Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

توليد الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن

Published: November 9, 2020 doi: 10.3791/61778
Automatic Translation
*1, *1,2, *3, 1, 1, 3, 3,4, 1,5,6
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, 2Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 4Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 5Department of Neurology, Warren Alpert Medical School of Brown University, 6Center for Translational Neuroscience, Robert J. and Nancy D. Carney Institute for Brain Science and Brown Institute for Translational Science, Brown University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

التفاعلات العصبية الدبقية في التنكس العصبي ليست مفهومة جيدا بسبب عدم كفاية الأدوات والأساليب. هنا ، نصف البروتوكولات المثلى للحصول على الخلايا العصبية المستحثة ، وخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن ، والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ونقدم أمثلة على قيم هذه الطرق في فهم المساهمات الخاصة بنوع الخلية في مرض الزهايمر.

Abstract

في مرض الزهايمر (AD) والاضطرابات التنكسية العصبية الأخرى ، يعد الفشل الدبقي قليل التغصن سمة مرضية مبكرة شائعة ، ولكن كيف يساهم في تطور المرض وتطوره ، خاصة في المادة الرمادية للدماغ ، لا يزال غير معروف إلى حد كبير. يتميز الخلل الوظيفي لخلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن بأوجه القصور في الميالين وضعف التجديد الذاتي لخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (OPCs). يحدث هذان العيبان جزئيا على الأقل بسبب اضطراب التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا قليلة التغصن على طول تراكم علم الأمراض. تؤدي OPCs إلى ظهور الخلايا قليلة التغصن الميالينية أثناء تطور الجهاز العصبي المركزي. في قشرة الدماغ الناضجة ، OPCs هي الخلايا التكاثرية الرئيسية (التي تضم ~ 5 ٪ من إجمالي خلايا الدماغ) وتتحكم في تكوين المايلين الجديد بطريقة تعتمد على النشاط العصبي. لم تتم دراسة مثل هذه الاتصالات من الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية قليلة التغصن بشكل كبير ، خاصة في سياق الحالات التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر ، بسبب نقص الأدوات المناسبة. في السنوات الأخيرة ، أحرزت مجموعتنا وغيرها تقدما كبيرا لتحسين البروتوكولات المتاحة حاليا لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية والخلايا قليلة التغصن بشكل فردي من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. في هذه المخطوطة ، نصف إجراءاتنا المحسنة ، بما في ذلك إنشاء نظام زراعة مشتركة لنمذجة اتصالات الخلايا العصبية قليلة التغصن. تشير نتائجنا التوضيحية إلى مساهمة غير متوقعة من OPCs / oligodendrocytes في الداء النشواني في الدماغ وسلامة المشبك العصبي وتسليط الضوء على فائدة هذه المنهجية لأبحاث مرض الزهايمر. هذا النهج الاختزالي هو أداة قوية لتشريح التفاعلات الخلوية غير المتجانسة المحددة من التعقيد المتأصل داخل الدماغ. من المتوقع أن تسهل البروتوكولات التي نصفها هنا الدراسات المستقبلية حول عيوب قلة التغصن في التسبب في التنكس العصبي.

Introduction

تشكل خلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن - بما في ذلك خلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (OPCs) ، والخلايا قليلة التغصن الميالينية ، والأنواع الانتقالية بينهما - مجموعة رئيسية من خلايا الدماغ البشرية1 التي تشارك بنشاط في العديد من الوظائف الحيوية من أجل التشغيل السليم وصيانة نظامنا العصبي المركزي طوال التطور العصبي والشيخوخة2،3،4 . في حين أن oligodendrocytes معروفة جيدا بإنتاج المايلين لتسهيل انتقال النشاط العصبي ودعم الصحة المحورية في المادة البيضاء ، فإن OPCs وفيرة (~ 5٪) في المادة الرمادية حيث يكون الميالين نادرا وتؤدي وظائف إشارات تعتمد على النشاط للتحكم في سلوك التعلم وتكوين الذاكرة5،6،7،8 . كيف تعمل الخلايا الدبقية قليلة التغصن والخلل الوظيفي في التسبب في مرض الزهايمر (AD) وغيرها من الحالات التنكسية العصبية المرتبطة بالعمر لم تتم دراستها9. وتتمثل أوجه القصور في نظام نموذجي مناسب وأوجه القصور في المعارف العامة لتوجيه مسار تجريبي إلى الأمام في الأسباب الرئيسية لهذه الفجوة.

في ضوء أحدث الاختراقات في اشتقاق خلايا الدماغ البشري من الخلايا الجذعية متعددة القدرات بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ES) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) ، ظهرت هذه النماذج الخلوية جنبا إلى جنب مع أدوات تحرير الجينات الحديثة كأدوات قوية للتعامل مع العلاقة المعقدة للتفاعلات الخلوية في الدماغ ، وهي قادرة على إظهار مظاهر المرض الخاصة بالإنسان10 ، 11. بالنظر إلى أن أنواع خلايا الدماغ الفردية يمكن أن تظهر تأثيرات مميزة وحتى متضاربة في مواجهة نفس الظروف المعززة لمرض الزهايمر12,13 ، فإن منهجية الخلايا الجذعية هذه تقدم بشكل فريد معلومات خاصة بنوع الخلية تم تفويتها سابقا باستخدام نماذج ثابتة في الجسم الحي أو في المختبر توفر فقط قراءات مجمعة من مجموعات من أنواع خلايا الدماغ. في العقد الماضي ، تم تطوير عدد كبير من البروتوكولات الموثوقة لتوليد الخلايا العصبية البشرية من التمايز العابر للخلايا الجذعية الجنينية / الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو التحويل المباشر من أنواع الخلايا الأخرى المتمايزة نهائيا (مثل الخلايا الليفية)14,15. على وجه الخصوص ، يمكن أن يؤدي تطبيق عوامل النسخ العصبية الرئيسية (على سبيل المثال ، neurogenin 2 ، Ngn2)16 على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى توليد مجموعة متجانسة من أنواع الخلايا العصبية المميزة جيدا للمزارع النقية دون الحاجة إلى التثاقف مع الخلايا الدبقية12،17،18. بالنسبة للخلايا قليلة التغصن البشرية المستحثة ، هناك عدد قليل من البروتوكولات المنشورة التي يمكن أن تولد خلايا وظيفية تشبه إلى حد كبير نظيراتها الأولية ، مع مجموعة واسعة من الكفاءة والطلب في الوقت والموارد19،20،21،22،23،24،25،26،27،28 . حتى الآن ، لم يتم تطبيق أي من هذه البروتوكولات للتحقيق في كيفية استجابة الخلايا قليلة التغصن وتأثيرها على التسبب في مرض الزهايمر.

