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Biology

मेगाकारियोसाइट विभेदन और प्लेटलेट गठन का अध्ययन करने के लिए सेल स्रोत के रूप में ल्यूकोडेप्लेशन फिल्टर्स-व्युत्पन्न सीडी 34 + कोशिकाएं

Published: May 20, 2021 doi: 10.3791/62499
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1BPPS UMR-S 1255, FMTS, Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est

Summary

इस प्रोटोकॉल में ल्यूकोफिल्टर-व्युत्पन्न सीडी 34 + हेमेटोपोइटिक प्रोजेनिटर्स और उनके इन विट्रो भेदभाव और परिपक्वता को प्रोपलेटलेट-असर मेगाकारियोसाइट्स में प्राप्त करने में शामिल सभी चरणों का विस्तार से वर्णन किया गया है जो संस्कृति माध्यम में प्लेटलेट्स जारी करने में सक्षम हैं। यह प्रक्रिया मेगाकारियोपोइसिस को नियंत्रित करने वाले सेलुलर और आणविक तंत्र के गहन विश्लेषण के लिए उपयोगी है।

Abstract

इन विट्रो विस्तार और मानव हेमेटोपोइटिक जनकों के विभेदकों को प्रोपलेटलेट्स को लम्बा करने और प्लेटलेट्स जारी करने में सक्षम होने से प्लेटलेट्स बायोजेनेसिस अंतर्निहित तंत्र का गहन अध्ययन होता है। उपलब्ध संस्कृति प्रोटोकॉल ज्यादातर अस्थि मज्जा या गर्भनाल रक्त से प्राप्त हेमेटोपोइटिक जनकों पर आधारित होते हैं जो कई नैतिक, तकनीकी और आर्थिक चिंताओं को बढ़ाते हैं। यदि परिधीय रक्त से CD34 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पहले से ही उपलब्ध प्रोटोकॉल हैं, तो यह पांडुलिपि रक्त केंद्रों में आसानी से उपलब्ध ल्यूकोडेप्लेशन फिल्टर से सीडी 34 + कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक सीधा और अनुकूलित प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करती है। इन कोशिकाओं को आठ रक्तदान के अनुरूप रक्त आधान उत्पादों की तैयारी में उपयोग किए जाने वाले ल्यूकोडेप्लेशन फिल्टर से अलग किया जाता है। इन फिल्टरों को त्यागने के लिए होती है। इन फ़िल्टर से सीडी 34 + कोशिकाओं के रूप में पहचाने गए हेमेटोपोइटिक प्रोजेनिटर एकत्र करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स को प्राप्त करने की विधि उनके फेनोटाइपिक विकास पर चर्चा करते हुए प्रोपलेटलेट्स का विस्तार करने की विधि भी विस्तृत है। अंत में, प्रोटोकॉल एक कैलिब्रेटेड पाइपटिंग विधि प्रस्तुत करता है, जो प्लेटलेट्स को कुशलतापूर्वक जारी करता है जो मूल लोगों के समान रूप से और कार्यात्मक रूप से होते हैं। यह प्रोटोकॉल अंतर्निहित तंत्रों को विच्छेदन करने और वीवो प्लेटलेट पैदावार में दृष्टिकोण करने के लिए प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में कार्य करने वाले औषधीय यौगिकों का मूल्यांकन करने के लिए एक आधार के रूप में काम कर सकता है।

Introduction

रक्त प्लेटलेट्स विशेष बड़े पॉलीप्लाइड कोशिकाओं, मेगाकारियोसाइट्स (एमके) से आते हैं, जो मेगाकारियोपोइसिसिस (एमकेपी) के रूप में जाना जाने वाला निरंतर और ठीक-ठाक उत्पादन प्रक्रिया से उत्पन्न होता है। इस प्रक्रिया के शीर्ष पर हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल हैं, जो बोन मैरो पर्यावरण (साइटोकिन्स, ट्रांसक्रिप्शन कारकों, हेमेटोपोइटिक आला) के संपर्क में हैं, जो मेगाकारियोसाइटिक मार्ग की ओर प्रतिबद्ध करने में सक्षम हो जाएंगे और हेमेटोपोइटिक जनक (एचपी) में अंतर कर सकते हैं, जिससे अपरिपक्व एमकेएस1को जन्म मिलेगा। विभिन्न साइटोकिन्स के प्रभाव में, और विशेष रूप से थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ), जो एमकेपी का प्रमुख साइटोकिन है; एमके को परिपक्वता के दो प्रमुख चरणों से गुजरना होगा: एंडोमेट्रियोसिस और सीमांकन झिल्ली (डीएमएस) का विकास। यह पूरी तरह से परिपक्व एमके तब एक साइनसॉइड पोत के करीब दिखाई देता है जिसमें यह साइटोप्लाज्मिक एक्सटेंशन, प्रॉप्लेलेट्स उत्सर्जित कर सकता है, जिसे रक्त प्रवाह के तहत जारी किया जाएगा और बाद में कार्यात्मक प्लेटलेट्स2में फिर से तैयार किया जाएगा। 19943 में टीपीओ की क्लोनिंग ने एचपी भेदभाव और एमके परिपक्वता की अनुमति देने वाली इन विट्रो संस्कृति तकनीकों के विकास में तेजी लाकर एमकेपी के अध्ययन में बढ़ावा दिया।

प्लेटलेट की संख्या (वृद्धि या कमी) और कार्य4,5दोनों के संदर्भ में रक्त प्लेटलेट्स को प्रभावित करने वाली कई विकृतियां हैं। मानव हिमाचल प्रदेश से विट्रो में MKP को पुनः प्राप्त करने में सक्षम होने के नाते आणविक और सेलुलर इस प्रक्रिया अंतर्निहित तंत्र और अंततः रोगियों के चिकित्सीय प्रबंधन की समझ में सुधार हो सकता है ।

