Summary
מספר שיטות שונות הוקמו עבור חיסוני הקולנוע באמצעות נוגדנים עיקריים מאותו מין מארח. כאן, אנו מתארים את השימוש של מיקרוגל בתיווך נוגדן בנוכחות של fluorophore-tyramide כדי לחסום נוגדנים לחצות את הנוגדן במהלך כתמים חיסוני במגה-בניין על formalin-קבוע מוטבע האדרנל העכבר סעיפים.
Abstract
חיסוני משמש נרחב במחקר ביו להראות דפוס הביטוי הסלולרי של חלבון נתון. חיסוני מולטיפלקס מאפשר תיוג באמצעות נוגדנים ראשוניים מרובים. כדי למזער את הנוגדן החוצה פעילות, חיסוני המגה באמצעות מכתים עקיף דורש נוגדנים ראשוניים ללא תווית ממינים מארחים שונים. עם זאת, השילוב המתאים של נוגדנים למינים שונים אינו תמיד זמין. כאן, אנו מתארים שיטה של שימוש בנוגדנים ראשוניים שאינם מסומנים מאותם מינים מארחים (למשל, במקרה זה שני נוגדנים הם מן הארנב) עבור מגנטים למגה-ונציה על formalin-קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) עכבר סעיפים האדרנל. שיטה זו משתמשת באותו ההליך וריאגנטים המשמשים בשלב אחזור אנטיגן כדי להסיר את הפעילות של קומפלקס הנוגדן העיקרי שהיה מוכתם בעבר. השקופיות היו מוכתמות הנוגדן הראשוני הראשון באמצעות פרוטוקול חיסוני כללי ואחריו צעד מחייב עם נוגדן משני biotinylated. לאחר מכן, נעשה שימוש בשיטת פיתוח האותות avidin-biotin-peroxidase באמצעות פלואורואופפור-טירומידה כמצע. הפעילות החיסונית של מתחם הנוגדן הראשוני הראשון הוסרו באמצעות טבילה בתמיסה הרתיחה של נתרן ציטראט במשך 8 דקות. התצהיר המולא-מסיסים, שנותר על המדגם, שאיפשר לשקופית להיות מוכתם בנוגדנים ראשוניים אחרים. למרות שיטה זו מבטלת את רוב האותות החיוביים השווא, חלק מהרקע של הנוגדן חוצה פעילות מחודשת עשוי להישאר. אם הדגימות מועשר בביוטין, נוגדן משני peroxidase מעלה עשוי לשמש כדי להחליף את הנוגדן המשני biotinylated כדי למנוע את חיובי שווא מן התאושש ביולוגי אנדוסוגני.
Introduction
בתוך החומרים החיסונית, מכתים ישירות באמצעות נוגדנים ראשוניים מצוים יכול לספק תוצאות אינפורמטיביות. מבלי להשתמש בנוגדנים משניים, שיטת הצביעה הישירה מהווה סיכון נמוך לאותות לוקליזציה מזוייפים מנוגדן לפעילות מחודשת. עם זאת, הכתבים הצוחיים (fluorophore אנזימים) או ביוטין על הנוגדן הראשוני מגביל את השימוש העתידי שלה. לחילופין, חיסוני עקיף מספק בדרך כלל אותות חזקים יותר באמצעות נוגדן ראשוני ללא מעלה עם נוגדן משני מתויג. באופן אידיאלי, נוגדנים ראשוניים בלתי מצובאים בשימוש בבית החומרים החיסוני צריך לבוא ממינים שונים של מארחים כדי להימנע מפני הנוגדנים החוצה פעילות. עם זאת, השילוב המתאים של נוגדנים ראשוניים ממינים מארחים שונים אינו תמיד זמין.