هنا ، نصف بروتوكولاتنا المحسنة للثقافات الفردية والمختلطة للخلايا العصبية المستحثة البشرية (iNs) و OPCs / oligodendrocytes (iOPCs / iOLs). يعتمد بروتوكول iN الموصوف هنا على نهج Ngn216 المستخدم على نطاق واسع ، وله ميزة إضافية تتمثل في كونه خاليا من الدبقية. تكون iNs الناتجة متجانسة وتشبه إلى حد كبير الخلايا العصبية المثيرة للطبقة القشرية 2/3 ، مع مورفولوجيا هرمية مميزة ونمط التعبير الجيني وميزات فيزيولوجية كهربية17,18 (الشكل 1). للتغلب على بعض الحواجز الأساسية في التمايز الموجه للخلايا الجذعية متعددة القدرات ، قمنا بتطوير طريقة بسيطة وفعالة للمعالجة المسبقة لجرعة منخفضة من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)29،30 ، وأبلغنا عن ميل معزز لخلايا ES / iPS البشرية للانتقال إلى iOPCs و iOLs31 ، بناء على بروتوكول تم تكييفه على نطاق واسع بواسطة Douvaras و Fossati 32 . لقد قمنا بتبسيط البروتوكول بشكل أكبر ودمجنا مركبا قويا يعزز التمايز ، كليماستين7،33،34 ، لتسريع عملية النضج الدبقي قليل التغصن. نتيجة لذلك (الشكل 2) ، يمكن إنشاء iOPCs في أسبوعين (~ 95٪ إيجابي للعلامة O4) و iOLs في أربعة أسابيع (معبرا عن علامات ناضجة MBP و PLP1). ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أن iOPCs وحدها تفرز كمية ملحوظة من β الأميلويد (Aβ) ، بما يتفق مع البيانات النسخية المستقلة التي تظهر التعبير الوفير لبروتين السلائف الأميلويد (APP) ومعالجة البروتياز β-secretase (BACE1) في خلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن35,36. علاوة على ذلك ، يعزز نظام الاستزراع المشترك iN-iOPC الخاص بنا تغليف المحاور من خلال عمليات iOL الإيجابية MBP ويوفر دعما كبيرا لتشكيل المشبك العصبي (الشكل 3). وبالتالي ، فإن البروتوكولات التي قمنا بتفصيلها أدناه لها مزايا تقنية وبيولوجية على طرق الاستزراع المشترك للخلايا العصبية قليلة التغصن المفهرسة سابقا ، وتبشر بنمذجة أفضل للتنكس العصبي في مرض الزهايمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحريض الخلايا العصبية البشرية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

  1. تحضير فيروس العدس (~ 5 أيام ، بروتوكول مفصل كما هو موضح سابقا16)
    1. لوحة ~ 1 مليون خلية HEK293T كل قارورة T75 ، ليكون لها ~ 40 ٪ متقاربة عند إجراء transfection. قم بنقلها باستخدام البلازميدات التي تعبر عن Ngn2 المحرض بالتتراسيكلين والجين المقاوم للبوروميسين (PuroR ؛ تحت نفس سيطرة المروج TetO) ، rtTA والبلازميدات المساعدة الثلاثة pRSV-REV و pMDLg / pRRE و VSV-G (12 ميكروغرام من الحمض النووي للناقل الفيروسي العدسي و 6 ميكروغرام من كل من الحمض النووي البلازميد المساعد). تحضير ما لا يقل عن ثلاث قوارير لكل إعداد lentivirus. استخدم PEI للتحويل باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتغيير الوسائط بعد 16 ساعة وتجاهلها.
    2. أطلق الحصاد جزيئات فيروسية عن طريق جمع وسائط الاستزراع كل يوم واستبدالها بوسائط جديدة لمدة 3 أيام. تجمع الوسائط التي تم جمعها التي تحتوي على جزيئات فيروسية للتنقية. قم بتصفية الفيروس من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي بسرعة 49000 × جم لمدة 90 دقيقة. أعد تعليق الحبيبات بالحجم المناسب من جلوكوز PBS (~ 150 ميكرولتر).
  2. تحريض الخلايا العصبية (~ 5 أيام)
    ملاحظة: هذا البروتوكول التعريفي (الشكل 1 أ ؛ مخطط التدفق) فعال للغاية لكل من خلايا iPS و ES من تعدد القدرات الذي تم التحقق من صحته (والذي يمكن فحصه عن طريق تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية لعلامات تعدد القدرات المميزة جيدا ؛ الشكل 1 ب).
    1. استخدم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H1 المتاحة تجاريا عند مرور 52 (انظر جدول المواد). قم بزراعة الخلايا على ألواح 6 آبار مغلفة بمحلول مصفوفة خارج الخلية (~ 0.5 مجم من محلول المصفوفة لكل لوحة ذات 6 آبار ؛ انظر جدول المواد) باستخدام وسيط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية (انظر جدول المواد) واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    2. في اليوم -2 ، افصل الخلايا الجذعية الجنينية (80٪ متقاربة) ب 1 مل من محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. نقل الخلايا إلى أنبوب ؛ اغسل البئر ب 2 مل من الوسائط وادمجها في نفس الأنبوب. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليق الحبيبات في الوسائط ، وقم بطلاء الخلايا على ألواح 6 آبار مغلفة بالمصفوفة بكثافة بذر 1 × 105 خلايا لكل بئر.
    3. في اليوم -1 ، أضف الفيروسات العدسية التي تعبر عن Ngn2 بالإضافة إلى PuroR و rtTA مع البوليبرين (8 ميكروغرام / مل) إلى الخلايا الجذعية الجنينية في وسط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية الجديد (انظر جدول المواد). يجب تحديد الكمية الدقيقة للفيروسات بواسطة التتر الفعلي أو المعايرة. نضيف عادة 5 ميكرولتر لكل فيروس لكل بئر في لوحة من 6 آبار.
    4. في اليوم 0 ، أضف الدوكسيسيكلين (2 ميكروغرام / مل ، لتنشيط تعبير Ngn2) في وسط DMEM-F12 مع مكمل N2 بدون مورفوجينات.
    5. في اليوم الأول ، أضف Puromycin في وسط جديد من DMEM-F12 plus N2 والدوكسيسيكلين ، إلى التركيز النهائي لوسط 1 ميكروغرام / مل. حدد الخلايا المحولة في Puromycin لمدة 24 ساعة على الأقل. قد تكون هناك حاجة إلى تركيز أعلى من Puromycin (يصل إلى 5 ميكروغرام / مل) وفترة اختيار أطول (تصل إلى 48 ساعة) لإزالة الخلايا غير المحولة بشكل كاف إذا كان عيار الفيروس منخفضا.
    6. في اليوم 2 ، افصل الخلايا العصبية المتمايزة بمحلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) ، وأعد طلاءها على 24 لوحة بئر (بين 80000-200000 خلية / بئر) مطلية بمحلول مصفوفة (انظر جدول المواد) ، واحتفظ بها في وسط NBA / B27 بدون دوكسيسيكلين. كثافة البذر أمر بالغ الأهمية.
    7. في هذه المرحلة ، يمكن تجميد الخلايا العصبية المنفصلة في وسط تجميد تجاري متخصص (انظر جدول المواد) وتخزينها في النيتروجين السائل لمدة تصل إلى 3 أشهر. يمكن طلاء الخلايا العصبية النقية بحساب موت الخلايا النموذجي ~ 15٪ -20٪ بعد ذوبان الجليد ، أو زراعتها بمفردها أو استزراعها مع أنواع خلايا الدماغ الأخرى (انظر الخطوة 3.2.3. للزراعة المشتركة مع OPCs).
    8. زراعة iNs نقية على الألواح المطلية بحلول قائمة على المصفوفة خارج الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). يجب أن يكون التشكل الهرمي المميز واضحا بحلول اليوم 4 (واليوم 6 ؛ الشكل 1 ج). يمكن اكتشاف تكوين المشبك في وقت مبكر من اليوم 14 إلى 16 وهو بارز في اليوم 24 عن طريق التلوين الكيميائي المناعي بعلامات قياسية قبل وبعد المشبكي. (الشكل 1D ؛ المسمى بعلامة ما قبل المشبكي Synapsin 1 والعلامة المتغصنة Map2).