मानव एचपी के विभिन्न स्रोत उपयुक्त हैं: कॉर्ड रक्त, अस्थि मज्जा, और परिधीय रक्त6,7,8। परिधीय रक्त से हिमाचल प्रदेश की कटाई गर्भनाल रक्त या अस्थि मज्जा से उनकी वसूली की तुलना में कम सैंय और नैतिक समस्याओं को उठाती है । हिमाचल प्रदेश ल्यूकाफेरसिस या बफी कोट से बरामद किया जा सकता है, लेकिन ये स्रोत महंगे हैं और रक्त केंद्रों में हमेशा उपलब्ध नहीं होते हैं। अन्य प्रोटोकॉल, कम खर्चीला और प्रदर्शन करने में आसान, मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) की सीधी वसूली की अनुमति देतेहैं,बिना पूर्व सीडी 34 संचालित अलगाव4,8की आवश्यकता के बिना। हालांकि, इस विधि के साथ मेगाकारियोसाइट्स की शुद्धता संतोषजनक नहीं है और एमके में इष्टतम भेदभाव के लिए पीएमसी से सीडी 34 + कोशिकाओं के चयन की सिफारिश की जाती है। इससे हमें ल्यूकोरेडक्शन फिल्टर (एलआरएफ) से एचपी शुद्धिकरण लागू करने के लिए नेतृत्व किया गया, जो नियमित रूप से रक्त बैंकों में सफेद रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए उपयोग किया जाता है और इस प्रकार प्रतिकूल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचता है9। दरअसल, १९९८ के बाद से, प्लेटलेट ध्यान केंद्रित स्वचालित रूप से फ्रांस में leukodepleted किया गया है । इस प्रक्रिया के अंत में, एलआरएफ को छोड़ दिया जाता है और एलआरएफ में बनाए गए सभी कोशिकाओं को नष्ट कर दिया जाता है। इसलिए, एलआरएफ में कोशिकाएं किसी अतिरिक्त कीमत पर आसानी से उपलब्ध हैं। एलआरएफ के पास ल्यूकाफेरेसिस या बफी कोट द्वारा प्राप्त एक सेलुलर सामग्री है, विशेष रूप से सीडी 34 + एचपी की उनकी संरचना में उन्हें एक उल्लेखनीय आकर्षक स्रोत10बना रहा है। मानव एचपी स्रोत के रूप में एलआरएफ को पहले ही अक्षुण्ण कार्यात्मक क्षमताओं के साथ कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए प्रदर्शित किया जा चुका है11. इस स्रोत प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए प्रचुर मात्रा में और सस्ती होने का लाभ है। इस संदर्भ में, यह लेख क्रमिक रूप से वर्णन करता है: i) LRFs से CD34+ HP का निष्कर्षण और चयन; ii) एक दो चरण अनुकूलित संस्कृति, जो मेगाकारियोसाइटिक मार्ग में एचपी की प्रतिबद्धता और प्रोपलेटलेट उत्सर्जित करने में सक्षम एमके की परिपक्वता को पुनः प्राप्त करती है; iii) इन एमके से प्लेटलेट्स को कुशलतापूर्वक जारी करने के लिए एक विधि; और iv) फेनोटाइपिंग एमके और सुसंस्कृत प्लेटलेट्स के लिए एक प्रक्रिया।

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Protocol

नियंत्रण मानव नमूने volonteer रक्त दाताओं जो लिखित सूचित रक्त आधान केंद्र द्वारा भर्ती सहमति दी, जहां अनुसंधान किया गया था (Etablissement फ्रांस्वा डु गाया-ग्रांड Est) से प्राप्त किए गए । सभी प्रक्रियाओं को फ्रांस के उच्च शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय द्वारा पंजीकृत किया गया था और AC_2015_2371 संख्या के तहत पंजीकृत किया गया था । दानदाताओं ने अनुसंधान प्रयोजनों के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूनों के लिए कोधेको नंबर एसी-२००८-५६२ सहमति फार्म में अपनी मंजूरी दे दी । हेलसिंकी घोषणा के अनुसार मानव अध्ययन किया गया ।

1. एलआरएफ से सीडी 34 + कोशिकाओं (एचपी) का निष्कर्षण और चयन

  1. रीएजेंट की तैयारी (एक एलआरएफ के लिए)
    1. फ़िल्टर किए गए एल्यूशन बफर के 25 एमएल तैयार करें: फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), एसिड-साइट्रेट-डेक्सट्रोस (एसीडी) के 2.5 एमएल और विघटित भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) के 1.25 एमएल। 0.22 माइक्रोन पर फ़िल्टर करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. 2 एमएम एथिलेंडियामाइनेट्राएक्टेटिक-एसिड (ईडीटीए) के साथ पीबीएस की 500 मिलीएल तैयार करें।
    3. दो 50 एमएल ट्यूब में 25 एमएल डेंसिटी रेडिएंट मीडियम (डीजीएम) (1.077 ग्राम/एमएल) को डिस्पोज करें।
  2. एलआरएफ बैक-फ्लशिंग तौर-तरीके(चित्रा 1)
    नोट: इस कदम के लिए एक बाँझ ट्यूब वेल्डिंग मशीन की आवश्यकता होती है, जो थर्मोप्लास्टिक ट्यूबिंग के बाँझ कनेक्शन की अनुमति देती है।
    1. सबसे पहले, एलआरएफ को एक खाली 600 एमएल ट्रांसफर बैग और एलआरएफ को एक ट्यूबिंग सेट(चित्रा 1A)से कनेक्ट करें। जैवसेफ्टी कैबिनेट के तहत, खाली बैग में हैंडल किए गए एलआरएफ (एक्सएलआरएफ एक्स 25 एमएल) की संख्या के अनुरूप फ़िल्टर और तैयार एल्यूशन बफर की कुल मात्रा इंजेक्ट करें। फिर, एलआरएफ, बैकफ्लुश के माध्यम से बैग की पूरी सामग्री को धीरे-धीरे एस्पिरेट करने के लिए 30 एमएल सिरिंज का उपयोग करके कोशिकाओं को एक नई 50 एमएल ट्यूब(चित्रा 1B)में स्थानांतरित करें।
    2. लाल रक्त कोशिकाओं तलछट के लिए, डेक्सट्रान 2% के साथ आधे से कोशिका निलंबन को पतला करें और लाल रक्त कोशिकाओं को एकत्रित करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं। कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें ।