מספר שיטות הוקמו כדי לחסל את הסיכון של הנוגדן המשני המגיבים עם נוגדן ראשוני בלתי רצוי. אחת השיטות הנפוצות היא השימוש ב-F (ab) נוגדן monomeric לחסום את כל אפיסקופים הכריכה הנותרים על מתחם הנוגדן הראשוני הראשון לפני הצביעת עם הנוגדן העיקרי השני1. הנוגדן בנוכחות, אשר דומה לרצועה ומחדש של גיליון כתמים מערבי, מסיר את מתחם הנוגדן הקודם ויטראז מבלי להתפשט את התצהיר של מולקולות עיתונאי לזיהוי כגון 3, 3 '-diaminobenzidine (לפרק)2 ו-פלורסנט tyramide התצהיר3. בשיטה זו, מולקולות עיתונאי בצבעים שונים יכולות להציג את התוצאה של השקופית באותה שקופית. הצביעת של מולטיפלקס הינה גם השגה מוחלטת של שכבות הנוגדנים שהופקדו קודם לכן והיישור של תמונות שנרכשו לאחר מכן מנוגדנים אחרים4,5. שיטות אלו נותנות תוצאות אמינות, אם כי לכל שיטה יש מגבלות והיא דורשת הליכים מסובכים או מערכת דימות מיוחדת.
הפרוטוקול הנוכחי מציג את היישום של נוגדן שיטת החשפנות עם שימוש של מאגרים זמינים בדרך כלל. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של מרכיבים מגנטים לשימוש באמצעות משטחי האדרנל (FFPE) עם שני נוגדנים ראשוניים שאינם מתויגים מאותו זן מארח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. כתמים עם הנוגדן הראשון
- Dewax עווה ומימה מחדש מגלשות ffpe עם 5 דקות מוקצה לכל אחד השלבים הבאים: קסילן או המקבילה ריאגנטים 3x, 100% אתנול 2x, 95% אתנול 1x, 70% אתנול 1x, 50% אתנול 1x, ו מים מזוקקים 2x.
הערה: שקופיות צריכות להישאר לחות החל משלב מחדש זה עד להרכבה בשלב הסופי. - עבור אחזור אנטיגן אופציונלי, מניחים את השקופיות ב 275 mL של תמיסת נתרן ציטראט רותחים (10 מ"מ, pH = 6.0) עבור 8 דקות. כדי לשמור על הפתרון רותח, למקם את השקופיות שטוח בתחתית של 14 x 9.5 x 9 ס מ3 (W x L x H) בתיבת עצה עם מכסה ומיקרוגל את הפתרון על 70% כוח במיקרוגל 700 W מיקרוגל עבור 8 דקות. לאחר מכן להסיר את תיבת הקצה של הפיפטה מהתנור, לפתוח את המכסה, ולתת לפתרון להתקרר בטמפרטורת החדר (RT) לפחות 20 דקות.
- העבר את השקופיות לתוך צנצנת Coplin המכילה PBST (מלוחים באגירה פוספט עם 0.1% polysorbate 20/80). לשטוף עם PBST עבור 5 דקות 3x. אם לא לעבור מיד לשלב הבא, לאחסן את השקופיות בשלב זה עם PBST בצנצנת Coplin ב-RT במשך כמה שעות או ב 4 ° c עבור 1-2 ימים, אם לא מעביר מיד לשלב הבא.
- כדי להכין את הפתרון חסימה להשתמש בסרום נורמלי של המינים המארחים של הנוגדן המשני כמו מגיב החסימה. אחרים לחסימת מסחריים ריאגנטים יכול לשמש גם. אם באמצעות סרום רגיל מועסק למחקר הציג במחקר זה, להוסיף 100 μL של סרום חמור נורמלי 4.9 mL של PBST. ניתן לאחסן את פתרון החסימה ב -4 ° c עד 3 ימים.
- כדי לחסום חסימה, הרעד את PBST מהשקופיות והתכסה אותם במהירות בפתרון חסימות מספיק. מודקון את השקופיות ב-RT בחדר מחולל לחות במשך 30 דקות.
