू तैयारकरना एकमात्र महत्वपूर्ण मुद्दा नहीं है। हालांकि एंटीजन पुनर्प्राप्ति एक वैकल्पिक कदम है, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों में यह आवश्यक प्रतीत होता है। फॉर्मलडिहाइड के साथ निर्धारण के दौरान, प्रोटीन के बीच मेथिलीन पुल उत्पन्न होते हैं और प्रोटीन क्रॉसलिंकिंग मास्क एंटीजन साइट्स18। गर्मी या एंजाइमैटिक-प्रेरित (ट्राइप्सिन, पेप्सिन या प्रोटीनके) एंटीजन रिट्रीवल के आधार पर दो प्रमुख तरीके हैं। सोडियम साइट्रेट बफर, एथिलीनडायमिनेटेट्राएटिक एसिड (ईडीटीए) बफर या ट्रिस-ईडीटीए बफर में किए गए हीट-प्रेरित एंटीजन रिट्रीवल, अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि यह सेल आकृति विज्ञान को प्रभावित नहीं करता है। एंटीजन तेज के प्रकार और शर्तों को प्रायोगिक रूप से समायोजित किया जाना चाहिए। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कभी-कभी एंटीजन पुनर्प्राप्ति विधि प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी द्वारा निर्धारित की जाती है। Permeabilization एक जांच एंटीजन पर निर्भर हालत है, और विशेष रूप से इंट्रासेलुलर प्रोटीन के लिए आवश्यक है । ऐसे कई दृष्टिकोण हैं जो सॉल्वैंट्स (एसीटोन या मेथनॉल) और कठोर (ट्राइटन एक्स-100 या एनपी-40) के साथ-साथ हल्के (ट्वीन 20 या सैपोनिन) डिटर्जेंट का उपयोग करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में दो डिटर्जेंट का इस्तेमाल एक साथ किया गया, यानी ट्राइटन एक्स-100 और ट्वीन 20 स्टेप के आधार पर। इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के आधार पर परमीबिलाइजेशन को अनुकूलित किया जाना चाहिए। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के दौरान गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। अवरुद्ध समाधानों में सामान्य सीरम, गोजातीय सीरम एल्बुमिन या यहां तक कि रेडी-टू-यूज ब्लॉकिंग समाधान शामिल हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल सामान्य सीरम और गोजातीय सीरम एल्बुमिन दोनों के उपयोग की सिफारिश करता है। जैसा कि प्रोटोकॉल में पहले से ही उल्लेख किया गया है, अवरुद्ध समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी के समान प्रजातियों से सामान्य सीरम होना चाहिए।
अंत में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा आईएचसी का पता लगाने को प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन अध्ययनों में अन्य प्रोटीन को धुंधला करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। चयनित प्रोटीन के सहस्थानीयकरण की तलाश करते समय, कुछ शर्तों को पूरा किया जाना चाहिए। उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के आधार पर फ्लोरोक्रोम का चयन किया जाना चाहिए। यह कदम स्पेक्ट्रल ओवरलैप को खत्म करने के लिए महत्वपूर्ण है और प्रयोग के योजना के चरण में प्रदर्शन किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल में तीन फ्लोरोक्रोम यानी डाइलाइट 650 सेकेंडरी एंटीबॉडी, डीपीआई और डीओओसी 6 (3) का इस्तेमाल किया जाता है। जैसा कि टेबल 3में दिखाया गया है, एस्ट्रोजन रिसेप्टर डिटेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले DyLight 650 को 660-680 एनएम पर 654 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ लाल रंग के रूप में मनाया जाता है। सेल नाभिक और आंतरिक झिल्ली दाग करने के लिए, DyLight 650 DAPI परमाणु मार्कर और DiOC6 (3) झिल्ली मार्कर के साथ प्रयोग किया जाता है। DAPI 460-480 एनएम पर 405 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ एक नीले रंग के रूप में मनाया जाता है। बदले में, DiOC6 (3) 538-595 एनएम पर 485 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ एक हरे रंग के रंग के रूप में मनाया जाता है। अगले प्रोटीन का धुंधला कदम 4.14 के बाद किया जाना चाहिए, अवरुद्ध कदम के साथ शुरू (चरण 4.9 देखें.) । दो प्रोटीन के लिए, विभिन्न प्रजातियों से धुंधला एंटीबॉडी का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यह दृष्टिकोण पहले से दाग प्रोटीन के लिए रंगे-conjugated माध्यमिक एंटीबॉडी के बंधन को बाहर करना संभव बनाता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम लॉड्ज़ प्राधिकरणों के विश्वविद्यालय की वित्तीय सहायता के लिए धन्यवाद प्रकाशित किया गया था: वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए वाइस-रेक्टर, राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय सहयोग के लिए वाइस-रेक्टर और जीव विज्ञान और पर्यावरण संरक्षण संकाय के डीन। डैमियन जैसेनिक को राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र, पोलैंड से अनुदान (2017/24/T/NZ5/00045 और 2015/17/N/NZ5/00336) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
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