Figure 1
चित्र 1:एलआरएफ बैक फ्लशिंग तौर-तरीके। (ए)एंव एलआरएफ को ट्रांसफर बैग का बाँझ कनेक्शन और(ii)एलआरएफ को ट्यूबिंग सेट करना । }सेल कलेक्शन के लिए सीरिंज के कनेक्शन की प्रतिनिधि योजना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. पीबीएमसी संग्रह
    1. लाल रक्त कोशिकाओं तलछट के बाद, एक 50 एमएल ट्यूब में सुपरनिटेंट को हटा दें और स्थानांतरित करें और इसे पीबीएस-ईडीटीए 2 mM से भरें। धीरे-धीरे ऊपर तैयार डीजीएम पर सुपरनेट ओवरले करें। घनत्व ढाल की सतह विमान को तोड़ने के बिना सुपरनेट प्रवाह धीरे-धीरे करते हैं। ब्रेक ऑफ मोड में 30 मिनट के लिए आरटी में 400 x g पर सेंट्रलाइज।
    2. डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट के साथ पीबीएमसी लेयर को इकट्ठा करें। प्रत्येक डीजीएम ट्यूब से कोशिकाओं को एक नई बाँझ 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। पीबीएस-EDTA 2 mM के साथ प्रत्येक ट्यूब भरें और मोड पर ब्रेक में आरटी में 10 मिनट के लिए 200 x g पर पीबीएस-EDTA 2 mM के 50 मिलीलन में दो बार धोएं।
    3. पिपेट ऑफ और 50 मिलीएल पीबीएस-EDTA 2 mM के साथ सेल गोली पूल।
      नोट: रात के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के तहत एकत्र कोशिकाओं को बनाए रखने के द्वारा प्रक्रिया को रोकने की संभावना है। फिर, गठित समुच्चय को हटाने के लिए 40 माइक्रोन सेल छलनी के साथ निलंबन को फ़िल्टर करें।
  2. CD34+ कोशिका चयन
    1. पर तोड़ने के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 400 x ग्राम पर सेल संख्या और अपकेंद्रित्र निर्धारित करें।
    2. सीडी 34 चयन किट (108 कोशिकाओं के लिए पीबीएस-ईडीटीए के 300 माइक्रोन) के निर्माता द्वारा विस्तृत पीबीएस-ईडीए 2 एमएमएम की उचित मात्रा में सुपरनेट पूरी तरह से और पुनर्सर्व्य को पुन: प्राप्त करें। एफसीआर ब्लॉकिंग रिएजेंट और सीडी 34 माइक्रोमोतियों को उचित एकाग्रता में जोड़ें (108 कोशिकाओं के लिए 50 माइक्रोन)।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के बाद, सीडी 34 चयन किट (500 माइक्रोन प्रति 108 कोशिकाओं) के निर्माता द्वारा विस्तृत पीबीएस-ईडीए 2 एमएम की उचित मात्रा में सेल निलंबन और पुनर्सुस्ल में पुनर्सुस्ल धोएं।
      नोट: चयन प्रति कॉलम अधिकतम 2 x 10 9 कोशिकाओं के पारित होने के लिए कॉलम छंटाई पर कियाजाता है।
    4. चुंबक के गीले कॉलम पर नमूना पास करें। पीबीएस-ईडीटीए 2 mM के 3 मिलील के साथ दो बार धोएं और पीबीएस-ईडीए 2 एमएम के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को एल्यूट करें। नमूना की शुद्धता में सुधार करने के लिए एक ही प्रक्रिया के बाद एक नए कॉलम पर एक दूसरा रन आवश्यक है।
      नोट: ६.१ x 105 कोशिकाओं/LRF(चित्रा 2A) कीएक अपेक्षित संख्या । उच्च एलआरएफ संख्या के लिए, तदनुसार अभिकर् ती और विधियों को स्केल करें।
  3. सीडी 34+ सेल शुद्धता का मूल्यांकन
    1. CD34+ चयन के बाद प्राप्त निलंबन के 100 माइक्रोन के एक एलिकोट में जोड़ें, मानव सीडी 34-पीई एंटीबॉडी के 2 माइक्रोन या आईजीजी के 2 माइक्रोन - पीई (नियंत्रण)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
    2. 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर पीबीएस और सेंट्रलाइज के 2 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं। एस्पिरेट सुपरनेट पूरी तरह से और PBS के 200 माइक्रोन में resuspend।
    3. चित्रा 2ए और चर्चा में दर्शाए गए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा शुद्धता का विश्लेषण करें।
      नोट: 90% से ऊपर सीडी 34 + कोशिकाओं की शुद्धता की उम्मीद है(चित्रा 2Bii)।
    4. CD34+ कोशिकाओं का उपयोग सीधे करें या आगे के उपयोग के लिए फ्रीज करें।
  4. CD34 + कोशिकाओं ठंड
    नोट: CD34 + कोशिकाओं ठंड 10 6 कोशिकाओं प्रति एमएल के घनत्व पर कियाजाता है।
    1. CD34 + सेल नंबर निर्धारण के बाद, निम्नलिखित क्रायोप्रिजर्वेशन मीडिया तैयार करें: (1) 60% स्टेमस्पैन + 40% एफबीएस, (2) 40% स्टेमस्पैन + 40% एफबीएस + 20% डिमेथिल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) और 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करने की अनुमति देता है।
    2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 400 x ग्राम पर सीडी 34 + कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और ठंडे समाधान 1 में गोली को फिर से खर्च करें और फिर तुरंत ठंडे समाधान 2 (v/v) में जोड़ें।
    3. क्रायोट्यूब को तुरंत 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें और फिर क्रायोट्यूब को लिक्विड नाइट्रोजन टैंक में ट्रांसफर करें।