- הכן את פתרון הנוגדן העיקרי (500 μL עבור שתי שקופיות) באמצעות פתרון חסימת כדי לדלל את הנוגדן העיקרי לריכוז הרצוי. הפתרון צריך להיות מאוחסן על הקרח עד השימוש.
- עבור 3βHSD, להוסיף 2 μL של 3βHSD לתוך 498 μL של פתרון חסימה.
- עבור TH, להוסיף 0.5 μL של הנוגדן ל 499 μL של פתרון חסימה.
- עבור β-catenin, להוסיף 1 μL של β-catenin נוגדן לתוך 499 μL של פתרון חסימה.
- עבור 20αHSD, להוסיף 1 μL של 20αHSD נוגדן לתוך 499 μL של פתרון חסימה.
- עבור CYP2F2, להוסיף 2 μL של נוגדן CYP2F2 לתוך 498 μL של פתרון חסימה.
- דגירה עם הנוגדן העיקרי על ידי לטלטל את פתרון חסימת מהשקופיות, ובמהירות לכסות אותם עם פתרון הנוגדן העיקרי מספיק. מחלל את השקופיות בתא מחולל לילה ב -4 ° c. במהלך הדגירה השקופיות עשויות להיות מכוסות על ידי פיסת סרט פרפין קטן כדי למנוע ייבוש.
- למחרת בבוקר לשטוף את השקופיות עם PBST עבור 5 דקות 3x.
- להכין את הפתרון נוגדן משני (500 μL עבור שתי שקופיות) באמצעות פתרון חסימת לדלל את הנוגדן המשני biotinylated לריכוז הרצוי (למשל, 1 μL של החמור נגד העכבר נוגדן או החמור נגד הארנב נוגדן לתוך 499 μL של חסימת פתרון). הפתרון צריך להיות מאוחסן על הקרח עד השימוש.
- דגירה עם הנוגדן השני על ידי לטלטל את PBST מן השקופיות ובמהירות לכסות אותם עם פתרון נוגדן משני מספיק. מחלל את השקופיות בחדר מחולל לחות במשך 1 h ב RT.
הערה: אם ביוטין אנדוגניים היא דאגה, להשתמש בנוגדן משני peroxidase במקום הנוגדן המשני ביולוגי. לקפוץ לשלב 1.14 אם באמצעות נוגדן משני מעלה מperoxidase בשלב 1.10. - שטוף את השקופיות עם PBST עבור 5 דקות 3 x.
- הכינו את הperoxidase מstreptavidin (SA-HRP) פתרון (500 μL עבור שתי שקופיות) על-ידי הוספת 0.5 μL של SA-HRP לתוך 499 μL של PBS. הריכוז הסופי הוא 1 μg/mL.
- דגירה עם פתרון SA-HRP. הרעד את PBST מהשקופיות ובמהירות לכסות את השקופיות עם פתרון SA-HRP מספיק. מודטה את השקופיות בחדר מחולל לחות עבור 0.5 h ב RT.
- שטוף את השקופיות עם PBST עבור 5 דקות 3 x.
- להכין את הפתרון fluorophore-טייקו על ידי דילול fluorophore-tyramide עם מאגר הדילול שלה על פי הוראות היצרן (למשל, 5 μL של פלואור-tyramide לתוך 496 μL של מאגר דילול).
- לבצע את פיתוח האות עם fluorophore-tyramide על ידי לטלטל את PBST מן השקופיות ובמהירות לכסות את השקופיות עם הפתרון fluorophore מספיק-ty,. דגירה בחדר מחולל לחות במשך 1 דקות בשעה RT. זמן הדגירה עשוי להיות מותאם כדי לקבל את עוצמת הקרינה הרצויה. הפסיקו את התגובה על ידי העברת השקופיות לצנצנת של קופלין המכילה את PBST. לשטוף שקופיות עם PBST עבור 3 דקות 2x.