2. تحريض الخلايا السليفة قليلة التغصن البشرية (OPCs) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات ونضوج الخلايا قليلة التغصن

  1. توليد الخلايا السلفية العصبية (NPC): بروتوكول أحادي الطبقة (~ 7 أيام). انظر الشكل 2 أ للحصول على مخطط التدفق.
    1. زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H1 كما هو موضح سابقا (انظر الخطوة 1.2.1.) وتحويلها إلى خلايا سلفية عصبية (NPCs) من خلال نهج راسخ يسمى SMADi المزدوج ، مع مثبطات جزيء صغيرة لمسارات إشارات متعددة. هنا نستخدم مجموعة تجارية مقبولة على نطاق واسع ونتبع بروتوكول أحادي الطبقة الذي توفره الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    2. في اليوم -1 ، لوحة 0.5-1 × 106 خلايا لكل بئر في لوحة 6 آبار مغلفة بمحلول مصفوفة عامل نمو مختزل (انظر جدول المواد ؛ ~ 0.5 ملغ من محلول المصفوفة لكل لوحة 6 آبار) مع وسيط صيانة خلية ES (انظر جدول المواد). يستخدم محلول المصفوفة المختزل لعامل النمو هذا لطلاء جميع الألواح التي سيتم استخدامها في الخطوات التالية.
    3. في اليوم 0 ، عالج الخلايا لمدة 24 ساعة باستخدام وسيط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية (انظر جدول المواد) مع 2٪ DMSO.
    4. في اليوم 1-6 ، قم بتغيير الوسائط الكاملة باستخدام وسط تحريض عصبي دافئ (37 درجة مئوية) يحتوي على مثبطات SMAD من المجموعة التجارية (انظر جدول المواد). إذا انقسمت الخلايا ووصلت إلى نقطة التقاء قبل اليوم السابع ، فقم بتمريرها إلى كثافة البذر من 0.5-1 × 106 ، كما هو موضح سابقا في الخطوة 2.1.2.
    5. في اليوم السابع ، تمر NPCs باستخدام محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) ولوحة بكثافة بذر 1-2 × 105 خلايا / بئر من لوحة 24 بئر.
    6. فحص كفاءة التمايز عن طريق تلطيخ الكيمياء المناعية (IHC) لعدم وجود علامة متعددة القدرات ، OCT4 على سبيل المثال ، ووجود علامات NPC مثل PAX6 و Nestin و Sox1.
    7. في هذه المرحلة ، يمكن تجميد NPCs المنفصلة في وسائط تجميد NPC التجارية المتخصصة (انظر جدول المواد) وتخزينها في النيتروجين السائل لمدة تصل إلى 3 أشهر. بعد التجميد والذوبان لمرة واحدة ، لا تزال الشخصيات غير القابلة للعب تحتفظ بالقدرة المتعددة لتؤدي إلى ظهور الخلايا العصبية والخلايا النجمية و OPCs ذات البروتوكولات الموثوقة.
  2. جيل خلية السلائف قليلة التغصن (OPC) (~ 7 أيام). يرجى الاطلاع على الشكل 2 أ للحصول على مخطط التدفق.
    1. في اليوم السابع ، قم بمرور NPCs باستخدام محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) وقم بطلائها بكثافة بذر 1-2 × 105 خلايا لكل بئر في صفيحة مكونة من 24 بئرا في وسط تحريض عصبي دافئ (37 درجة مئوية) بالإضافة إلى مثبطات SMAD من المجموعة التجارية (انظر جدول المواد).
    2. في اليوم 8 ، قم بإعداد محلول 1٪ DMSO في وسط تمايز OPC ومعالجة NPCs المطلية لمدة 24 ساعة. يتكون وسط التمايز OPC من: وسط DMEM / F12 ، ملحق N2 1٪ ، مكمل B27 1٪ ، bFGF عند 20 نانوغرام / مل ، SAG عند 1 ميكرومتر ، PDGF-AA عند 10 نانوغرام / مل (انظر جدول المواد).
    3. في اليوم 9 ، استبدل الوسائط بوسيط تمايز OPC جديد بدون DMSO. قم بإطعام الخلايا كل يوم حتى اليوم 15. إذا وصلت الخلايا إلى التقاء قبل اليوم 15 ، فقم بتمريرها إلى كثافة البذر من 1-2 × 105 خلايا لكل بئر كما هو موضح في الخطوة 2.2.1.
    4. في اليوم 14 ، لوحة OPCs في وسط تمايز OPC بكثافة 1-2 × 105 خلايا / بئر في لوحة 24 بئر.
    5. في هذه المرحلة (اليوم 15) ، خلايا الاختبار لوجود علامات خاصة ب OPC بواسطة تلطيخ IHC أو qPCR (على سبيل المثال ، O4 ، Olig1 / 2 ، CSPG4 / Ng2 ، NKX2.2 ، PDGFRa ؛ الشكل 2 ب) ولغياب علامات NPC (Pax6 أو Nestin ؛ الشكل 2 د). عادة ما نكتشف النشاط المناعي O4 في أكثر من 95٪ من الخلايا في اليوم 15. ذات صلة خاصة بمرض الزهايمر ، فإن التعبير عن APP (بروتين السلائف الأميلويد) ، BACE1 (بروتياز المعالجة β-secreatase 1) ، والببتيد أميلويد β (Aβ) وفير في OPCs (الشكل 2F).
  3. نضوج الخلايا قليلة التغصن (OL) (~ 7-20 يوما)
    1. في اليوم 15 ، استبدل الوسائط بوسط نضج OL: وسط Neurobasal-A ، ومكمل B27 2٪ ، و 1 ميكرومتر cAMP ، و 200 ng / mL T3 ثلاثي يودوثيرونين ، وكليماستين من 1 ميكرومتر (انظر جدول المواد). قم بتغيير الوسيط كل يوم أو كل يوم ، إذا لزم الأمر.