2. परिपक्व प्रोपलेट-असर मेगाकारियोसाइट्स का उत्पादन करने के लिए सीडी 34 + कोशिकाओं की संस्कृति और भेदभाव

नोट: सेल कल्चर प्रोटोकॉल(चित्रा 3 ए),सेल कल्चर प्रक्रिया की प्रतिनिधि योजना इस खंड में विस्तृत है।

  1. CD34+ कोशिकाएं विगलन (यदि आवश्यक हो)
    1. विगलन समाधान तैयार करें: पीबीएस के 13 एमएल -20% एफबीएस और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। केवल एक छोटे बर्फ क्रिस्टल तक क्रायोट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में जल्दी से स्थानांतरित करें। जैविक संस्कृति कैबिनेट के तहत, पूरी सामग्री को पिपेट करें, और धीरे-धीरे प्रीवार्मेड विगलिंग समाधान के 13 एमएल में स्थानांतरित करें।
    2. सेल नंबर और सेल फिजिबिलिटी निर्धारित करें।
  2. संस्कृति प्रोटोकॉल, चरण 1: 0 दिन से 7 दिन तक
    नोट: आमतौर पर संस्कृतियों ४०,० व्यवहार्य कोशिकाओं के घनत्व पर मध्यम प्रति अच्छी तरह से 1 मिली के साथ 24 अच्छी तरहसे प्लेटों में बना रहे है/२०,००० व्यवहार्य कोशिकाओं के अनुरूप/ यदि किसी भी पैमाने पर योजना बनाई जाती है तो इस घनत्व का सम्मान करना महत्वपूर्ण है ।
    1. विकास माध्यम तैयारी: सीरम-मुक्त हेमेटोपोइटिक सेल विस्तार मीडिया (पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म) में पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइन (पीएसजी) 1x, मानव कम घनत्व लिपोप्रोटीन (एचएलडीएल) 20 μg/mL पर जोड़ें, मेगाकारियोटे विस्तार 1x और स्टेम्रेजेन 1 (SR1) के साइटोकिन कॉकटेल 1μm पर।
    2. सेल सीडिंग: 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 400 x ग्राम पर गल सीडी 34 + कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को अच्छी तरह से हटा दें और कोशिकाओं को बीज देने के लिए उपयुक्त मात्रा निर्धारित करने के लिए सेल संख्या और व्यवहार्यता को पूरा करने के लिए संस्कृति मीडिया के 1 एमएल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
    3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं 400 x ग्राम और गर्म विकास माध्यम की उचित मात्रा में गोली को फिर से खर्च करें। 7 दिनों के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. संस्कृति प्रोटोकॉल, चरण 2: 7 दिन से 13 दिन तक(चित्रा 3B,13 दिन में प्रतिनिधि छवियां)
    नोट: आमतौर पर संस्कृतियों 24 में अच्छी तरह से प्लेटों में ५०,० व्यवहार्य कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर अच्छी तरह से मध्यम के 1 मिलीएल के साथ बना रहे हैं, २५,००० व्यवहार्य कोशिकाओं/सेमी² के अनुरूप । यदि किसी भी पैमाने पर योजना बनाई जाती है तो इस घनत्व का सम्मान करना महत्वपूर्ण है ।
    1. परिपक्वता माध्यम तैयारी: सीरम मुक्त हेमेटोपोइटिक सेल विस्तार मीडिया में (पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म) पीएसजी 1x, 20 माइक्रोन/एमएल पर एचएलडीएल, 50 एनजी/एमएल पर टीपीओ और 1 माइक्रोन पर एसआर1 जोड़ें।
    2. माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जांच करें। 7 दिन में, कोशिकाएं बहुत ही ढुलमुल होने के बिना कुओं या फ्लास्क को भरकर एक गोल और सजातीय उपस्थिति प्रदर्शित करती हैं।
    3. एक जैवसेफ्टी कैबिनेट के तहत, धीरे-धीरे कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। पीबीएस के साथ कुओं को धोएं। फिर, कोशिकाओं की संख्या और कोशिकाओं को बीज करने के लिए उचित मात्रा की गणना करने के लिए उनकी व्यवहार्यता निर्धारित करें।
    4. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 400 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। सुपरनैंट निकालें और पिछले चरण में गणना की गर्म मीडिया की उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 को6 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. 13 दिन में सुसंस्कृत प्लेटलेट रिलीज
    1. प्रोस्टाग्लैंडिन I 2 (पीजीआई2) और0.02 यू/एमएल की संस्कृति में 0.5 माइक्रोन जोड़ें और 1 एमएल पिपेट के साथ लगातार पांच बार पिपटिंग करें।
      नोट: प्लेटलेट्स अब माध्यम में जारी कर रहे हैं ।

3. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण (एमके फेनोटाइपिंग और सुसंस्कृत प्लेटलेट्स काउंट)

नोट: यह प्रोटोकॉल चयनित संस्कृति दिनों पर कोशिकाओं के फेनोटाइपिंग पर लागू किया जा सकता है। यह सुसंस्कृत प्लेटलेट रिलीज(चित्रा 4A,बी)की संख्या के निर्धारण की भी अनुमति देता है।