- אותות ניתן לבדוק במהירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לאשר את התוצאה בשלב זה. אם לא נעשה שימוש בכיסויים, החל טיפה של גליצרול: PBS (1:1) על כל קטע כדי לשמור על הדגימות לחות. לשטוף שקופיות עם PBST עבור 3 דקות 2x. ניתן לאחסן שקופיות ב-PBST ב-4 ° c למשך מספר ימים לפני המעבר לשלב הבא.
2. להסיר את הנוגדן הראשון
- מניחים את השקופיות ב 275 מ ל של תמיסת נתרן ציטראט רותחים (10 מ"מ, pH = 6.0) לפחות 8 דקות. שמור על הפתרון רותח על ידי הצבת שקופיות שטוח בתחתית של 14 x 9.5 x 9 ס מ3 (W x L x H) התיבה עצה עם מכסה למיקרוגל את הפתרון על 70% כוח במיקרוגל 700 W עבור 8 דקות. אם זמן החשפנות ארוך יותר הוא מועדף, ייתכן שיידרש להוריד את המאגר באמצעות פתרון נתרן ציטראט רותח כדי לשמור את השקופיות שקועים בפתרון המאגר בכל עת. הסר את תיבת הקצה של הפיפטה מהתנור, פתח את המכסה, ותן לפתרון להתקרר ב-RT במשך 20 דקות לפחות.
- להעביר את השקופיות לתוך צנצנת Coplin המכילה PBST. לשטוף עם PBST עבור 5 דקות 3x. אם השלב הבא אם לא יבוצע באופן מיידי, אחסן את השקופיות בצנצנת Coplin עם PBST ב-RT למשך מספר שעות או ב-4 ° c במשך 1-2 ימים.
3. כתם עם הנוגדן השני
- התחל משלב החסימה ובצע את אותן הליכים בשלב 1.5 דרך שלב 1.14. בשלבי פיתוח האותות (שלב 1.15 ו-שלב 1.16), השתמש בפלואורופור-טירמידה בספקטרום של זריחה שונה.
הערה: ניתן לחשוף שקופיות באמצעות שיטה זו מספר פעמים כדי לאפשר כתמים של מולטיפלקס. הנוגדן האחרון אינו דורש. פלואורופפור-טירמידה ככתבת נוגדן משני מצופף מעלה עשוי לשמש כדי להראות אותות מן הנוגדן העיקרי האחרון. - שקופיות דגירה עם 2 μg/mL 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) או הכולל פתרון עבור 1 דקות ב-RT אם יש צורך בצביעת מונה גרעיני. לאחר מכן שטוף את השקופיות עם PBST עבור 3 דקות 2x.
4. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לזהות אותות
- הר שמיכות עם טיפת מדיום הרכבה מתאים לאימונולוורבורסנס.
- לדימות, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לזהות אותות של כל ערוץ הזריחה. התחל עם ערוץ הצביעת הגרעיני (DAPI) ועדשת 4x כדי לאתר את הרקמה בשקופית.
- מעבר לעדשת 10x לדימות. כוונן את זמן החשיפה (300 אלפיות הראשונה) ועוצמת מקור האור (80% אינטנסיביות). התאם הגדרות אלה אם האות בהיר מדי או כהה מדי. צלם תמונות של כל אחד מהערוצים מבלי להזיז את הבמה. ייתכן שיהיה צורך בהתמקדות מחדש עבור כל ערוץ. מזג את התמונות מכל אחד מהערוצים באמצעות תוכנת המיקרוסקופ או ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות התקבלו מדגימות שטופלו עם כל השלבים שתוארו כולל האחזור אנטיגן שלב 1.2. כל הנוגדנים המשניים. ששימשו כאן היו ביולוגיים פלואור שימש לפיתוח אותות מהנוגדנים הראשוניים הראשונים והשניים. תמונות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד קוביית FITC (עבור זריחה ירוקה), קוביית TxRED (עבור Cy3), ו קוביית DAPI (עבור DAPI).