    2. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء ، تنقسم بنسبة 1: 3 حتى مقطعين أو حتى يتباطأ انقسام الخلايا بشكل كبير. إذا انقسمت OPCs بسرعة كبيرة ووصلت إلى نقطة التقاء في أقل من 3 أيام ، أضف Ara-C (انظر جدول المواد) بتركيز 2-5 ميكرومتر لمدة 1-3 أيام. يشير الانتشار النشط إلى انخفاض كفاءة النضج.
    3. افحص كفاءة النضج الدبقي قليل التغصن من خلال تقييم التعبير عن علامات OL ، على سبيل المثال ، CLDN11 أو PLP1 أو MBP بواسطة qPCR أو تلطيخ IHC أو النشاف المناعي. يجب اكتشاف التشكل المميز للهياكل شديدة التعقيد (الشكل 2C) والتعبير عن علامات OL (الشكل 2E) بسهولة بحلول اليوم 28.

3. الزراعة المشتركة للخلايا العصبية المستحثة البشرية (iNs) وخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (iOPCs)

  1. طلاء iOPC (~ 3 أيام)
    1. لوحة iOPCs في اليوم 14 بكثافة 1 × 105 خلايا لكل بئر في لوحة 24 بئر (كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.2.4.) في وسط تمايز OPC (كما هو موضح في الخطوة 2.2.2.).
  2. إعداد الثقافة المشتركة iN-iOPC
    1. في اليوم 15 ، افصل الخلايا العصبية البشرية المستحثة في خطوة اليوم الثاني بعد اختيار Puromycin (كما هو موضح في الخطوة 1.2.6.) بمحلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد).
    2. أضف الخلايا العصبية إلى OPCs المستزرعة ، وقم بالطلاء بكثافة البذر 2 × 105 خلايا لكل بئر في لوحة 24 بئرا مع OPCs المتنامية (من الخطوة 3.1.1). استخدم وسط الاستزراع المشترك الذي يحتوي على وسط Neurobasal-A ، ومكمل B27 2٪ ، و 100 نانوغرام / مل T3 ثلاثي يودوثيرونين. قم بتغيير الوسيط في اليوم التالي ثم كل يومين بعد ذلك. إذا تكاثرت OPCs بسرعة كبيرة ووصلت إلى نقطة التقاء في أقل من 3 أيام ، أضف Ara-C بتركيز 2-5 ميكرومتر. يوضح الشكل 3 أ صورة تمثيلية ل iNs و iOPCs المزروعة في الثقافة المشتركة بعد 7 أيام من الخلايا العصبية.
    3. استخدم الخلايا العصبية المجمدة المحضرة كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.2.7 للزراعة المشتركة مع OPCs. الخلايا العصبية تجميد وذوبان لوحة في كثافة أعلى من 3 × 105 خلايا لكل بئر.
    4. بعد اليوم 14-16 في الثقافات المشتركة ، يمكن ملاحظة تكوين المشبك في iNs عن طريق تلطيخ IHC لعلامات ما قبل وبعد المشبكي ، وبحلول اليوم 21 يجب أن تكون النقاط المشبكية وفيرة (الشكل 3C) ويمكن تسجيل الأنشطة العصبية بشكل موثوق.
    5. بدءا من اليوم 21 ، اختبر الخلايا بحثا عن علامات OL المحددة (على سبيل المثال ، MBP و PLP1). بحلول اليوم 28 ، نلاحظ عادة ظاهرة تغليف محاور iN بواسطة عمليات iOL ، والتي تم تسميتها بواسطة تلطيخ IHC لعلامات محددة (الشكل 3B ؛ NF للخيوط العصبية لمحاور iN و MBP لعمليات iOPC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التوليد المباشر للخلايا العصبية التي يسببها الإنسان من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
من المهم جدا أن تظهر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات درجة عالية من تعدد القدرات للتوليد الناجح ل iNs أو iOPCs / iOLs. لذلك ، يجب تلطيخ الخلايا لعلامات محددة ، مثل Oct4 و SOX2 ، قبل البدء في أي من بروتوكولات الحث الموضحة في المخطوطة الحالية (الشكل 1 أ). تم استخدام خلايا H1 البشرية للحصول على الخلايا العصبية الأمامية الاستثارية المستحثة باتباع البروتوكول المنشور سابقا بواسطة Zhang et al. مع بعض التعديلات (الشكل 1C) 12،16،17،18. هنا ، نقدم بروتوكولا يتم فيه إعادة طلاء iNs في اليوم 2 في ثقافة نقية على محلول مصفوفة (انظر جدول المواد) ، في حالة عدم وجود أي طبقة مغذية: الخلايا الدبقية أو الخلايا الليفية. بالإضافة إلى البروتوكولات المنشورة سابقا ، نلاحظ أن تجميد iNs في اليوم 2 لا يؤثر بشكل كبير على صلاحية الخلية (~ 15٪ -20٪ موت الخلايا بعد الذوبان). ستبدأ الخلايا العصبية النقية في الثقافة في التعبير عن المشبك العصبي 1 في اليوم 14-16 (الشكل 1 د). يعد إنشاء مزرعة عصبية نقية أمرا مهما للغاية لأن بعض العوامل ، على سبيل المثال ، عامل خطر AD الرائد ApoE ، يمكن التعبير عنها بواسطة الخلايا الموجودة في طبقة التغذية وهذا يمكن أن يربك النتائج بشكل كبير.

