Summary
Protokollet presenterar en komplett validerad TNBS-inducerad murine modell av Crohns sjukdom och metoder för visualisering av östrogenreceptorer av immunohistochemistry med immunofluorescens av formalin-fast kolon sektioner inbäddade i paraffin.
Abstract
Crohns sjukdom är den mest diagnostiserade typen av inflammatorisk tarmsjukdom. Kronisk inflammation utvecklas i tarmen leder till peristaltik sjukdom och skador på tarmslemhinnan och verkar vara associerad med en ökad risk för kolon neoplastisk omvandling. Ackumulerande bevis tyder på att östrogener och östrogenreceptorer påverkar inte bara hormonkänsliga vävnader, men också andra vävnader som inte är direkt relaterade till östrogener, såsom lungorna eller tjocktarmen. Här beskriver vi protokollet för framgångsrik immunofluorescens färgning av östrogenreceptorer i kolon som erhållits från en murine modell av TNBS-inducerad Crohns sjukdom. Ett detaljerat protokoll för induktion av Crohns sjukdom hos möss och tarmberedning tillhandahålls samt ett steg-för-steg immunohistochemical förfarande med hjälp av formalin-fast paraffin-inbäddade tarmar sektioner. De beskrivna metoderna är inte bara användbara för östrogenreceptordetektion och östrogensignaleringsundersökning in vivo men kan också tillämpas på för andra proteiner som kan vara involverade i utvecklingen av kolit.
Introduction
Crohns sjukdom (CD) är en inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) manifesteras som kronisk tarminflammation. Etiologin av CD är dåligt förstås, men det finns några viktiga faktorer som verkar vara ansvarig för CD utveckling, inklusive intestinala mikrobiota, och genetiska och miljömässiga faktorer, såsom kost eller stress1. För en bättre förståelse av patogenesen vid Crohns sjukdom har flera modeller av tarminflammation använts2,3,44,5,6,7. I den här artikeln presenterar vi resultat från en 2,4,6-trinitrobensen sulfonsyra (TNBS)-inducerad murine modell av CD.
Det har dokumenterats att östrogener kan modulera kronisk tarminflammation8,9,10,11,12. Den biologiska aktiviteten hos östrogener medieras av cognate receptorer, bland vilka är nukleära östrogenreceptorer (ERs), dvs ERα (gen ESR1)och ERβ (gen ESR2), samt G protein-kopplade östrogenreceptorn, dvs GPER (gen GPER1), kallad membran-bundna ER13,14. Det finns flera metoder för att bestämma nivån av östrogenreceptorer, men endast ett fåtal kan användas för att visualisera dem i tarmen.
Immunohistochemistry (IHC) är en allmänt använd metod i kliniska och grundläggande studier för påvisande av vissa antigener i celler eller vävnader med fluorokromekonjugerade antikroppar. IHC verkar vara en viktig metod i vävnadsstruktur visualisering, liksom i identifiering och lokalisering av specifika proteiner, vilket kan vara avgörande för att förstå utvecklingen av kolit. Här presenterar vi ett komplett och validerat protokoll för immunohistochemical visualisering av östrogenreceptorer i tarmen med hjälp av immunfluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstudier genomfördes med samtycke från den lokala etiska kommittén (28/ŁB29/2016) i enlighet med Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 och institutionella rekommendationer.
1. TNBS-inducerad murine modell av Crohns sjukdom
OBS: Detta protokoll använder hane BALB/C möss som väger 25-28 g. Djuren hålls vid en konstant temperatur (22-24 °C) och, relativ fuktighet 55 ± 5%, och underhålls i en 12 h ljus/mörk cykel med fri tillgång till standard chow pellets och kranvatten ad libitum.
- Placera musen i induktionskammaren och stäng locket ordentligt. Sövra musen kort med isoflurane (25% O2 med O2 flöde på 1,5-2 L/min).
OBS: Andningsfrekvensen bör förbli rytmisk och långsammare än normalt och bör inte förändras som svar på en skadlig stimulans. - Ingjuta 4 mg TNBS i 0,1 ml 30% etanol i 0,9% NaCl eller 0,1 ml 30% etanol i 0,9% NaCl som ett fordon kontroll i distala kolon genom en kateter.
OBS: Katetern ska försiktigt införas cirka 3 cm i anusen. - Övervaka musen dagligen från dag två till åtta för kliniska parametrar inklusive kroppsvikt, rektalblödning, avföring konsistens och dödlighet.
- På dag åtta, avliva musen genom livmoderhalscancer förskjutning.
Figur 1: Tidslinje för TNBS-inducerad murine modell av Crohns sjukdom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Separation och makroskopiska utvärdering av kolon
OBS: En dag före kolonseparation, späd 100 μL antibiotikum i 1 ml fosfatbuffertnos (PBS) och låt stå vid 4 °C över natten.
- Rengör huden över buken med 75% etanol och steril gasväv.
- Skär bukväggen från bröstben till anus med steril sax och pincett.
- Skär av tjocktarmen så nära anus och cecum.
- Placera tjocktarmen på Petriskålen. Skär kolon längs från anus i cecum slutet. Rengör och tvätta tjocktarmen 2-4 gånger i kall antibiotika-PBS lösning.
- Utför makroskopiska utvärdering med hjälp av ett bromsok enligt tabell 1.
OBS: Vävnad vidhäftning* och erytem/blödning#, fekalblod# och diarré# är föremål för visuell bedömning. * Vävnadvidhäftning utvärdera med hjälp av en tregradig skala (0: kolon utan vävnadvidhäftning, 1: kolon med måttlig vävnadvidhäftning, 2: kolon med omfattande vävnad vidhäftning); #baserat på frånvaro (0) eller närvaro (1) av erytem/blödning, fekalblod och diarré.
| Vidhäftande* | Erytem/ blödning# | Fekalblod# | Diarré# | Sårlängd | Kolontjocklek | Kolonlängd |
| punkterna (0 – 2) | punkterna (0 – 1) | punkterna (0 – 1) | punkterna (0 – 1) | cm/punkter | mm/punkter | cm/punkter |
| 0 – frånvarande | 0 – frånvarande | 0 – frånvarande | 0 – frånvarande | 0,5 cm = 0,5 poäng | n mm = n punkter | 0 – <10% kortare än kontrollen |
| 1 – måttlig | 1 – närvarande | 1 – närvarande | 0,5 – lätt/lös pall | 1 – från 10 till 20 % kortare än kontrollen | ||
| 2 – närvarande | 1 – närvarande | 2 – över 20 % kortare än kontrollen |
Tabell 1: Makroskopiska poäng sättning av tarmen hos möss med TNBS-inducerad modell av Crohns sjukdom.
- Konvertera längden på såret i centimeter till en gradig skala, dvs varje 0,5 cm sår räknas som 0,5 punkt. Konvertera kolons tjocklek i millimeter till en punktskala, dvs varje n mm motsvarar n punkter.
- Konvertera kolons längd i centimeter på en tregradig skala. Längden på kolon som erhållits från varje mus med TNBS-inducerad Crohns sjukdom utvärderas i förhållande till den genomsnittliga kolonlängd för kontrollgruppen (0: <10% kortare än kontrollen, 1: från 10 till 20% kortare än kontrollen, 2: över 20% kortare än kontroll).
- Beräkna den totala makroskopiska poängen enligt ekvationen: Total makroskopiska poäng = vidhäftning (poäng) + erytem/blödning (poäng) + fekalblod (poäng) + diarré (poäng) + längd av sår (poäng) + kolontjocklek (poäng) + kolonlängd (poäng).
3. Kolon prov beredning
- Skär kolon i 1-2 cm fragment och placera var och en på svamp i en lämpligt märkt histologisk kassett.
OBS: Svampar för histologiska kassetter förhindra kolon vikning under uttorkning och inkubation i flytande paraffin. - Placera kolonfragmentet i 4% formaldehyd och inkubera i minst 24 h vid 4 °C.
- Förbered och programmera vävnadsprocessorn för 1 h inkubation i 50%, 70%, 90%, 95%, 100% etanol, xylen/100% etanol (1:1; v/v), och endast xylen, samt för minst 3 h inkubation i flytande paraffin.
OBS: Uttorkning måste utföras i ökande koncentrationer av etanol och xylen, men koncentrationen av etanol kan ändras. Xylen-/etanolblandningen rekommenderas men krävs inte. - Överför tjocktarmen fragmentet till en histologisk låda och placera i den förprogrammerade vävnadsprocessorn.
- Kör vävnadsprocessorn.
- Efter inkubation steg, placera kolon fragment i en metall mögel så att de två ändarna av kolon är i upprätt läge och fylla en tredjedel av formen med flytande paraffin.
- Placera formen i kylområdet (-5 °C) i några sekunder och flytta sedan formen till uppvärmningsområdet (70 °C). Placera i den nedre delen av histologiska lådan och täck hela kolon fragment med flytande paraffin.
- Lämna metallformen med tjocktarmen fragmentet i paraffin i några minuter i kylområdet. Ta bort metallformen från paraffinblocket och inkubera i minst 24 timmar vid 4 °C.
- Ta bort överflödig paraffin från blocket och sätt in den i en helt automatiserad roterande mikrotome.
OBS: Paraffinblocket kan förvaras vid -20 °C i några minuter före detta steg. - Skär kolonfragmentet i 5 μm sektioner.
- Överför kolonsektionen till ett vattenbad som är förvärmt till 40 °C.
- Använd den märkta glasrutschbanan för att ta bort kolondelen från vattenbadet.
OBS: Kolon sektioner flyter på vattnet. Sätt den märkta glasrutschbanan i vattnet under kolondelen och dra tillbaka glasrutschbanan försiktigt. - Låt glasbilden i 24 timmar vid rumstemperatur. För långtidsförvaring, håll glasrutschbanan vid 4 °C efter 24 h inkubation vid rumstemperatur.
4. Immunohistokemi med immunofluorescensfärgning
OBS: Låt inte kolonsektionen torka i något steg under proceduren.
- Ta bort paraffin genom att inkubera glasbilden i xylen i 5 min. Upprepa detta steg tre gånger.
- Placera glasrutschbanan i xylen/100% etanol (1:1; v/v) i 5 min. Upprepa detta steg tre gånger.
- Rehydrera kolonsektionen i en serie minskande etanolkoncentrationer, dvs.
- Skölj glasrutschbanan under rinnande vatten i 5 min.
- Förvärm antigenhämtningsbuffert (10 mM natriumcitrat; 0,05% Tween 20, pH 6.0) till 95-98 °C och värm glasrutschbilden i kokande antigenhämtningslösning i 10 min.
OBS: Antigenhämtningssteget är valfritt men rekommenderas. Avmaskeringslösningen ska optimeras beroende på vilken antikropp som används i experimentet. - Rita en cirkel runt kolon sektionen med hjälp av en hydrofoba penna.
Det här steget är valfritt men rekommenderas. Den hydrofoba pennan förhindrar avfall av reagenser genom att hålla vätskan poolad i en liten volym inuti markerade cirkeln. - Inkubera sektionen i 3% vattenlösning av väteperoxidas i 10 min.
- Tvätta i tvättlösning (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% Tween 20) för 5 min.
- Inkubera i blockerande lösning (5% normalt getserum; 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% Triton X-100) för 1 h vid rumstemperatur.
OBS: I blockeringslösningen måste det normala serumet vara från samma art som den sekundära antikroppen. I de steg där inkubation krävs, placera glasbilden i en fuktkammare för att förhindra överdriven avdunstning. - Ta bort blockeringslösningen och tillsätt 20-50 μL primär antikropp mot ERα, ERβ eller GPER utspätt i 1% bovint serumalbumin med 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100.
OBS: Rekommenderade utspädningar av primära antikroppar visas i tabell 2.
| Antikroppstyp | Antikroppar mot | Clonality (på 800- och 198 | Värdarter | Artreaktivitet | Utspädning |
| Primära | ERα (eRα) | Polyklonala | Kanin | Mänskliga | 1:100 |
| Musen | |||||
| Sköldpadda | |||||
| Kapybara | |||||
| ERβ (eRβ) | Polyklonala | Kanin | Mänskliga | ||
| Apa | |||||
| Råtta | |||||
| Musen | |||||
| Får | |||||
| Gris | |||||
| GPER (gPER) | Polyklonala | Kanin | Mänskliga | ||
| Råtta | |||||
| Musen | |||||
| Sekundära | DyLight 650 | Polyklonala | Get | Kanin | 1:250 |
Tabell 2: Antikropparnas egenskaper.
- Inkubera med primär antikropp över natten vid 4 °C i mörker.
- Ta bort antikroppslösningen och tvätta i tvättlösningen (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) i 5 min. Upprepa detta steg tre gånger.
- Tillsätt 20-50 μL DyLight 650 sekundär antikropp utspädd i 1% bovin tavla (innehållande 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100). Inkubera med sekundär antikropp konjugerad med färgämne i 1 h vid rumstemperatur i mörker.
OBS: Den rekommenderade utspädningen av den sekundära antikroppen visas i tabell 2. - Ta bort antikroppslösningen och tvätta i tvättlösningen (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) i 5 min. Upprepa detta steg tre gånger.
- Tillsätt 2% DiOC6(3) utspädd i 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl och inkubera i 10 min vid rumstemperatur i mörker.
- Ta bort lösningen och tvätta i tvättlösning (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) i 5 min. Upprepa detta steg tre gånger.
- Tillsätt några droppar glycerol-baserad vätska med DAPI direkt på kolon delen och täck försiktigt med ett lock bild. Inkubera kolonsektionen i minst 24 timmar vid 4 °C.
OBS: Undvik luftbubblor när du täcker vävnaden med locket bilden. - Analysera kolon avsnittet under confocal mikroskop med 20x eller 63x mål och oljenedsänkning med hjälp av dedikerad programvara.
OBS: Tabell 3 innehåller egenskaper hos de fluorokrier som används i denna studie.
| Fluorokomtyp | Våglängd (nm) | Färgämne | |
| Magnetisering | Utsläpp | ||
| DAPI (DAPI) | 405 | 460 – 480 | Blå |
| DiOC6 (3) | 485 | 538 – 595 | Grön |
| DyLight 650 | 654 | 660 – 680 | Röda |
Tabell 3: Fluorokromens egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Makroskopiska egenskaper hos kolon hos möss med TNBS-inducerad Crohns sjukdom
Representativa bilder av kolon tagna från kontroll och TNBS-behandlade möss visas i figur 2. Hos möss med en TNBS-inducerad modell av Crohns sjukdom minskas kolons längd medan tjocktarmens bredd ökar.
Figur 2: Representativkolon som erhållits från kontrollmössen (kontroll) och TNBS-behandlade möss (TNBS). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De utvärderade makroskopiska parametrarna anges i tabell 1. Administrering av TNBS till möss leder till en ökning av den totala colonic makroskopiska poäng (figur 3A) och inflammation längd (figur 3B) i förhållande till kontroll möss.
Figur 3: Total makroskopiska poäng av tjocktarmen (A) och total koloninflammationlängd (B) i kontrollmöss (kontroll) och TNBS-behandlade möss (TNBS). Tio möss per grupp. Statistisk analys utfördes med Hjälp av One-Way ANOVA följt av Newman-Keuls post-hoc-test. Uppgifterna presenteras som medel ± SEM; ***p < 0,001 TNBS vs kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Östrogenreceptorantikroppsvalidering
Validering av specificiteten hos östrogenreceptorantikroppar som används i studien utfördes med HJÄLP AV MCF-7-celler. MCF-7 celler valdes baserat på tidigare studier där flera oberoende forskare fann att östrogenreceptorer finns vid mRNA och proteinnivåer. Som visas i figur 4,de antikroppar som används i studien tillåter detektion av både nukleära östrogenreceptorer, dvs ERα (Figur 4A) och ERβ (figur 4B), samt membran-bundna östrogenreceptorn, dvs GPER (Figur 4C) i MCF-7 celler. Nukleära östrogenreceptorer är lokaliserade i cytoplasman och kärnor, och signalen från GPER färgning är endast närvarande i cytoplasman av MCF-7 celler.
Figur 4: Representativa bilder av immunofluorescensfärgning av ERα (A), ERβ (B) och GPER (C) i MCF-7-cellerna. Detaljerad beskrivning högst upp på bilderna. Skala barer: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Förutom den positiva kontrollen utfördes också en negativ kontroll, där endast den sekundära antikroppen användes. Figur 5 visar en bild av MCF-7 celler färgas endast med sekundära antikroppar konjugeras med fluorokrome och glycerol-baserad vätska med DAPI.
Bild 5: Representativ bild av immunofluorescensfärgning av DyLight 650 i MCF-7-cellerna. Ytterligare beskrivning finns ovanför bilden. Skala barer: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Östrogenreceptorlokalisering i TNBS-inducerad murine modell av Crohns sjukdom
En stark cytoplasmatisk signal från ERα hittades i kolondelen som erhållits från kontrollmöss och möss med TNBS-inducerad Crohns sjukdom (figur 6A). Det verkar dock som om endast i tarmen som erhållits från kontroll möss hade ERα lokaliserad i bägaren cellcytoplasman. Confocal mikroskopi visade också cytoplasmatisk lokalisering av ERβ i kolon delen av både kontroll och TNBS-behandlade möss (figur 6B). På samma sätt dokumenterades cytoplasmatisk lokalisering av GPER i kolonavsnittet från kontrollmöss och TNBS-behandlade möss (figur 6C).
Figur 6: Representativa bilder av immunofluorescensfärgning av ERα (A), ERβ (B) och GPER (C) i kolonsektionen som erhållits från kontrollmöss (kontroll) och TNBS-behandlade möss (TNBS). Ytterligare beskrivning finns ovanför varje bild. Skalstänger: 50 μm; zoomskalstänger: 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns många djurmodeller för IBD patofysiologi undersökning, inklusive genetiska, immunologiska eller spontana modeller, samt kemiskt inducerade modeller15. Bland de flera typer av djurmodeller av kolit, kemiskt inducerade modeller såsom TNBS-inducerad modell som beskrivs i detta protokoll, är relativt billiga och lätta att få. Den TNBS-induceradmurine modell av kolit har flera kliniska symtom relaterade till den patologiska grunden för CD. Djur med inducerad kolit kännetecknas av inkonsekvent avföring snickeri bildning, blodig diarré och förlust av kroppsvikt. Detta innebär dock inte att denna modell kan användas för att studera CD-etiopathogenesis uteslutande. TNBS-inducerad modell rekommenderas och används ofta, till exempel för potentiell terapeutisk screening. När det gäller kemiskt inducerad kolit måste vissa kritiska punkter lyftas fram. TNBS måste spädas i etanol, vilket stör slemhinnan barriären och tillåter TNBS att tränga igenom tarmen väggen och interagera med hög molekylvikt proteiner, vilket leder till en cellulär medierad immunsvar2,16,17. Både TNBS-dosen och etanolkoncentrationen ska optimeras för musstammen och vikten. För hög tnbs-dos och etanolkoncentration kan orsaka överdriven dödlighet, vilket förhindrar ytterligare analys. Å andra sidan kan en för låg TNBS-dos- och etanolkoncentration orsaka dålig respons och i onödan förlänga experimentet.
Tarmen från möss med TNBS-inducerad kolit kan undersökas inte bara på makroskopiska nivå, som beskrivs i detta protokoll, men kan också användas för biokemisk och molekylär analys. Ett användbart tillvägagångssätt för att studera både uttryck och lokalisering är en immunohistochemical teknik med hjälp av immunofluorescens. Emellertid, vissa kritiska steg måste ingå i utarbetandet och genomförandet av IHC för formalin-fast paraffin-inbäddade murine kolon avsnitt. Det första avgörande steget, dvs beredning av kolon bestämmer kvaliteten på resultaten. Fixeringstiden, som beror på vävnadstjockleken måste optimeras. Ett annat avgörande steg är uttorkning, som bör utföras försiktigt genom flera inkuber i ökande koncentrationer av etanol. Slutligen är rätt placering av tjocktarmen i formen viktigt att generera rätt tvärsnitt. Vävnadsberedning är inte den enda viktiga frågan inom immunohistochemistry. Även om antigenhämtning är ett valfritt steg, verkar det i formalinfasta paraffininbäddade avsnitt vara nödvändigt. Under fixering med formaldehyd genereras metylenbroar mellan proteiner och proteincrosslinking masker antigen platser18. Det finns två huvudsakliga metoder, baserade på värme- eller enzymatisk-inducerad (trypsin, pepsin eller proteinas K) antigen hämtning. Värmeinducerad antigenhämtning, utförd i natriumcitratbuffert, etylendiamintetraacetmedelsbuffert (EDTA) eller Tris-EDTA-buffert, används i större utsträckning eftersom den inte påverkar cellmorfologi. Typen av antigenupptag och förhållandena bör justeras experimentellt. Det bör noteras att ibland antigenhämtningsmetoden bestäms av den antikropp som används i experimenten. Permeabilisering är ett tillstånd som är beroende av det undersökta antigenet, och krävs särskilt för intracellulära proteiner. Det finns flera metoder som använder lösningsmedel (aceton eller metanol) och hårda (Triton X-100 eller NP-40) samt milda (Tween 20 eller saponin) rengöringsmedel. I detta protokoll användes två tvättmedel samtidigt, dvs Triton X-100 och Tween 20 beroende på trappan. Det bör understrykas att permeabilisering måste optimeras beroende på vilken antikropp som används. Blockering av icke-specifika bindningsplatser är särskilt viktigt under immunohistokemisk analys. Blockeringslösningarna inkluderar normal serum, bovin tavla albumin eller till och med färdiga att använda blockeringslösningar. I detta protokoll rekommenderas användning av både normal serum och bovin serumalbumin. Som redan nämnts i protokollet bör blockeringslösningen innehålla normalt serum från samma art som den sekundära antikroppen.
Slutligen, IHC detektion av immunofluorescens som beskrivs i detta protokoll kan utvidgas till färgning andra proteiner i protein-protein interaktion studier. När man letar efter samlokalisering av utvalda proteiner måste vissa villkor uppfyllas. Fluorokrier bör väljas baserat på excitering och emissionsspektra. Detta steg är avgörande för att eliminera spektrala överlappningar och måste utföras i planeringsstadiet av experimentet. I detta protokoll används tre fluorokrier, dvs DyLight 650 sekundära antikroppar, DAPI och DiOC6(3). Som visas i tabell 3, DyLight 650 används för östrogenreceptordetektion observeras som ett rött färgämne med 654 nm excitation och utsläpp på 660-680 nm. För att färga cellkärnor och det inre membranet används DyLight 650 tillsammans med DAPI:s kärnmarkör och DiOC6 (3) membranmarkör. DAPI observeras som ett blått färgämne med 405 nm excitation och utsläpp vid 460-480 nm. I sin tur observeras DiOC6(3) som ett grönt färgämne med 485 nm excitation och utsläpp vid 538-595 nm. Färgning av nästa protein bör utföras efter steg 4.14., med början i blockeringssteget (se steg 4.9.). För två proteiner rekommenderas att använda färgning antikroppar från olika arter. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att utesluta bindning av den färg-konjugerade sekundära antikroppar mot det tidigare färgade proteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet publicerades tack vare det ekonomiska stödet från lodz universitet: vice rektor för vetenskaplig forskning, rektor för nationellt och internationellt samarbete och dekanus vid fakulteten för biologi och miljöskydd. Damian Jacenik stöddes av bidrag (2017/24/T/NZ5/00045 och 2015/17/N/NZ5/00336) från National Science Centre, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y.
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn's disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