התפשטות המיקרוגל מבטלת את הפעילות הצולבת.
העכבר סעיפים FFPE האדרנל היו מוכתם באמצעות שני נוגדנים ארנב ראשי. ללא התפשטות (איור 1א-ג), הנוגדן המשני עבור TH אספו את 3βHSD (+) אתרים ונתן אותות אדומים בקליפת יותרת הכליה (איור 1B). חוסר החשפנות הוביל אותות לוקליזציה שווא לראות צהוב (איור 1ג). זו החוצה פעילות החוצה מגיע (1) האנזים HRP שזרז את התגובה הראשונה ty, ו (2) מינים הנוגדן לחצות את הפעילות. כדי להסיר את הנוגדן לחצות את הפעילות ואת HRP מהכתמים הראשון, בדקנו 1 דקות (איור 1D-F) ו 8 דקות מיקרוגל בתיווך בנוכחות (איור 1G-I). שני הטיפולים היו מספיקים כדי לחסל את האות לא ספציפי, מתן תוצאות נקיות כפולות מכתים (איור 1F, I). השליטה השלילית הייתה בעקבות כל הצעדים שהיו למעט הדגירה עם הנוגדנים העיקריים (איור 1J). לא נאסף אות משמעותי. בשליטה השלילית מצאנו כי 8 דקות להתפשט בתוך מאגר ציטראט רותח היה מספיק כדי לחסל את הנוגדן לחצות את הפעילות עבור נוגדנים רבים בשימוש נפוץ בבלוטת יותרת הכליה (איור 2).
המגבלה – היעילות של המיקרוגל בתיווך בנוכחות בלתי תלויה נוגדן.
למרות מיקרוגל בתיווך בשימוש בפרוטוקול זה עובד ברוב המקרים, יש מגבלות על שיטה זו. עבור נוגדנים מסוימים, מיקרוגל בתיווך שיטת החשפנות עם מאגר ציטראט לא יכול להסיר לחלוטין את הנוגדן לחצות את הפעילות. לדוגמה, 8 דקות להתפשט הסיר את האותות הלא ספציפיים ביותר של העכבר נוגדן אנטי-TH העכבר נגד CYP2F2 נוגדן, אבל אות חיובי שווא הצליל עדיין לזיהוי (הלשד באיור 3E ואת הקליפה הפנימית באיור 3K). שים לב כי גידול של זמן המיקרוגל ל 20 דקות עדיין לא לחלוטין להסיר את הנוגדן לגמרי החוצה פעילות (איור 3H, K).
איור 1: מייצג חיסוני כפול על P1 FFPE עכבר אדרלים. מקטעי האדרנל של העכבר FFPE היו מוכתמים עם שני נוגדנים עיקריים מארנבים: anti-3βHSD (ירוק = קליפת המוח), אנטי-TH (אדום = לשד). שלוש קבוצות של כתמים כוללים את שלוש הליכים החשפנות שונים בשימוש: (A-C) לא להתפשט, (D-F) 1 דקות להתפשט, ו (G-I) 8 דקות להתפשט. שים לב כי ללא המיקרוגל, הנוגדן המשני עם TH עדיין לאסוף אותות 3βHSD, בעוד תוצאות מכתים ספציפיים הושגו 1 דקות ו-8 מיקרוגל מינימום בקבוצות שטופלו. אין אות חיובי בשליטה שלילית, לא מודקרת עם נוגדנים ראשוניים. סרגל קנה מידה = 100 μm. DAPI = גרעיני תא, כחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מייצג חיסוני כפול על P21 FFPE העכבר