يتم تحسين توليد iOPC ونضج iOL عن طريق علاج DMSO
هنا ، نقدم بروتوكولا سريعا وفعالا يتيح توليد iOPCs في أسبوعين و iOLs الناضجة في 4-5 أسابيع (الشكل 2A). لقد استفدنا من طريقة علاج DMSO العابر الذي طورناه سابقا لزيادة كفاءة التمايز لخلايا ES و iPS29،30،31. يثري علاج DMSO عدد الخلايا في مرحلة G1 المبكرة لتحسين تكامل الإشارات ، مما يفضل التمايز. أجرينا العلاج الأول قبل حث الخلايا الجذعية الجنينية البشرية على توليد NPCs ، والعلاج الثاني قبل التمييز بين NPCs إلى iOPCs. يمكننا اكتشاف علامات OPC محددة (Olig2 و CSPG4 و NKX2.2 و PDGFRA) في وقت مبكر بعد أسبوعين من طلاء خلايا ES H1 (الشكل 2B ، E). مجتمع iOPC في هذه المرحلة متجانس إلى حد ما ، مع >95٪ من الخلايا إيجابية لتلطيخ O4 ومستوى عال من النشاط المناعي للعلامات الأخرى (الشكل 2B). بعد بدء نضوج OL في اليوم 15 ، يمكننا عادة اكتشاف علامات OL محددة (MBP و O1 و CLDN11 و PLP1) بدءا من اليوم 28 (الشكل 2C ، E). يرتبط التعبير عن هذه العلامات الخاصة بالمرحلة بالمسار التنموي للخلايا الدبقية قليلة التغصن ويشير إلى وتيرة متسارعة ، مع انخفاض علامات NPC تدريجيا ، وعلامات OPC تبلغ ذروتها في الأسبوع الثاني تقريبا ، وعلامات OL ترتفع بحلول الأسبوع الثالث (الشكل 2D ، E) 37. يرجى ملاحظة أن عملية النضج هذه تنوع مجموعات الخلايا. يمكن أن تكون المجموعات السكانية الفرعية في سلسلة متصلة ، والتي تضم مراحل وسيطة متعددة بين OPCs والخلايا قليلة التغصن الميالينية الناضجة ، موجودة وتمثل نسبة متفاوتة من الخلايا الكلية ، مع سيطرة الخلايا الأكثر نضجا في وقت لاحق.

على سبيل المقارنة ، اشترينا iOPCs ذات المراجع العالية ، ونضجناها في iOL باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. اختبرنا تعبير العلامات المذكورة أعلاه في كل من مستحضرات iOPC و iOL ، وفي الخلايا التي اشتريناها. قررنا أن الخلايا المتولدة وفقا لبروتوكولنا لديها تعبير أعلى عن جميع الجينات التي تم اختبارها (الشكل 2E). ومن المثير للاهتمام ، عندما اختبرنا المستويات المفرزة لشكلين متماثلين رئيسيين من β الأميلويد (Aβ40 و Aβ42) في iNs مقابل iOPCs ، لاحظنا أن iOPCs تفرز المزيد من كلا الشظايا ، لكن النسبة ظلت كما هي (الشكل 2F).

الاستزراع المشترك ل iNs و iOPCs
تم تحسين هذا البروتوكول خصيصا للاستزراع المشترك iNs و iOPCs ويسمح بمراقبتنا في الوقت الفعلي للاتصالات بين الخلايا بين هذين النوعين من الخلايا على طول مسار التطور العصبي. يجب تحديد كثافات الطلاء المثالية لكلا النوعين من الخلايا بسلسلة من معايرة رقم الخلية لتحقيق التمايز المناسب (الشكل 3 أ). بعد 4 أسابيع في الثقافات المشتركة ، من المتوقع أن يتم تمييز iOPCs بشكل كاف إلى OLs التي تكون إيجابية لعلامات محددة مثل MBP وتوسيع العمليات لتشمل محاور الغلاف (الشكل 3B). يمكن لنظام الاستزراع المشترك أن يزيد بقوة من عدد نقاط الاشتباك العصبي ، مما يشير إلى أن iOPCs توفر دعما عصبيا من خلال الاتصالات الجسدية أو إطلاق العوامل الغذائية (الشكل 3C). يمكننا الحفاظ على الثقافات المشتركة في حالة صحية مقبولة لمدة تصل إلى 6 أسابيع ونلاحظ أن عدد المشبك العصبي والسمات العصبية الأخرى تستقر في الأسبوع الخامس تقريبا. تجدر الإشارة إلى أن الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة غير موجودة في استعداداتنا ويمكن توثيق غيابها عن طريق التحقق من التعبير عن علامات محددة (الشكل 3 د). تعبر iOPCs عن عدد لا بأس به من الجينات المميزة جيدا والتي يمكن أن تستجيب وتتوسط الإشارات المعتمدة على النشاط من الخلايا العصبية المجاورة ، في paracrine (مثل neurotrophins و الأيضات) و / أو بطريقة متشابكة (الشكل 3E و 3F).

