Visualisation des récepteurs d’oestrogène dans les colons des souris atteints de la maladie de Crohn induite par le TNBS à l’aide de l’immunofluorescence

Summary

Le protocole présente un modèle murine TNBS-induit complet de Crohn' la maladie de s et des méthodes pour visualiser des récepteurs d’oestrogène par immunohistochemistry utilisant l’immunofluorescence des sections formelles-fixes de colon incorporées dans la paraffine.

Abstract

La maladie de Crohn est le type le plus diagnostiqué de maladie inflammatoire de l’intestin. L’inflammation chronique se développant dans l’intestin mène au désordre de périsphyse et aux dommages de la muqueuse intestinale et semble être associée à un risque accru de transformation néoplastique du côlon. L’accumulation de preuves indique que les œstrogènes et les récepteurs d’oestrogène affectent non seulement les tissus hormono-sensibles, mais aussi d’autres tissus non directement liés aux oestrogènes, tels que les poumons ou les colons. Ici, nous décrivons le protocole pour la coloration réussie d’immunofluorescence des récepteurs d’oestrogène dans le côlon obtenu d’un modèle murin de Crohn-induit de TNBS' la maladie de s. Un protocole détaillé pour l’induction de crohn' la maladie de s chez la souris et la préparation d’intestin est fourni aussi bien qu’une procédure immunohistochimique étape par étape utilisant des sections formelles-définies d’intestin paraffin-embedded. Les méthodes décrites sont non seulement utiles pour la détection des récepteurs d’oestrogène et l’étude de signalisation d’oestrogène in vivo mais peuvent également être appliquées pour d’autres protéines qui peuvent être impliquées dans le développement de la colite.

Introduction

Crohn' la maladie de s (CD) est une maladie inflammatoire d’entrailles (IBD) manifestée comme inflammation chronique d’intestin. L’étiologie du CD est mal comprise, mais il ya quelques facteurs majeurs qui semblent être responsables du développement de CD, y compris le microbiote intestinal, et des facteurs génétiques et environnementaux, tels que l’alimentation ou le stress¹. Pour une meilleure compréhension de la pathogénie de la maladie de Crohn, plusieurs modèles d’inflammation intestinale ont été utilisés^2,3,4,5<....

Protocol

Des études sur les animaux ont été menées avec le consentement du Comité local d’éthique (28/29/2016) conformément à la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010, ainsi que des recommandations institutionnelles.

1. Modèle murin induit par TNBS de la maladie de Crohn

REMARQUE : Ce protocole utilise des souris BALB/C mâles pesant 25-28 g. Les animaux sont logés à une température constante (22-24 oC) et, humidité relative 55 à 5%, et maintenus dans un cycle léger/obscurité de 12 h avec un accès gratuit aux granulés standard et à l’eau du robinet ad libitum.

1. Plac....

Results

Caractéristiques macroscopiques des colons chez les souris atteintes de la maladie de Crohn induite par TNBS
Des images représentatives des colons prélevés sur le contrôle et des souris traitées par TNBS sont montrées dans la figure 2. Chez les souris avec un modèle TNBS-induit de la maladie de Crohn, la longueur du côlon est réduite tandis que la largeur du côlon est augmentée.

.......

Discussion

Il existe de nombreux modèles animaux pour l’examen de pathophysiologie des MII, y compris les modèles génétiques, immunologiques ou spontanés, ainsi que les modèles chimiquement induits¹⁵. Parmi les plusieurs types de modèles animaux de colite, les modèles induits chimiquement tels que le modèle induit par TNBS décrit dans ce protocole, sont relativement peu coûteux et faciles à obtenir. Le modèle murine TNBS-induit de la colite a plusieurs symptômes cliniques liés à la base pathologique de CD. L.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
BALB/C	souris Université de Lodz	NA
strong>Equipment
Caliper	VWR	62379-531
Bloc de carton	NA	NA
Microscope confocal - TCS SP8	Leica Biosystems	NA
Microtome rotatif entièrement automatisé - RM2255	Leica Biosystems	NA
Lame de verre	Thermo Scientific	J1800BMNT
Module d’enrobage de paraffine chauffée - EG1150 H	Leica Biosystems	NA
Boîte histologique	Marfour	LN.138747
Stylo hydrophobe	Sigma-Aldrich	Z377821
Balance de laboratoire	Radwag	WL-104-0048
Logiciel LAS X	Leica Biosystems	NA
Moule métallique	Marfour	CP.5105
Gaze stérile	NA	NA
Ciseaux stériles	NA	NA
Pince à épiler stérile	NA	NA
Processeur de tissus - TP1020	Leica Biosystems	NA
strong>Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzène sulfonic	Sigma-Aldrich	92822
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A3294
DiOC6 (3)	Sigma-Aldrich	318426
DyLight 650 anticorps secondaire	Abcam	ab96886
ER&alpha ; anticorps primaire	Abcam	ab75635
ER&beta ; anticorps primaire	Abcam	ab3576
Éthanol	Avantor Performance Materials Pologne	396480111
Formaldéhyde	Avantor Performance Materials Poland	432173111
GPER anticorps primaire	Abcam	ab39742
Acide chlorhydrique	Avantor Performance Materials Pologne	575283421
Hydrogen peroxidase	Avantor Performance Materials Poland	885193111
isoflurane (forane)	Baxter	1001936040
Sérum de chèvre normal	Gibco	16210064
Paraffine	Leica Biosystems	39602012
Boîte de Pétrie	Nest	Scientific 705001
Tampon phosphate salin	Sigma-Aldrich	P3813
Saline physiologique	Sigma-Aldrich	7982
Primocin (antibiotique)	Invitrogen	ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant avec DAPI (liquide à base de glycérol avec DAPI)	Invitrogen	P36971
Chlorure de sodium	Chempur	WE/231-598-3
Citrate de sodium	Avantor Performance Materials Pologne	795780429
Tris	Avantor Performance Materials Poland	853470115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Xylene	Avantor Performance Matériaux Pologne	BA0860119