אדרלים. מקטעי האדרנל של העכבר FFPE היו מוכתמים עם שני נוגדנים עיקריים מארנבים בסדר הבא: anti-β-catenin (ירוק = קליפת המוח החיצוני) ולאחר מכן anti-20αHSD (אדום = קליפת המוח הפנימי). צעד החשפנות 8 דקות בוצע בין. סרגל קנה מידה = 100 μm; DAPI = גרעיני תאים, כחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ייתכן שנוגדנים מסוימים לא יוסרו במלואו, דבר שעלול להוביל לאותות חלשים שאינם ספציפיים. מקטעי האדרנל של העכבר FFPE היו מוכתמים עם שני נוגדנים עיקריים מעכברים: anti-CYP2F2 (ירוק = קליפת המוח הפנימי) ו אנטי-TH (אדום = לשד). התוצאות של הקבוצה לא להתפשט (A-C) הראו כי התגובות לגילוי החלבון CYP2F2 עדיין מוכתם ה-TH (+) אזור. לוקליזציה שווא נראתה בתוך ליבת יותרת הכליה (C). למרות הטיפול במיקרוגל 8 דקות ו 20 דקות מופחתת את עוצמת הקרינה הירוקה בלשד, רקע בולט עדיין קיים (D-I). הנוגדן anti-CYP2F2 הוא דוגמה נוספת המציגה כי החוצה-reactivity פעילות לא ניתן להסיר במלואה גם לאחר 20 דקות של המיקרוגל (J-L). שים לב כי לא היה אות חיובי בפקד שלילי, לא מודב עם נוגדנים העיקרי, המציין את האות החיובי שווא היה מן הנוגדן חוצה פעילות (M). סרגל קנה מידה = 100 μm; DAPI = גרעיני תאים, כחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתמים חיסוני מולטיפלקס שימושי כדי לבחון את ההתאמה התאית של שני אנטיגנים או יותר. טכניקה זו בשימוש נרחב נותן תוצאות משכנעות לוקליזציה כאשר נוגדנים העיקרי הם מצועם כתבים שונים (כתמים ישירים). עם זאת, מכתים ישירה בדרך כלל מספק אותות חלשים יותר לעומת כתמים עקיפים, אשר כרוך נוגדנים משניים מצופני מעלה כדי לזהות את הנוגדנים העיקריים. באמצעות כתמים עקיפים, התוצאה באיכות גבוהה מכתים החומרים מסתמך אם הנוגדנים המשניים יכולים להבחין בין הנוגדנים העיקריים השונים. בשל הנוגדן האפשרי צלב הפעילות, מגוון הצביעת ניצול שיטת מכתים עקיף הוא נראה ברור יותר עם נוגדנים העיקרי ממינים מארחים שונים. קארל ואחרים פיתחו פרוטוקול באמצעות עודף IgG F בעלי מעלה מצופף (ab) משבר לחסום נוגדן לחצות פעילות1. אסטרטגיה דומה משמש את "עכבר על העכבר" מכתים אשר משתמש F (ab) מmonomeric נגד העכבר כדי למנוע את הנוגדן נגד העכבר המשני מזיהוי כל חיסוני העכבר האנדוגניים ברקמה. עם זאת, שיטה זו חוסמת הוא זמן רב ואינו יכול לחסום לחלוטין נוגדנים משלבים קודמים, במיוחד אם אנטיגנים זיהוי הם של שפע גבוה2.