Figure 1
الشكل 1: التوليد المباشر للخلايا العصبية المستحثة بشريا (iNs) من hPSCs. (أ) مخطط التدفق لتوليد iN. (ب) صور المجال الساطع التمثيلي والتألق المناعي لثقافة بدء الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (H1) لتأكيد تعدد القدرات. يظهر Oct4 باللون الأحمر و Sox2 باللون الأخضر. (ج) صور ميدانية ساطعة تمثيلية ل iNs في اليوم 4 واليوم 6. (د) التشكل المميز للتشجير التغصني ونقاط المشبك في iNs المزروعة في ثقافة نقية لمدة 24 يوما وملطخة بالتلوين المناعي للعلامة المتغصنة Map2 وعلامة ما قبل المشبكي Synapsin 1 (Syn1). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: توليد iOPC ونضج iOL. (أ) مخطط التدفق لتوليد iOPC و iOL. (ب) صور ميدانية ساطعة ومضان مناعي ل iOPCs في اليوم 15. يظهر Olig2 (علامة عموم قليل التغصن) باللون الأخضر ، و O4 (علامة OPC) باللون الأحمر ، و DAPI باللون الأزرق. كشف التصوير أن >95٪ من iOPCs إيجابية ل O4 و 25٪ ل Olig2. (ج) صور ميدانية ساطعة ومضان مناعي ل iOLs في اليوم 28. يظهر MBP باللون الأخضر و O1 باللون الأحمر و DAPI باللون الأزرق. (د) يتضاءل التعبير عن علامة NPC PAX6 بشكل كبير في iOPCs في اليوم 14 وينخفض إلى الخلفية في OLs في اليوم 28 ، مما يشير إلى تمايز قوي ل NPC ومستوى عال من التجانس في مجموعة iOPC. (ه) ملف تعريف التعبير الزمني لجينات علامة OPC و OL الشائعة في الثقافات الناتجة عن البروتوكول الموصوف ، بدون (-DMSO) أو مع (+DMSO) خطوة حضانة DMSO (الخطوتان 2.1.3 و 2.2.2) ، تم فحصها في نقاط زمنية مختلفة. على سبيل المقارنة ، تم نضج iOPCs التجارية (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وتم اختبار كل من iOPCs (iOPC-Tempo) أو iOLs (iOL-Tempo) لنفس العلامات. كما هو متوقع ، لم يتم اكتشاف MBP (علامة oligodendrocyte الناضجة) (N.D.) في المراحل المبكرة من التمايز في جميع iOPCs التي تم اختبارها. عزز DMSO بشكل كبير كفاءة تمايز OPC ونضج OL. (F) إنتاج وإفراز Aβ40 و Aβ42 في مزارع iNs و iOPCs النقية ، مقاسة بواسطة مجموعات ELISA التجارية (انظر جدول المواد) على مادة طافية تم الحصول عليها من ثقافات iNs و iOPCs النقية في اليوم 15 وتطبيعها بأرقام الخلايا (كلاهما بكثافة 200000 خلية لكل بئر في لوحة من 24 بئرا). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يتم رسم البيانات في الرسوم البيانية الشريطية كمتوسط ± SEM (رقم ≥ 3). تم تقييم الدلالة الإحصائية من خلال اختبار t للطالب (* ، p < 0.05 ؛ ** ، p < 0.001) ؛ في (د) ، مقارنة بالمجلس الوطني لنواب الشعب الصيني ؛ في (E) ، مقارنة بالتحكم iOPC-Tempo ؛ في (F) ، مقارنة ب iN.