  1. एमके विश्लेषण के लिए तैयारी
    1. माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के चार सेट इस प्रकार लेबल करें: नियंत्रण के रूप में अवेलेबल कोशिकाएं, कोशिकाएं + 5 माइक्रोन सीडी 41 - एलेक्सा फ्लोर 488, सेल + 5 माइक्रोन सीडी 34 - पीईएसी7, सेल + 5 माइक्रोन सीडी41 - एलेक्सा फ्लोर 488 + 5 ΜL CD34 - PECy7। प्रति ट्यूब न्यूनतम 1.105 कोशिकाओं का उपयोग करें, प्रति ट्यूब 1.106 कोशिकाओं से अधिक न करें। साइटोमेट्री ट्यूब और विभिन्न एंटीबॉडी के अनुसार सेल निलंबन के 100 माइक्रोन में जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट।
    2. फिर, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएस-ईडीए 2 mm प्रति ट्यूब और अपकेंद्रित्र के 2 एमएल को 400 x ग्राम पर जोड़ें। अपकेंद्रित्र के दौरान, पीबीएस-ईडीटीए 2 एमएमएम + 7-अमीनोएक्टिनोमाइसिन-डी (7AAD) (1/100) का समाधान तैयार करें, प्रति ट्यूब 300 माइक्रोल समाधान के लिए अनुमति दें।
    3. सुपरनेट निकालें और 7AAD के साथ पीबीएस-ईडीए 2 एमएम के 300 माइक्रोन में गोली लें। 30 मिनट के भीतर प्रवाह साइटोमीटर के माध्यम से नमूने चलाएं।
      नोट: प्रवाह साइटोमेट्री के लिए विश्लेषण रणनीति चित्रा 3 सी में और चर्चा में दिखाया गया है।
  2. सुसंस्कृत प्लेटलेट विश्लेषण के लिए ट्यूब तैयारी
    1. इस प्रकार माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के चार सेट लेबल करें: नियंत्रण के रूप में अवेलेबल कोशिकाएं, कोशिकाएं + 5 माइक्रोन सीडी 41 - एलेक्सा फ्लोर 488, सेल + 20 माइक्रोन सीडी 42ए - पीई, सेल + 5 माइक्रोन सीडी41 - एलेक्सा फ्लोर 488 + 20 L CD42a - पीई। संस्कृति में लगातार पांच पिप्टिंग के बाद, फ्लोरोसेंट मोतियों की एक अंशांकित संख्या वाले साइटोमेट्री के लिए ट्यूब में निलंबन के 300 माइक्रोन को स्थानांतरित करें।
    2. 30 मिनट के लिए आरटी में अंधेरे में एंटीबॉडी और इनक्यूबेट जोड़ें।
    3. 30 मिनट के भीतर प्रवाह साइटोमीटर के माध्यम से नमूनों को चलाने और ५,००० मोतियों के पारित होने के लिए अधिग्रहण सेट ।
      नोट: प्रवाह साइटोमेट्री के लिए विश्लेषण रणनीति चित्रा 4B में और चर्चा में दिखाया गया है।

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Representative Results

एलआरएफ से सीडी 34+ कोशिकाओं का निष्कर्षण और चयन
यहां, पेयटूर एट अल9से प्राप्त विधि, ल्यूकोसाइट हटाने के बाद ब्लड बैंकों में उपलब्ध सीडी 34+ कोशिकाओं के निष्कर्षण और चयन का वर्णन करती है। बैकफ्लुश प्रक्रिया के बाद, आमतौर पर 1.03 x 10 ± 2.45 x10 8 कोशिकाएं/एलआरएफ (मीन±एसईएम; एन = 155) 94.88 ± 0.10%(चित्रा 2 ए आई) की व्यवहार्यता के साथ बरामद किए जातेहैं। CD34 सकारात्मक चयन के बाद, 615.54 x 103 ± 12.28 कोशिकाओं/एलआरएफ का औसत प्राप्त किया जाता है (एन = 155)(चित्रा 2A ii)। यदि कोशिकाओं की संख्या ३००,००० से कम है, तो यह निष्कर्ष निकाला जाना चाहिए कि प्रक्रिया को सही ढंग से नहीं किया गया है और इसे रोका जाना चाहिए । CD34 चयन की सफलता का मूल्यांकन करने के लिए, सीडी 34 + कोशिकाओं की शुद्धता का आकलन फ्लो साइटोमेट्री(चित्रा 2B)द्वारा किया जाता है। नियमित रूप से, 90% से ऊपर की शुद्धता (91.88 ± 0.79%)(चित्रा 2 B)। ७५% से नीचे एक शुद्धता का मतलब यह हो सकता है कि प्रोटोकॉल के संचालन और विशेष रूप से स्तंभों के उन्मूलन में एक समस्या रही है । एक 75% शुद्धता के नीचे कोशिकाओं को संस्कृति प्रयोगों के लिए संरक्षित नहीं कर रहे हैं।

Figure 2
चित्रा 2:CD34 + सेल नंबर/एलआरएफ और CD34 शुद्धता विश्लेषण। (A)(i)सेल काउंटर द्वारा एक विश्लेषण, कोशिकाओं की संख्या और उनकी व्यवहार्यता दोनों PBMC संग्रह और CD34 चयन सहित प्रक्रिया के बाद प्राप्त किया जाता है ((1.03.109 ± 2.45.108 कोशिकाओं/LRF (मतलब ± SEM n=155) 94.88 ± 0.10% (n = 155)) की व्यवहार्यता के साथ)। (ii)सेल काउंटर द्वारा एक विश्लेषण, CD34 चयन (615.54 x 103 ± 12.28 कोशिकाओं/एलआरएफ (एन = 155)) के बाद भी किया जाता है। (ख)सीडी 34 शुद्धता का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है। (i)कोशिकाओं को सीडी 34-पीई एंटीबॉडी से दाग दिया गया था और उनके एफएससी/एसएससी मापदंडों पर पहचाना गया था । 2तितर-बितर संकेत और सीडी 34 अभिव्यक्ति विश्लेषण के आधार पर शुद्धता का निर्धारण होता है। CD34 मार्कर के लिए नकारात्मक नियंत्रण के आधार पर CD34 सकारात्मकता के एक पूर्व गेट का उपयोग किया गया था। (iii)जैसा कि बार ग्राफ पर देखा जा सकता है, 90% (91.88 ± 0.79% (एन = 17)) से ऊपर सीडी 34 + कोशिकाओं की शुद्धता की उम्मीद है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एमके-असर प्रोपलेटलेट्स की भिन्नता और परिपक्वता
वर्णित सेल संस्कृति प्रक्रिया दो चरणों में विभाजित है। पहला, दिन (डी) 0 से डी 7 तक, साइटोकिन्स के संयोजन और रासायनिक यौगिक एसआर 1 के अलावा के जवाब में मेगाकारियोसाइटिक मार्ग में एचपी प्रसार और प्रतिबद्धता के लिए समर्पित है। दूसरा, D7 से D13 तक, टीपीओ और एसआर 1(चित्रा 3 ए)के अलावा एमके परिपक्वता और प्रोपलेट एक्सटेंशन पर केंद्रित है। संस्कृति के गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में, सेल गिनती, सेल व्यवहार्यता का निर्धारण, और कोशिकाओं की फेनोटाइपिंग, D7 और D10 पर व्याप्त हैं। इन चरणों को चुना गया है क्योंकि वे एचपी प्रतिबद्धता, D7 और एमके परिपक्वता, D10, क्रमशः (व्यक्तिगत डेटा) के लिए महत्वपूर्ण हैं। D7 और 10 में, प्रसार नियमित रूप से x4.16 ± 0.25 (एन = 34) और x2.30 ± 0.16 (एन = 5) है, जिसमें सेल व्यवहार्यता 86.38 ± 0.73% (एन = 34) के बीच शामिल है; और 84.80 ± 2.67% (एन = 5)(चित्रा 3B)। सेल फेनोटाइपिंग के संबंध में, जैसा कि चित्रा 3 सीमें दिखाया गया है, डी0 में, सीडी 34 के लिए 90% से अधिक कोशिकाएं सकारात्मक हैं। फिर, CD34 + कोशिकाएं मेगाकैरियोसाइटिक वंश की ओर प्रतिबद्ध हो जाती हैं, जैसा कि सीडी 41 के प्रेत द्वारा देखा जाता है, जो एमकेपी का एक विशिष्ट और प्रारंभिक मार्कर है। दरअसल, D7 पर, 50.20 ± 2.90% कोशिकाएं सीडी 34 और सीडी 41(चित्रा 3बीआई)दोनों के लिए सकारात्मक हैं। फिर, एमके उनकी परिपक्वता में सुधार करता है। D10 में, अधिकांश एमके परिपक्व हैं, सीडी 41 के लिए 4.70% से कम कोशिकाएं नकारात्मक होने के ± 47.90 ± 8.90% सीडी 34+सीडी 41+ और 36.40 ± 12.40% सीडी 34-सीडी 41+ (चित्रा 3Biii)के लिए नकारात्मक है।

Figure 3
चित्र 3:एमके-असर प्रोपलेट्स का भिन्नताकरण और परिपक्वता। }सेल कल्चर प्रोसीजर की प्रतिनिधि योजना। एक दो कदम विधि का उपयोग किया जाता है: D0 से D7 (SR1 और साइटोकिन्स का कॉकटेल) और D7 से D13 (SR1 और TPO) तक एक परिपक्वता कदम। D13 में, सुसंस्कृत प्लेटलेट्स लगातार पांच पिपटिंग के बाद जारी किया जा सकता है । (ख)(i)डी 7 पर प्रसार दर (x4.16 ± 0.25 (एन = 34)) और सेल व्यवहार्यता (86.38 ± 0.73% (एन = 34)) । (ii)डी10 (x2.30 ± 0.16 (n = 5)) और सेल व्यवहार्यता (84.80 ± 2.67% (एन = 5)) पर प्रसार दर) । (ग)संस्कृति में एमके के फेनोटाइपिक विकास की प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण राज्याय। D0 में, 95.80 ± 0.80% कोशिकाएं सीडी 34 सकारात्मक (एन = 3) हैं। D7 में, 50.20 ± 2.90% कोशिकाएं सीडी 34 और सीडी 41 के लिए सकारात्मक हैं। D10 में, सीडी 41 के लिए 15.60 ± 4.70% कोशिकाएं नकारात्मक हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सुसंस्कृत प्लेटलेट्स रिलीज, 13 दिन
D13 में कुओं की जांच गोल एमके और प्रोपलेट असर एमके(चित्रा 4A)से पता चलता है । सुसंस्कृत एमके का औसतन 35% प्रोपलेट्स12का विस्तार करता है। ध्यान दें, D13 प्रोपलेट एक्सटेंशन और प्लेटलेट रिलीज के लिए इष्टतम दिन का प्रतिनिधित्व करता है। यदि प्रोपलेट्स उत्सर्जित करने में सक्षम एमके का अपेक्षित स्तर नहीं पहुंचा है, तो संस्कृति प्रक्रिया के साथ कुछ गलत हो गया होगा और परिणामों को ध्यान में नहीं रखा जाना चाहिए ।

हालांकि परिपक्व एमके से प्लेटलेट रिलीज को बढ़ावा देने वाले सटीक तंत्र अभी भी खराब समझ रहे हैं, यह सर्वविदित है कि हेमोडायनामिक ताकतें अपरिहार्य हैं। इन ताकतों को विट्रो मेंनकल करने के लिए, प्रोपलेट-असर वाले एमके वाले निलंबन को P1000 शंकु के साथ पांच बार पीछे हटाया जाता है और फिर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जाता है। इस उद्देश्य के लिए, फ्लोरोसेंट मोतियों की एक अंशांकित संख्या वाली ट्यूबों का उपयोग किया जाता है। सबसे पहले, ट्यूब में मौजूद मोतियों को CD41-Alexa-fluor 488/PErcP-Cy5 विंडो(चित्रा 4Bi,लाल रंग में) पर गेट किया जाता है। फिर, सुसंस्कृत प्लेटलेट्स को प्री-गेट (प्लेटलेट जैसे तत्वों) में कल्पना की जाती है, जो आगे के स्कैटर (एफएससी) और देशी प्लेटलेट्स(चित्रा 4बीआई)के साइड स्कैटर (एसएससी) मापदंडों पर निर्धारित होती है। प्लेटलेट्स की संख्या तो उनके CD41/CD42a सकारात्मकता(चित्रा 4Biii)पर निर्धारित किया जाता है । सेल गिनती 5,000 मोती पर इस प्रोटोकॉल में बंद कर दिया है, लेकिन एक और निश्चित संख्या आपूर्तिकर्ता की सिफारिश के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है। प्राप्त आंकड़ों से, प्रति 5,000 मोतियों में गिने जाने वाले प्लेटलेट्स की संख्या नियमित रूप से 24.01 ± 92 (एन = 15)(चित्रा 4C)के औसत से होती है। प्रवाह साइटोमीटर द्वारा 5,000 मोतियों की गणना करने के लिए एस्पिप्ट की मात्रा को जानना (प्रत्येक साइटोमीटर के लिए गणना की जानी है) और संस्कृति की कुल मात्रा, जारी किए गए सुसंस्कृत प्लेटलेट्स की कुल संख्या का अनुमान प्राप्त करना संभव है।

Figure 4
चित्रा 4:13 दिन में सुसंस्कृत प्लेटलेट्स रिलीज। (A)D13 पर एमके उत्सर्जक प्रोपलेट्स की प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि । (ख)सुसंस्कृत प्लेटलेट रिलीज की मात्रा निर्धारित करने की रणनीति । (i)मोतियों को सीडी41-एलेक्सा-फ्लोर 488/पीआरसीपी-साइ5 विंडो (लाल रंग में) पर गेट किया जाता है। 2,मूल प्लेटलेट्स (ग्रे डॉट्स) के एफएससी/एसएससी मापदंडों पर निर्धारित गेट में प्लेटलेट जैसे तत्वों की कल्पना की जाती है। 3संस्कारी प्लेटलेट्स का निर्धारण उनकी सीडी41/सीडी42 सकारात्मकता (बैंगनी) पर किया जाता है। (ग)प्रति ५,००० मोतियों में गिने जाने वाले प्लेटलेट्स की संख्या प्राप्त की जा सकती है, नियमित रूप से औसतन २४,०११ ± ९१९ (एन = 15) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक नजर में प्रक्रिया
विधि को बेहतर ढंग से संक्षेप में प्रस्तुत करने और प्रत्येक चरण को समझने के लिए, प्रोटोकॉल चरण को संक्षेप में प्रस्तुत करने वाला एक पोस्टर चित्रा 5में प्रस्तुत किया गया है। यह सारांश पत्र संस्कृति कक्ष में प्रदर्शित किया जा सकता है और एक ज्ञापन के रूप में सेवा करते हैं । ध्यान दें, प्रयोगों की सफलता केवल प्रदान की तालिका में इंगित उत्पाद संदर्भों के साथ गारंटी है।

Figure 5
चित्रा 5:CD34+का अलगाव । पोस्टर कदम से कदम प्रोटोकॉल सारांश । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल रक्त-व्युत्पन्न एचपी से प्रोपलेट्स उत्सर्जित करने और संस्कृति माध्यम से प्लेटलेट्स जारी करने में सक्षम एमके के उत्पादन के लिए एक विधि का वर्णन करता है। एचपी एलआरएफ, रक्त बैंकों के एक उप-उत्पाद से प्राप्त किया जाता है, जो सेलुलर रक्त उत्पादों से दूषित ल्यूकोसाइट्स को हटाने और प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि यह विधि अपेक्षाकृत सरल है, कुछ बिंदुओं पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है।

घनत्व ढाल माध्यम (चरण 1.3.1) पर सेल निलंबन का जमाव मिश्रण (लाल सामग्री) से बचने के लिए धीरे से किया जाना चाहिए। यदि यह कदम सावधानीपूर्वक नहीं किया जाता है, तो प्रोटोकॉल को इस बिंदु पर बंद कर देना चाहिए। इसी तरह, चरण 1.3.1 में, ब्रेक को अंशों को मिलाने से बचने के लिए ऑफ मोड पर होना चाहिए। यदि नहीं, तो एचपी चयन को निलंबित किया जाना चाहिए। जैसा कि प्रोटोकॉल, धारा 1.4 में दर्शाया गया है, पीबीएमसी संग्रह के बाद प्रक्रिया को बाधित किया जा सकता है। इस मामले में, कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आंदोलन के तहत बनाए रखा जा सकता है। फिर, गठित समुच्चय को हटाने के लिए 40 माइक्रोन सेल छन्नी का उपयोग करें, जो बाद के CD34 चयन पर प्रभाव डाल सकता है। ध्यान दें, प्रक्रिया में बाधा डालने से CD34+ कोशिकाओं की उपज और शुद्धता प्रभावित नहीं होती है। CD34 चयन के अंत में, कोशिकाओं को बीज करने के लिए शुद्धता 75% से अधिक होनी चाहिए क्योंकि, पिछले अध्ययन में, एमके की भेदभाव और परिपक्वता इस शुद्धता12 (चित्रा 2)से नीचे खराब थी।

CD34+ कोशिकाओं के विगलन पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए, जिसे कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित करने से बचने के लिए जल्दी से किया जाना चाहिए। इसके अलावा, सीरम का कोई निशान नहीं छोड़ने के लिए सावधानी से धोने के कदम उठाए जाने चाहिए। सेल सीडिंग घनत्व का सम्मान किया जाना चाहिए क्योंकि इसे एमकेपी मार्ग और एमके परिपक्वता(चित्रा 3 ए)के लिए इष्टतम सीडी 34 प्रतिबद्धता के लिए कड़ाई से चुना गया है।

एमके के भेदभाव और परिपक्वता का पालन करने के लिए एक सेल फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल का प्रस्ताव है। यह प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत बुनियादी है, लेकिन साइटोमीटर पर विश्वसनीय सेटिंग्स सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण के प्रत्येक दिन के लिए उपलब्ध सभी नियंत्रण ट्यूबों, दोनों अवेलेबल और एकल लेबलिंग ट्यूबों का होना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि संस्कृति सुचारू रूप से चलती है, प्रक्रिया के साथ प्रसार की जानकारी एकत्र करना महत्वपूर्ण है । D7 में, औसत प्रसार 2 से 4 गुना13के बीच है। यह प्रसार प्रयोगों के बीच थोड़ा बदलता है, क्योंकि प्रत्येक एलआरएफ में 8 दानदाताओं की कोशिकाएं शामिल होती हैं। विविधताओं को और अधिक सुचारू करने के लिए, 4 से 8 एलआरएफ तक समानांतर रूप से प्राप्त कोशिकाओं को जोड़ना संभव है।

प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को देखना संभव है लेकिन कोशिकाओं को हर दिन नहीं देखा जाना चाहिए क्योंकि वे तापमान विविधताओं के प्रति संवेदनशील हैं। इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाते समय, प्रोप्लेट को तोड़ने से बचने के लिए धीमी गति से आंदोलन करना सुनिश्चित करें।

प्लेटलेट रिलीज के संबंध में, लगातार पांच बार पाइपिंग की आवश्यकता होती है। कम करना इष्टतम प्लेटलेट रिलीज सुनिश्चित नहीं करता है और अधिक करना उनकी कार्यक्षमता के लिए हानिकारक है12. इस चरण में सबसे महत्वपूर्ण पहलू प्लेटलेट रिलीज14, 15, 16के लिए आवश्यक नियमित प्रवाह उत्पन्न करने के लिए सटीक और नियमित आंदोलनों का उपयोग करना है। इसलिए लगातार पांच पिप्टिंग की विधि साहित्य में वर्णित पैदावार के आधार पर संतोषजनक प्रदर्शन परिणामों के साथ प्रदर्शन करने के लिए सरल और आसान है। जारी प्लेटलेट्स की संख्या का निर्धारण धारा 3.3 में चित्र 4 बी में दर्शाए गए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण की रणनीति का उपयोग करके किया जा सकता है। जारी प्लेटलेट्स की गुणवत्ता को अल्ट्रास्ट्रक्चर (आकृति विज्ञान, आकार, कणिका सामग्री) और फ़ंक्शन (हेमेसिस) के संदर्भ में डो सैक्रामेंटो एट अल में अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, यह प्रदर्शित करता है कि ये सुसंस्कृत प्लेटलेट्स मूल लोगों के समान हैं13।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से छोटी मात्रा वाली संस्कृतियों के लिए उपयुक्त है लेकिन बड़े पैमाने पर संस्कृति पर लागू नहीं होता है । इसलिए यह प्लेटलेट बायोजेनेसिस के अध्ययन के लिए एक इष्टतम विधि है ताकि छोटे अणुओं, agonists, या विरोधी, उदाहरण के लिए जोड़कर प्लेटलेट उत्पादन को नियंत्रित करने वाले आणविक और सेलुलर तंत्र को बेहतर ढंग से समझा जा सके । इसके अलावा, और आगे तंत्र है कि एमके प्रतिबद्धता, एमके परिपक्वता, और प्लेटलेट उत्पादन को विनियमित का पता लगाने के लिए, अब यह आनुवंशिक रूप से एक CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन विधि का उपयोग कर CD34+ हिमाचल प्रदेश में हेरफेर करने के लिए संभव है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एएनआर (एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे) ग्रांट एएनआर-17-CE14-0001-1 द्वारा समर्थित किया गया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD Biolegend 558819
ACD EFS-Alsace NA
Anti-CD34-PE  Miltenyi biotec 130-081-002
Anti-CD34-PECy7 eBioscience 25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488 Biolegend 303724
Anti-CD42a-PE BD Bioscience 559919
Apyrase EFS-Alsace NA
BD Trucount Tubes BD Bioscience 340334
CD34 MicroBead Kit UltraPure, human  Miltenyi biotec 130-100-453
Centrifuge Heraeus Megafuge 1.OR Or equivalent material
Compteur ADAM  DiagitalBio NA Or equivalent material
Cryotubes Dutscher 55002 Or equivalent material
Dextran from leuconostoc spp  Sigma 31392-50g Or equivalent material
DMSO Hybri-max  Sigma D2650
EDTA 0.5 M  Gibco 15575-039
Eppendorf 1,5 mL  Dutscher 616201 Or equivalent material
Filtration unit Steriflip PVDF Merck Millipore Ltd SE1M179M6
Flow Cytometer BD Bioscience Fortessa
Human LDL Stemcell technologies #02698
ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL Bayer MA038EX
Inserts Fenwal R4R1401 Or equivalent material
Laminar flow hood  Holten NA Archived product
LS Columms  Miltenyi Biotec 130-042-401 
Lymphoprep Stemcell 7861
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PBS (-) Life Technologies 14190-169  Or equivalent material
PGi2 Sigma P6188
Poches de transferts 600ml  Macopharma VSE4001XA
Pre-Separation Filters (30µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
StemRegenin 1 (SR1) Stemcell technologies #72344
StemSpan Expansion Supplement (100x) Stemcell technologies #02696
StemSpan-SFEM  Stemcell technologies #09650
Stericup Durapore 0,22µm PVDF Merck Millipore Ltd SCGVU05RE
SVF Hyclone  Thermos scientific SH3007103
Syringues 30 mL  Terumo SS*30ESE1 Or equivalent material
Syringe filters Millex 0,22µM PVDF Merck Millipore Ltd SLGV033RB
TPO Stemcell technologies #02822
Tubes 50 mL Sarstedt 62.548.004 PP Or equivalent material
Tubes 15 mL  Sarstedt 62.554.001 PP Or equivalent material
Tubulures B Braun 4055137 Or equivalent material

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References

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जीव विज्ञान अंक 171
मेगाकारियोसाइट विभेदन और प्लेटलेट गठन का अध्ययन करने के लिए सेल स्रोत के रूप में ल्यूकोडेप्लेशन फिल्टर्स-व्युत्पन्न सीडी 34 + कोशिकाएं
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Pongerard, A., Mallo, L., Gachet, C., de La Salle, H., Lanza, F., Strassel, C. Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation. J. Vis. Exp. (171), e62499, doi:10.3791/62499 (2021).

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