חום בתיווך הנוכחות היא שיטה נוספת כדי למנוע נוגדנים לחצות את הפעילות בתוך כתמים חיסוני. הקונספט דומה לרצועה ולשיטת הבדיקה החוזרת של אבן חשופה מערבית. השימוש במיקרוגל כדי להרתיח את השקופיות במאגר ציטראט, היתה בעלת השפעה חיובית מסומנת על חסימת הנוגדן החוצה פעילות. שני 5 הטיפולים מיקרוגל מינימום בין סיבובים רציפים של מכתים האנליזה מטרי לאפשר זיהוי של אנטיגנים מרובים באותה שקופית באמצעות נוגדנים חד שבטיים בעכבר2. טיפולי מיקרוגל בשילוב עם הגברה האות thyramide (קו המים), אשר משתמשת fluorophore-tyramide כמו מצע של hrp, הם גם שימושיים עבור immunofluorescence כפולה כתמים3,6,7. הטיפול במיקרוגל בין מחזורי הצביעת הראשון והשני חוסם את הפעילות של מתחם החיסוני הראשון מבלי לשטוף את משקעים הפלורסנט שלו. עם זאת, טיפול במיקרוגל לא יכול להיות מסוגל באופן מלא למנוע זיהום בצביעת8. למרות שיטות מסוימות באמצעות סוגים שונים של מאגרי החשפנות עשוי לספק יעילות להתפשט טוב יותר, מאגרים מיוחדים עם פעמים דגירה יותר נחוצים, או דגימות צריך לעבור רכישת תמונה לפני כתם אחר מוחל4,5,7,9,10,11. כאן אנו להפגין שיטה פשוטה עם הליך מסובך פחות ומאגר משותף עבור מיקרוגל בתיווך אנטיגן לשליפה בתוך מגוון מיקרו מודאוציםצביעת. למרות ששיטה זו מבטלת את רוב הפעילות הצולבת, המשתמשים צריכים להיות מודעים ללוקליזציה שווא של האפשרות החלשה שנראה עם נוגדנים מסוימים גם לאחר 20 דקות טיפול במיקרוגל.
ניתן להשתמש בביוטין אנדודוגני כסמן של תאים המסוגגניים בקליפת יותרת הכליה12. Streptavidin-fluorophore מצומדת לבד מספיקה כדי לזהות ביוטין אנדודוגני ואורות את קליפת הכליה כולה, במיוחד בחלקים קפואים. מאחר ביוטין ביודוגני נחסם בדרך כלל בדגימות ffpe, avidin-ביוטין-peroxidase ההליך (כלומר, ABC kit) הוא עדיין משמש רבות כדי להגביר מטרות בדגימות האדרנל ffpe. חשוב לציין כי שלב האיחזור אנטיגן גם ביטול מסכות אנדוגניים ביוטין ומעורר פעילות חיסונית13. מכיוון שהשיטה שלנו משלבת מיקרוגל בתיווך אנטיגן ושימוש streptavidin-מצוח hrp, זה אפשרי ביוטין אנדוגניים יוביל אותות חיוביים שווא, במיוחד ברקמות עשיר עם ביוטין אנדוגניים (למשל, הכבד, הכליות, וכמה גידולים)13. אם ההליך אבידין-ביוטין-peroxidase יש צורך להגביר את האות, צעד חוסם נוסף כגון טרום דגירה עם אבידין חינם וביוטין חופשי עשוי לסייע להפחית את האות ביוטין אנדודוגני14. בעוד השיטה שלנו נותן רקע ביודוגני נמוך אנדוגניים על העכבר ffpe, חשוב לכלול תמיד שליטה שלילית עם כל מדגם בכל עת בעת שימוש avidin-ביוטין-peroxidase ההליך. הגישה החלופית היא להשתמש בנוגדן משני peroxidase במקום נוגדן משני biotinylated.
התוצאות שלנו מדגימות כי טיפול במיקרוגל עם מאגר ציטראט הוא שיטה שימושית לצביעת המיקרו-מגוון של המעבדה החיסונית. עם זאת, יש לציין שלא כל הפעילויות החוצות יכולות להיות חסומות לחלוטין. לוקליזציה שגויה חלשה אפשרית. פרוטוקול זה יכול לשמש כגישה חלופית כאשר שילוב מתאים של נוגדנים ראשיים ממינים מארחים שונים אינו זמין. משתמשים צריכים להיות מודעים אפשרי חיובי שווא מפני הפעילות הצולבת הנותרים, כמו גם את biotin האנדוגניים התאושש. יש לכלול שליטה שלילית נכונה בכל עת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על-ידי NIH R00 HD032636.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1,000 dilution |
| Microwave oven, 700 W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz | SC-25269 | 1:1,000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS | NB300-109 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1,000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X.
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