Figure 3
الشكل 3: الثقافة المشتركة ل iNs و iOPCs. (أ) صورة ميدانية ساطعة تمثيلية ل iNs و iOPCs المستزرعة بشكل مشترك في اليوم 7 ، تظهر كثافة مناسبة لمزيد من النضج. (ب) صورة التألق المناعي التمثيلي ل iNs و iOPCs المستنبتة بشكل مشترك لمدة 28 يوما. يظهر الخيط العصبي للعلامة المحورية NF باللون الأخضر وعلامة قلة التغصن MBP باللون الأحمر. على اليمين ، جزء من محور iN مغلف بعملية iOL (MBP +). (ج) تكوين المشبك العصبي الذي تم فحصه في الثقافات المشتركة التي يبلغ عمرها 4 أسابيع. تم تلطيخ الخلايا ل Synapsin 1 (Syn1 ، أخضر) و MAP2 (أحمر) ، وتم قياس النقاط المشبكية عن طريق التحليل البؤري للكثافة على طول الأجزاء المتغصنة كما هو موضح17,18. (د) في ثقافاتنا المشتركة ل iNs و iOPCs (7 أيام من الزراعة المشتركة) ، يكون التعبير عن علامات الخلايا النجمية ، ALDHL1 و GFAP ، ضئيلا (أعلى) ، ولا يتم اكتشاف التعبير عن علامات الخلايا الدبقية الصغيرة ، TMEM119 و TREM2 و CD33 (N.D.) بواسطة qPCR. وبالتالي يتم استبعاد التلوث من هذين النوعين من الخلايا الدبقية. (ه) يؤدي استزراع iOPC مع iN إلى تكوين نقاط اشتباك عصبي-OPC. يتم التعبير عن علامة ما بعد المشبكي الموسومة بالتألق PSD95-mCherry فقط في OPCs ، وتعرض نمطا منتشرا في الثقافات الفردية (يسار) ولكنها تتجمع لتشكيل نقاط في الثقافات المشتركة (يمين ، يشار إليها بالأسهم ؛ Tuj1 ، علامة عصبية). (F) التعبير عن جينات oligodendroglial جيدة التوصيف التي يمكنها استشعار الأنشطة العصبية والاستجابة لها في الثقافات النقية ل iOPCs في اليوم 14. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يتم رسم البيانات في الرسوم البيانية الشريطية كمتوسط ± SEM (n ≥ 3). تم تقييم الدلالة الإحصائية من خلال اختبار t للطالب (** ، p < 0.005 ؛ ***، p < 0.001) ؛ في (C) ، مقارنة بشرط عدم وجود OPC ؛ في (D) ، مقارنة بالخلايا النجمية الأولية في اللوحة العلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بالإضافة إلى الدعم الجسدي والأيضي لتحقيق الاستقرار في هياكل المشبك وتسهيل توصيل الإشارة الملحية عن طريق الميالين ، يمكن لخلايا سلالة oligodendrocyte تشكيل نمط النشاط العصبي عبر محادثات متقاطعة سريعة وديناميكية مع الخلايا العصبية5،6،7. بينما في علم أمراض الزهايمر ، كانت الاستجابات قليلة التغصن تعتبر في البداية مجرد ثانوية للالتهاب والضغوط التأكسدية ، هناك الآن أدلة واعدة تجادل بأن سلامة المايلين المعرضة للخطر هي حدث ممرض مبكر قبل ظهور تراكم Aβ وفرط الفسفرةتاو 9. علاوة على ذلك ، فإن إصلاح الميالين من خلال التجديد الذاتي ل OPCs ضعيف بشكل خاص في AD38 ، وهي عملية تعتمد بشكل كبير على الأنشطة العصبية. وبالتالي فإن فهم آلية دعم إشارات الخلايا العصبية قليلة التغصن الصحية يمثل فرصة ممتازة لتحديد أهداف علاجية جديدة.

يعد بروتوكول Ngn2 لعامل النسخ الفردي أحد أكثر التقنيات استخداما لتوليد الخلايا العصبية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية ، والإجراءات الموضحة هنا هي تحسينات إضافية للحصول على ثقافات عصبية نقية. يحتوي بروتوكول iOPC / iOL الخاص بنا على فترة تحريض أقصر من الدراسات المنشورة سابقا (من 4 إلى 24 أسبوعا) ، مع عائد ونقاء قويين يمكن مقارنتهما بالبروتوكولات الأخرى شائعة الاستخدام19،20،22،23،24،25،26،27،28 . يقدم بروتوكولنا التمايز التدريجي للخلايا الجذعية الجنينية إلى NPCs و OPCs وأخيرا oligodendrocytes من خلال إشارات الزخرفة المميزة ، ويولد خلايا وظيفية يمكن استخدامها لدراسة تنظيم توازن الميالين وإصلاحه في المختبر أو في الجسم الحي (على سبيل المثال ، عن طريق النقش في نموذج الفأر المرتعش) كما هو موضح في العمل السابق. يتم تعزيز التحسن في بروتوكولنا بشكل كبير من خلال حضانة DMSO ، التي تنشط بروتين الورم الأرومي الشبكي وتطيل مرحلة G1 من دورة الخلية لدمج محفزات التمايز الموجه بشكل أفضل ، كما تعزز التمايز النهائي في المشتقات الوظيفية29,30. أخيرا ، فإن استخدام كليماستين ، وهو مركب مسكاريني ومضاد للهستامين تم تحديده من خلال شاشات الأدوية لعلاجات إعادة الميالين33 ، يقصر أيضا من نضوج الخلايا قليلة التغصن ، كما لوحظ في تحضير الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات والحيوانات الحية 7,28.

تكمن قيود هذه التقنية بشكل رئيسي في التناقض الجوهري بين الإعدادات المبسطة في المختبر والأوساط في الجسم الحي في الدماغ. يؤدي هذا التناقض إلى خصم في إمكانات النمو الكاملة في المراحل المتقدمة لأنواع خلايا الدماغ الفردية. بالنسبة ل iNs ، كانت الدراسات الحديثة قادرة على الحفاظ على الثقافات في صحة متشابكة جيدة لفترة طويلة من الزمن ، لكنها لا تزال تكشف عن بعض عدم النضج النسبي الذي يتجلى في انخفاض الهياكل الشبيهة بالعمود الفقري وضعف الانتقال المشبكي التلقائي في ثقافات iN "القديمة" (حتى تلك التي يبلغ عمرها 25 شهرا)39. في حين أن iOPCs قد ثبت بشكل متكرر أن المحاور العصبية الميالينية في الجسم الحي بعد زرعها في أدمغة الفئران المعدلة وراثيا ، فإن مقايسات الميالين في المختبر مع التقييم المجهري الإلكتروني لا تزال تمثل تحديا تقنيا مع كفاءة غير مرضية لجميع البروتوكولات المنشورة تقريبا19,28 ، بما في ذلك هذا البروتوكول. لذلك ، لا يتوقع أن يحاكي نظام الثقافة المشتركة neuron-OPC بأمانة عملية شيخوخة الدماغ وكذلك المرحلة المتأخرة من علم أمراض الزهايمر. بدلا من ذلك ، فهي مهيأة بشكل فريد لفصل التفاعلات بين الخلايا المتقنة بين الخلايا العصبية و OPCs أو الخلايا قليلة التغصن في المراحل المبكرة ، والتي تكون مستقلة عن الميالين ولكنها أساسية للتطور العصبي السليم والتسبب في المرض.

كل إجراء من الإجراءات الثلاثة الموضحة هنا له خطواته النقدية داخل البروتوكول وقد يتطلب تعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. بالنسبة لبروتوكول iN ، هناك خطوتان حاسمتان: اختيار البوروميسين (الخطوة 1.2.5) وكثافة الطلاء (الخطوة 1.2.6). تؤدي الإزالة غير الكاملة للخلايا غير المتحولة إلى تلوث الخلايا ضعيفة التمايز وتعرض بقاء الخلايا العصبية ووظائفها للخطر. يجب النظر في التعديلات الخاصة باختيار البوروميسين الأقوى مع تركيز أعلى وحضانة أطول كما هو موضح في الخطوة 1.2.5. يجب تحديد كثافة الطلاء المناسبة عن طريق المعايرة لكل خط خلية متعدد القدرات ، حيث تؤدي الكثافة المنخفضة إلى انهيار الثقافات والكثافة العالية تشجع على تجميع الخلايا وتعيق نمو الخلايا العصبية. بالنسبة لبروتوكول iOPC / iOL ، فإن الخطوتين الحاسمتين هما التحكم في تكاثر الخلايا في تمايز OPC (الخطوة 2.2.3) وكثافة الطلاء لنضج OL (الخطوتان 2.2.4 و 2.3.2). يشير النمو الزائد ل NPCs المتمايزة إلى استجابة ضعيفة لمحفزات تمايز OPC ويجب إخمادها بجرعة مناسبة من علاج Ara-C (ضمن النطاق المشار إليه). أثناء طلاء OPCs للنضج ، يفضل هنا نطاق أقل من كثافة الخلايا لأن التوزيع المتناثر يمكن أن يسهل تحريض التشكل الفسيولوجي للهياكل المعقدة (كما هو موضح في الشكل 2C). بالنسبة لبروتوكول الاستزراع المشترك iN-iOPC ، نود أن نلفت الانتباه إلى الخطوة الحاسمة المتمثلة في الطلاء بكثافة مناسبة لكلا النوعين من الخلايا (الخطوتان 3.1.1 و 3.2.2). على وجه التحديد ، قد لا تلتصق iNs جيدا بالسطح بين OPCs المتنامية وتميل إلى الانفصال أولا عندما تصل الثقافة إلى التقاء. يجب تحديد النسبة المثلى عن طريق معايرة أرقام الخلايا.

بشكل عام ، يعد هذا النهج الاختزالي الموجود في بروتوكولاتنا أداة قوية لتشريح التفاعلات الخلوية غير المتجانسة المحددة من التعقيد المتأصل في الدماغ البشري ، ويعمل على الكشف عن بيولوجيا oligodendroglial في الصحة وفي مرض الزهايمر. وبالتالي فإن الأهمية فيما يتعلق بالأساليب الحالية واضحة إلى حد ما في رأينا. فائدة إضافية للطرق التي تم تطويرها هنا للتطبيقات المستقبلية هي العلاج القائم على الخلايا لحالات إزالة الميالين ، مثل العلاج الإشعاعي40 وإصابة الحبل الشوكي41,42. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخدام السعة الإنتاجية العالية لهذا النظام القائم على الخلايا الجذعية على نطاق أوسع لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة بحثا عن المركبات التي يمكن أن تحمي أو تستعيد الحالة الفسيولوجية للخلايا العصبية و OPCs والخلايا قليلة التغصن وتفاعلاتها. وبالتالي ، نعتقد أن البروتوكولات الموضحة هنا ستسهل العمل المستقبلي في تطوير أدوات نمذجة أفضل وعلاجات فعالة لمرض الزهايمر والاضطرابات العصبية التنكسية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R00 AG054616 إلى YAH و T32 GM136566 إلى KC) ، وكلية الطب بجامعة ستانفورد وزمالة Siebel (الممنوحة ل SC). Y.A.H. هو أستاذ متعدية في GFL من مركز علم الأعصاب الانتقالي في معهد براون للعلوم الانتقالية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase STEMCELL Technologies 7920
B27 supplement ThermoFisher 17504044
bFGF ThermoFisher PHG 0266
cAMP MilliporeSigma A9501
Clemastine MilliporeSigma SML0445
DMEM/F12 medium STEMCELL Technologies 36254
DMSO ThermoFisher D12345
Doxycycline MilliporeSigma D3072
Fetal Bovine Serum ScienCell 10
H1 human ES cells WiCell WA01
Matrigel Corning 354234
mTeSR plus STEMCELL Technologies 5825
N2 supplement ThermoFisher 17502001
Neurobasal A medium ThermoFisher 10888-022
Non Essential Amino Acids ThermoFisher 11140-050
PDGF-AA R&D Systems 221-AA-010
PEI VWR 71002-812
pMDLg/pRRE Addgene 12251
Polybrene MilliporeSigma TR-1003-G
pRSV-REV Addgene 12253
Puromycin ThermoFisher A1113803
ROCK Inhibitor Y-27632 STEMCELL Technologies 72302
SAG Tocris 4366
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media STEMCELL Technologies 5838
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit STEMCELL Technologies 8581
T3 triiodothyronine MilliporeSigma T6397
Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs Tempo BioScience SKU102
TetO-Ng2-Puro Addgene 52047
VSV-G Addgene 12259

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
  2. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  3. De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer's disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
  4. Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
  5. Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
  6. Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304 (2014).
  7. Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
  8. Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).
  9. Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
  10. Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer's disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).
  11. Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
  12. Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer's disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294 (2018).
  13. TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
  14. Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
  15. Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer's disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
  16. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  17. Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer's Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
  18. Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
  19. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
  20. Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
  21. Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
  22. Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
  23. Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
  24. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
  25. Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
  26. Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).
  27. Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
  28. Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
  29. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  30. Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
  31. Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
  32. Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
  33. Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
  34. Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
  35. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  36. Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer's disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
  37. Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
  38. Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
  39. Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
  40. Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
  41. Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
  42. Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 165 ، الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، الخلايا الجذعية الجنينية ، الخلايا العصبية ، الخلايا قليلة التغصن ، الخلايا السلفية قليلة التغصن ، OPCs ، مرض الزهايمر ، ببتيدات أميلويد بيتا ، نقاط الاشتباك العصبي

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions
Posted by JoVE Editors on 12/29/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. The Representative Results section has been updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. Please click here to view a larger version of this figure.

The fourth paragraph was updated from:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).

to:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F). 

توليد الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Assetta, B., Tang, C., Bian, J.,… More

Assetta, B., Tang, C., Bian, J., O'Rourke, R., Connolly, K., Brickler, T., Chetty, S., Huang, Y. W. A. Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. J. Vis. Exp. (165), e61778, doi:10.3791/61778 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter