Summary
Denne protokollen beskriver i detalj alle trinnene som er involvert i å skaffe leukofilter-avledede CD34+ hematopoietiske forfedre og deres in vitro differensiering og modning i proplateletbærende megakaryocytter som er i stand til å frigjøre blodplater i kulturmediet. Denne prosedyren er nyttig for grundig analyse av cellulære og molekylære mekanismer som kontrollerer megakaryopoiesis.
Abstract
In vitro-utvidelsen og differensiering av menneskelige hematopoietiske forfedre til megakaryocytter som er i stand til å forlenge proplater og frigjøre blodplater, tillater en grundig studie av mekanismene som ligger til grunn for blodplatebiogenese. Tilgjengelige kulturprotokoller er for det meste basert på hematopoietiske forfedre avledet fra benmarg eller ledningsblod som reiser en rekke etiske, tekniske og økonomiske bekymringer. Hvis det allerede finnes tilgjengelige protokoller for å skaffe CD34-celler fra perifert blod, foreslår dette manuskriptet en enkel og optimalisert protokoll for å skaffe CD34+ celler fra leukodepletion-filtre som er lett tilgjengelige i blodsentre. Disse cellene er isolert fra leukodepletion filtre som brukes i utarbeidelsen av blodoverføringsprodukter, tilsvarende åtte bloddonasjoner. Disse filtrene er ment å bli forkastet. En detaljert prosedyre for å samle hematopoietiske forfedre identifisert som CD34 + celler fra disse filtrene er beskrevet. Metoden for å oppnå modne megakaryocytter som utvider proplater mens de diskuterer deres fenotypiske evolusjon, er også detaljert. Til slutt presenterer protokollen en kalibrert pipetteringsmetode, for effektivt å frigjøre blodplater som er morfologiske og funksjonelt lik innfødte. Denne protokollen kan tjene som grunnlag for å evaluere farmakologiske forbindelser som virker på ulike trinn i prosessen for å dissekere de underliggende mekanismene og nærme seg in vivo-blodplater.
Introduction
Blodplater kommer fra spesialiserte store polyploide celler, megakaryocyttene (MK), som stammer fra en konstant og finjustert produksjonsprosess kjent som megakaryopoiesis (MKP). På toppen av denne prosessen er hematopoietiske stamceller som i kontakt med benmargsmiljøet (cytokiner, transkripsjonsfaktorer, hematopoietisk nisje), vil kunne spre seg og skille seg ut i hematopoietiske forfedre (HP) som er i stand til å forplikte seg mot megakaryocytisk vei, noe som gir opphav til umodne MKs1. Under påvirkning av ulike cytokiner, og spesielt trombopoetin (TPO), som er den store cytokin av MKP; MK vil da gjennomgå to store stadier av modning: endomitose og utvikling av avgrensningsmembraner (DMS). Denne fullt modne MK vises deretter nær et bihuleformet kar der det kan avgi cytoplasmatiske utvidelser, proplatelene, som frigjøres under blodstrømmen og deretter omdannet til funksjonelle blodplater2. Kloningen av TPO i 19943 ga et løft i studiet av MKP ved å akselerere utviklingen av in vitro-kulturteknikker som tillater HP-differensiering og MK-modning.
Det er mange patologier som påvirker blodplater, både når det gjelder blodplatenummer (økning eller reduksjon) og funksjon4,5. Å kunne rekapitulere MKP in vitro fra menneskelig HP kan forbedre forståelsen av de molekylære og cellulære mekanismene som ligger til grunn for denne prosessen og til slutt den terapeutiske behandlingen av pasienter.
Ulike kilder til menneskelig HP er egnet: ledningsblod, benmarg og perifert blod6,7,8. Høsting av HP fra perifert blod reiser mindre logistiske og etiske problemer enn deres utvinning fra ledningsblod eller benmargen. HP kan gjenvinnes fra leukaferese eller buffy coat, men disse kildene er dyre og ikke alltid tilgjengelige i blodsentre. Andre protokoller, billigere og enklere å utføre, tillater direkte gjenoppretting av humane perifere mononukleære celler i blodet (PBMCer) uten behov for tidligere CD34-drevet isolasjon4,8. Renheten til megakaryocytter er imidlertid ikke tilfredsstillende med denne metoden, og et utvalg av CD34+ celler fra PBMC anbefales for optimal differensiering i MK. Dette førte oss til å implementere en HP-rensing fra leukoreduksjonsfiltre (LRF), rutinemessig brukt i blodbanker for å fjerne hvite blodlegemer og dermed unngå negative immunologiske reaksjoner9. Faktisk, siden 1998, har blodplatekonsentrater blitt automatisk leukodepleted i Frankrike. På slutten av denne prosessen kastes LRF og alle cellene som beholdes i LRF blir ødelagt. Celler i LRFer er derfor lett tilgjengelige uten ekstra kostnad. LRFer har et cellulært innhold i nærheten av det som oppnås ved leukaferese eller i buffy strøk, spesielt i deres sammensetning av CD34 + HP, noe som gjør dem til en bemerkelsesverdig attraktiv kilde10. LRF som en menneskelig HP-kilde er allerede demonstrert for å gi celler intakt funksjonell kapasitet11. Denne kilden har fordelen av å være rikelig og rimelig for laboratorieforskning. I denne sammenhengen beskriver denne artikkelen suksessivt: i) utvinning og valg av CD34+ HP fra LRFer; ii) en tofaset optimalisert kultur, som rekapitulerer forpliktelsen til HP inn i megakaryocytisk vei og modningen av MK som er i stand til å avgi proplatelets; iii) en metode for effektivt å frigjøre blodplater fra disse MK; og iv) en prosedyre for fenotyping av MK og dyrkede blodplater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kontroll menneskelige prøver ble innhentet fra volonteer blodgivere som ga skriftlig informert samtykke rekruttert av blodoverføringssenteret der forskningen ble utført (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Alle prosedyrer ble registrert og godkjent av det franske departementet for høyere utdanning og forskning og registrert under nummer AC_2015_2371.Giverne ga sin godkjenning i CODHECO nummer AC- 2008 - 562 samtykkeskjema, for at prøvene skulle brukes til forskningsformål. Menneskelige studier ble utført i henhold til Helsinki-erklæringen.
1. Ekstraksjon og valg av CD34+ celler (HP) fra LRF
-
Reagensens forberedelse (for en LRF)
- Forbered 25 ml filtrert elutionbuffer: 21,25 ml fosfat bufret saltvann (PBS), 2,5 ml acid-citrate-dextrose (ACD) og 1,25 ml dekomplementert foster bovint serum (FBS). Filtrer på 0,22 μm og plasser ved 37 °C.
- Forbered 500 ml PBS med 2 mM etylendiamintetraketisk syre (EDTA).
- Kast 25 ml tetthetsgradientmedium (DGM) (1,077 g/ml) i to 50 ml rør.
-
LRF-spylemodaliteter (figur 1)
MERK: Dette trinnet krever en steril rørsveisemaskin, som tillater steril tilkobling av termoplastiske slanger.- Først kobler du LRF til en tom overføringsveske på 600 ml og LRF til et slangesett (figur 1A). Under biosikkerhetsskapet injiserer du det totale volumet av filtrert og forberedt elutionbuffer som tilsvarer antall LRFer som håndteres (xLRF x 25 ml) i den tomme posen. Deretter bruker du en 30 ml sprøyte til forsiktig å aspirere hele innholdet i posen gjennom LRF, backflush og overføre cellene til et nytt 50 ml rør (Figur 1B).
- Til sedimentering av røde blodlegemer, fortynn cellesuspensjonen med halvparten med Dextran 2% og bland godt for å aggregere røde blodlegemer. Vent i 30 min ved romtemperatur (RT).
Figur 1: LRF-spylemodaliteter. (A) Representativ ordning av (i) den sterile tilkoblingen av overføringsposen til LRF og (ii) slangen som er satt til LRF. (B) Representativ ordning for tilkobling av sprøyter for celleoppsamling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
-
PBMC-samling
- Etter sedimentering av røde blodlegemer, fjern og overfør supernatanten til et 50 ml rør og fyll det med PBS-EDTA 2 mM. Legg supernatanten forsiktig over den ovennevnte DGM-en. La supernatanten flyte forsiktig uten å bryte overflateplanet til tetthetsgradienten. Sentrifuge ved 400 x g ved RT i 30 min i bremsemodus.
- Samle PBMC-laget med en engangsoverføringspipette. Overfør cellene fra hvert DGM-rør til et nytt sterilt 50 ml rør. Fyll hvert rør med PBS-EDTA 2 mM og vask to ganger i 50 ml PBS-EDTA 2 mM ved 200 x g i 10 minutter ved RT i bremsemodus.
- Pipette av og basseng cellepellet med 50 ml PBS-EDTA 2 mM.
MERK: Det er en mulighet for å stoppe prosedyren ved å opprettholde de oppsamlede cellene under agitasjon ved 4 °C om natten. Deretter filtrerer du suspensjonen med en 40 μm cellesil for å fjerne aggregatene som dannes.
-
Valg av CD34+-celler
- Bestem cellenummeret og sentrifugen ved 400 x g ved romtemperatur i 10 minutter med bruddet på.
- Aspirer supernatanten helt og resuspend i riktig volum av PBS-EDTA 2 mM detaljert av produsenten av CD34-valgsettet (300 μL PBS-EDTA for 108 celler). Tilsett FcR-blokkerende reagens og CD34-mikrober i riktig konsentrasjon (50 μL for 108 celler).
- Etter 30 min ved 4 °C, vask cellefjæringen og resuspend i riktig volum PBS-EDTA 2 mM detaljert av produsenten av CD34-valgsettet (500 μL per 108 celler).
MERK: Valget er gjort på sortering av kolonner for passering av maksimalt 2 x 109 celler per kolonne. - Send prøven over magnetens våte kolonne. Vask to ganger med 3 ml PBS-EDTA 2 mM og elute cellene med 5 ml PBS-EDTA 2 mM. En annen kjøring på en ny kolonne etter samme prosedyre er nødvendig for å forbedre renheten til prøven.
MERK: Et forventet antall på 6,1 x 105 celler/LRF (figur 2A). For høyere LRF-tall, skaler opp reagenser og metoder deretter.
-
Evaluering av CD34+ cellerenhet
- Legg til en aliquot på 100 μL suspensjon oppnådd etter CD34+ -valget, 2 μL humant CD34-PE-antistoff eller 2 μL IgG - PE (kontroll). Bland godt og inkuber i 15 min ved 4 °C.
- Vask celler ved å tilsette 2 ml PBS og sentrifuge ved 400 x g i 5 min. Aspirer supernatant helt og resuspend i 200 μL PBS.
- Analyser renheten ved flowcytometri som vist i figur 2A og i diskusjon.
MERK: Det forventes en renhet av CD34+-celler over 90 % (Figur 2Bii). - Bruk CD34+-cellene direkte eller frys for videre bruk.
-
CD34+-celler fryser
MERK: CD34+ celler frysing gjøres med en tetthet på 106 celler per ml.- Etter bestemmelse av CD34+-cellenummeret forbereder du følgende kryopreserveringsmedier: (1) 60 % stammespann + 40 % FBS, (2) 40 % stemspan + 40 % FBS + 20 % dimetylsulfoksid (DMSO) og la kjøling ved 4 °C avkjøles.
- Sentrifuger CD34+ cellene ved 400 x g ved romtemperatur i 5 min og resuspend pellet i kald løsning 1 og legg deretter umiddelbart til den kalde løsningen 2 (v / v).
- Plasser kryorørene umiddelbart i en -80 °C fryser i 24 timer og overfør deretter kryorør til den flytende nitrogentanken.
2. Kultur og differensiering av CD34+ celler for å produsere modne proplateletbærende megakaryocytter
MERK: Cellekulturprotokoll (Figur 3A), representativt oppsett av cellekulturprosedyren er beskrevet i denne delen.
-
CD34+-celler tiner (om nødvendig)
- Forbered opptiningsløsningen: 13 ml PBS-20% FBS og plasser ved 37 °C i 15 minutter. Overfør kryorørene raskt til et 37 °C vannbad til bare én liten iskrystall. Under det biologiske kulturskapet, pipette hele innholdet, og sakte overføre i 13 ml forvarsel tining løsning.
- Bestem cellenummeret og celle levedyktigheten.
-
Kulturprotokoll, trinn 1: fra dag 0 til dag 7
MERK: Vanligvis er kulturer laget i 24-brønnsplater med 1 ml medium per brønn med en tetthet på 40.000 levedyktige celler / ml, tilsvarende 20.000 levedyktige celler / cm2. Det er avgjørende å respektere denne tettheten hvis noen oppskalering er planlagt.- Vekstmediumforberedelse : I serumfrie hematopoietiske celleutvidelsesmedier (tidligere oppvarmet til 37 °C) tilsett Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) 1x, humant Lipoprotein med lav tetthet (hLDL) ved 20 μg/ml, cytokincocktail av megakaryocyttutvidelse 1x og Stemregenin 1 (SR1) ved 1 μM.
- Cellesåing : Sentrifuger de opptinte CD34+ cellene ved 400 x g ved romtemperatur i 5 min. Fjern supernatanten grundig og resuspend cellepellet i 1 ml kulturmedier og utfør en celle numerasjon og levedyktighet for å bestemme riktig volum for å frø cellene.
- Sentrifuger cellene 400 x g ved romtemperatur i 5 min og resuspend pellet i riktig volum av det varme vekstmediet. Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 7 dager.
-
Kulturprotokoll, trinn 2: fra dag 7 til dag 13 (Figur 3B, representative bilder på dag 13)
MERK: Vanligvis er kulturer laget i 24-brønnsplater med 1 ml medium per brønn med en tetthet på 50.000 levedyktige celler / ml, tilsvarende 25.000 levedyktige celler / cm². Det er avgjørende å respektere denne tettheten hvis noen oppskalering er planlagt.- Modningsmediumforberedelse: I serumfrie hematopoietiske celleutvidelsesmedier (tidligere oppvarmet til 37 °C) tilsett PSG 1x, hLDL ved 20 μg/ml, TPO ved 50 ng/ml og SR1 ved 1 μM.
- Undersøk cellene under mikroskopet. På dag 7 viser cellene et rundt og homogent utseende ved å fylle brønnene eller kolbe uten å være for flytende.
- Under et biosikkerhetsskap overfører du forsiktig cellene i et 15 ml rør. Vask brønner med PBS. Deretter bestemmer du antall celler og deres levedyktighet til å beregne riktig volum for å frø cellene.
- Sentrifuger cellene ved 400 x g ved romtemperatur i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend cellene i riktig volum av varme medier beregnet i forrige trinn. Inkuber cellene ved 37 °C, 5 % CO2 i 6 dager.
-
Utløsning av dyrket blodplate på dag 13
- Tilsett 0,5 μM prostaglandin I2 (PGI2) og 0,02 U/ml apyrase til kulturen og utfør etterfølgende pipettering fem ganger med en 1 ml pipette.
MERK: Blodplater slippes nå inn i mediet.
- Tilsett 0,5 μM prostaglandin I2 (PGI2) og 0,02 U/ml apyrase til kulturen og utfør etterfølgende pipettering fem ganger med en 1 ml pipette.
3. Flow cytometrianalyse (MK fenotyping og dyrkede blodplater teller)
MERK: Denne protokollen kan brukes på fenotyping av cellene på de valgte kulturdagene. Det tillater også bestemmelse av nummeret på den kultiverte blodplateutløsningen (Figur 4A, B).
-
Forberedelse til MK-analyse
- Merk fire sett med mikrocentrifugerør som følger: Umerkede celler som kontroll, celler + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Celler + 5 μL CD34 - PECy7, Celler + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Bruk minst 1,105 celler per rør, ikke overskrid 1,106 celler per rør. Legg til 100 μL celleoppheng per cytometrirør og de forskjellige antistoffene. Inkuber i mørket i 30 min ved 4 °C.
- Tilsett deretter 2 ml PBS-EDTA 2 mM per rør og sentrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Under sentrifugering, lag en løsning av PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomycin-D (7AAD) (1/100), gi mulighet for 300 μL løsning per rør.
- Fjern supernatanten og ta opp pelletsen i 300 μL PBS-EDTA 2 mM med 7AAD. Kjør prøver gjennom strømningscytometeret innen 30 min.
MERK: Analysestrategi for strømningscytometri er vist i figur 3C og i diskusjonen.
-
Rørforberedelse for kultivert blodplateanalyse
- Merk fire sett med mikrocentrifugerør som følger: Umerkede celler som kontroll, Celler + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Celler + 20 μL CD42a - PE, Celler + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Etter fem påfølgende pipettering i kulturen godt, overføre 300 μL av suspensjonen i røret for cytometri som inneholder et kalibrert antall fluorescerende perler.
- Tilsett antistoffer og inkuber i mørket på RT i 30 min.
- Kjør prøvene gjennom strømningscytometeret innen 30 minutter og sett oppkjøpet for passering av 5000 perler.
MERK: Analysestrategi for strømningscytometri er vist i figur 4B og i diskusjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekstraksjon og valg av CD34+-celler fra LRFer
Her beskriver metoden, avledet fra Peytour et al.9, utvinning og valg av CD34+ celler fra kasserte LRFer tilgjengelig i blodbanker etter fjerning av leukocytt. Etter backflush -prosedyren gjenopprettes vanligvis 1,03 x10 9 ± 2,45 x10 8 celler/LRF (Middel±SEM; n = 155) med en levedyktighet på 94,88 ± 0,10 % (figur 2A i). Etter det positive cd34-utvalget oppnås et gjennomsnitt på 615,54 x 103 ± 12,28 celler/LRF (n = 155) (Figur 2A ii). Hvis antall celler er mindre enn 300.000, må det konkluderes med at prosedyren ikke er utført riktig og må stoppes. For å evaluere suksessen til CD34-utvalget vurderes renheten til CD34+-celler ved strømningscytometri (figur 2B). Rutinemessig forventes en renhet over 90 % (91,88 ± 0,79 %) (figur 2B). En renhet under 75% kan bety at det har vært et problem med å gjennomføre protokollen og spesielt elution av kolonnene. Under en 75% renhet er cellene ikke bevart for kultureksperimenter.
Figur 2: CD34+ cellenummer/LRF- og CD34-renhetsanalyse. (A) (i) En analyse, etter celleteller, av antall celler og deres levedyktighet oppnådd etter prosedyren, inkludert både PBMC-samling og CD34-valg, utføres ((1.03.109 ± 2.45.108 celler/LRF (Mean ± SEM; n=155) med en levedyktighet på 94,88 ± 0,10 % (n = 155)). (ii) En analyse, etter celleteller, utføres også etter CD34-merking (615,54 x 103 ± 12,28 celler/LRF (n = 155)). (B) CD34 Renhet analyseres ved strømningscytometri. (i) Celler ble farget med et CD34-PE-antistoff og identifisert på FSC/SSC-parametrene. (ii) Basert på scatter-signalet og CD34-uttrykksanalysen bestemmes renheten. En forhåndsport av CD34-positivitet ble brukt basert på den negative kontrollen for CD34-markøren. (iii) Som det fremgår av stolpediagrammet, forventes en renhet av CD34+-celler over 90 % (91,88 ± 0,79 % (n = 17)). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Differensiasjon og modning av MK-bærende proplater
Cellekulturprosedyren som er beskrevet, er delt i to trinn. Den første, fra dag (D) 0 til D7, er dedikert til HP-spredning og forpliktelse til megakaryocytisk vei som svar på en kombinasjon av cytokiner og tilsetning av en kjemisk forbindelse SR1. Den andre, fra D7 til D13, er fokusert på MK modning og proplatelet forlengelse etter tillegg av TPO og SR1 (Figur 3A). Som kvalitetskontroll av kulturen, blir celletelling, bestemmelse av celle levedyktighet og fenotyping av celler perfomert ved D7 og D10. Disse stadiene er valgt fordi de er avgjørende for HPs forpliktelse, D7 og MK modning, henholdsvis D10 (personopplysninger). Ved D7 og 10 er spredningen rutinemessig på henholdsvis x4,16 ± 0,25 (n = 34) og x2,30 ± 0,16 (n = 5), med en celle levedyktighet på mellom 86,38 ± 0,73 % (n = 34); og 84,80 ± 2,67 % (n = 5) (Figur 3B). Når det gjelder cellefenotyping, som vist i figur 3C, ved D0, er mer enn 90% av cellene positive for CD34. Deretter blir CD34+ celler forpliktet mot megakaryocytisk avledning, som vitnet av åpenbaringen av CD41, en spesifikk og tidlig markør for MKP. Faktisk, ved D7, er 50,20 ± 2,90% av cellene positive for både CD34 og CD41 (Figur 3Bii). Deretter forbedrer MK modningen. Ved D10 er et flertall av MK modne, med mindre enn 15,60 ± 4,70% av cellene som er negative for CD41, 47,90 ± 8,90% er CD34+CD41+ og 36,40 ± 12,40% er CD34-CD41+ (Figur 3iiBi).
Figur 3: Differensiering og modning av MK-bærende proplater. (A) Representativ ordning for cellekulturprosedyren. En to-trinns metode brukes: et spredningstrinn fra D0 til D7 (SR1 og cocktail av cytokiner) og et modningstrinn fra D7 til D13 (SR1 og TPO). Ved D13 kan dyrkede blodplater frigjøres etter fem påfølgende pipettering. (B) (i) Spredningshastighet ved D7 (x4,16 ± 0,25 (n = 34)) og celle levedyktighet (86,38 ± 0,73 % (n = 34)). (ii) Spredningshastighet ved D10 (x2,30 ± 0,16 (n = 5)) og celle levedyktighet (84,80 ± 2,67 % (n = 5)). (C) Flow cytometri analyse stategy av fenotypisk utvikling av MK i kultur. Ved D0 er 95,80 ± 0,80 % av cellene CD34 positive (n = 3). Ved D7 er 50,20 ± 2,90 % av cellene positive for CD34 og CD41. Ved D10 er mindre enn 15,60 ± 4,70 % av cellene negative for CD41. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Utløsning av dyrkede blodplater, dag 13
Undersøkelse av brønnene ved D13 viser rund MK og proplateletbærende MK (figur 4A). I gjennomsnitt 35% av dyrket MK utvide proplatelets12. Vær oppmerksom på at D13 representerer den optimale dagen for forlengelse av proplatelet og blodplateutløsning. Hvis det nødvendige nivået av MK som er i stand til å avgi proplatelets ikke nås, må noe ha gått galt langs kulturprosessen, og resultatene bør ikke tas i betraktning.
Selv om de eksakte mekanismene som fremmer blodplateutløsning fra moden MK fortsatt er dårlig forstått, er det velkjent at hemodynamiske krefter er uunnværlige. For å etterligne disse kreftene in vitro, suspensjonen som inneholder proplatelet-lager MK aspirert og avstøt fem ganger med en P1000 kjegle og deretter analysert av strømning cytometri. Til dette formål brukes rør som inneholder et kalibrert antall fluorescerende perler. For det første er perler til stede i røret inngjerdet på CD41-Alexa-fluor 488 / PErcP-Cy5-vinduet (Figur 4Bi, i rødt). Deretter visualiseres dyrkede blodplater i en forport (blodplatelignende elementer), bestemt på parametrene for fremoverspredning (FSC) og sidespredning (SSC) for innfødte blodplater (Figur 4Bii). Antall blodplater bestemmes deretter på CD41/CD42a-positiviteten (Figur 4Biii). Celletelling stoppes i denne protokollen ved 5000 perler, men et annet fast nummer kan brukes avhengig av leverandørens anbefaling. Fra de innsamvede dataene er antall blodplater telt per 5000 perler rutinemessig i gjennomsnitt 24,01 ± 92 (n = 15) (figur 4C). Å vite volumet aspirert av strømningscytometeret for å telle 5000 perler (som skal beregnes for hvert cytometer) og det totale volumet av kultur, er det mulig å oppnå en tilnærming av det totale antall dyrkede blodplater utgitt.
Figur 4: Utløsning av dyrkede blodplater på dag 13. (A) Representativt lysmikroskopibilde av MK som avgir proplater ved D13. (B) Strategi for å kvantifisere utløsning av dyrket blodplate. (i) Perler er inngjerdet på CD41-Alexa-fluor 488/PErcP-Cy5-vinduet (i rødt). (ii) Blodplatelignende elementer visualiseres i en port som bestemmes på FSC/SSC-parametrene til innfødte blodplater (grå prikker). (iii) Dyrkede blodplater bestemmes på CD41/CD42-positiviteten (lilla). (C) Antall blodplater telt per 5000 perler kan oppnås, rutinemessig et gjennomsnitt på 24 011 ± 919 (n = 15). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
En oversikt over prosedyren
For bedre å oppsummere metoden og forstå hvert trinn, presenteres en plakat som oppsummerer protokollen trinn for trinn i figur 5. Dette sammendragsarket kan vises i kulturrommet og fungere som et notat. Vær oppmerksom på at suksessen til forsøkene bare er garantert med produktreferansene som er angitt i tabellen som følger med.
Figur 5: Isolering av CD34+. Plakat som oppsummerer protokollen trinn for trinn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for å produsere MK som er i stand til å sende ut proplater fra blodavledet HP og frigjøre blodplater fra kulturmediet. HP er hentet fra LRF, et biprodukt av blodbankene, som brukes til å fjerne forurensende leukocytter fra cellulære blodprodukter og unngå bivirkninger. Selv om denne metoden er relativt enkel, fortjener noen få punkter spesiell oppmerksomhet.
Avsetning av cellefjæringen på tetthetsgradientmediet (trinn 1.3.1) må utføres forsiktig for å unngå blanding (rødt innhold). Hvis dette trinnet ikke utføres nøye, bør protokollen stoppe på dette tidspunktet. På samme måte, også i trinn 1.3.1, må bremsen være i av-modus for å unngå å blande fraksjonene. Hvis ikke, må HP-valget suspenderes. Som angitt i protokollen, avsnitt 1.4, kan prosedyren avbrytes etter PBMC-samlingen. I dette tilfellet kan celler opprettholdes under agitasjon over natten ved 4 °C. Bruk deretter en 40 μm cellesil for å fjerne aggregatene som dannes, noe som kan påvirke det påfølgende CD34-valget. Vær oppmerksom på at avbrudd i prosedyren ikke påvirker utbyttet og renheten til CD34+ celler. På slutten av CD34-utvalget må renheten være større enn 75% for å frø cellene siden differensiering og modning av MK i en tidligere studie var dårlig under denne renheten12 (Figur 2).
Spesiell oppmerksomhet må gis til opptining av CD34+ celler, som må utføres raskt for å unngå å påvirke levedyktigheten til cellene. I tillegg må vasketrinn utføres nøye for å ikke etterlate spor av serum. Cellefrøtettheten må respekteres fordi den er nøye valgt for optimal CD34-forpliktelse til MKP-banen og MK-modningen (figur 3A).
En cellefenotypingsprotokoll foreslås å følge differensiering og modning av MK. Denne protokollen er relativt grunnleggende, men det er viktig å ha alle kontrollrørene, både umerkede og enkle merkerør, tilgjengelig for hver analysedag for å sikre pålitelige innstillinger på cytometeret. For å sikre at kulturen går jevnt, er det viktig å samle inn informasjon om spredning langs prosedyren. Ved D7 er den gjennomsnittlige spredningen mellom 2 og 4 ganger13. Denne spredningen varierer lite mellom eksperimenter, siden hver LRF består av celler fra 8 givere. For å jevne ut variasjonene ytterligere, er det mulig å kombinere celler oppnådd parallelt fra 4 til 8 LRFer.
Det er mulig å se på cellenes morfologi ved lysmikroskopi, men cellene bør ikke observeres hver dag fordi de er følsomme for temperaturvariasjoner. Når du fjerner cellene fra inkubatoren, må du sørge for å gjøre langsomme bevegelser for å unngå å bryte proplatene.
Når det gjelder blodplateutløsningen, er det nødvendig med fem ganger etterfølgende pipettering. Å gjøre mindre sikrer ikke optimal blodplateutløsning, og å gjøre mer er skadelig for funksjonaliteten12. Det viktigste aspektet i dette trinnet er å bruke presise og vanlige bevegelser, for å generere en vanlig strømning som kreves for blodplateutløsningen14,15,16. Metoden for fem påfølgende pipettering er derfor enkel og enkel å utføre med tilfredsstillende ytelsesresultater basert på utbyttene beskrevet i litteraturen. Antall frigjorte blodplater kan bestemmes som nevnt i pkt. 3.3 ved å bruke strategien for strømningscytometrianalyse vist i figur 4B. Kvaliteten på de utgitte blodplater har blitt godt dokumentert i Do Sacramento et al. når det gjelder ultrastruktur (morfologi, størrelse, granulatinnhold) og funksjon (hemostase), som viser at disse kultiverte blodplater er svært lik de innfødte13.
Protokollen som beskrives her er spesielt egnet for små volumkulturer, men gjelder ikke for storskala kultur. Det er derfor en optimal metode for studiet av blodplatebiogenese for å bedre forstå de molekylære og cellulære mekanismene som styrer blodplateproduksjonen ved å legge til små molekyler, agonister eller antagonister, for eksempel. I tillegg, og for å utforske mekanismene som regulerer MK-forpliktelsen, MK-modningen og blodplateproduksjonen ytterligere, er det nå mulig å genetisk manipulere CD34+ HP ved hjelp av en CRISPR-Cas9 genomredigeringsmetode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet har blitt støttet av ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- de Sauvage, F. J., et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand. Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).
- Almomani, M. H., Mangla, A. StatPearls. , (2020).
- Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).
- Delalat, B., et al. Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells. Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).
- Yin, T., Li, L. The stem cell niches in bone. The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).
- Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells. Bio-protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy. Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).
- Lapostolle, V., et al. Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction. Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).
- Ivanovic, Z., et al. Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy. Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).
- Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
- Do Sacramento, V., et al. Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells. Scientific Reports. 10 (1), 914 (2020).
- Blin, A., et al. Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics. Scientific Reports. 6, 21700 (2016).
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).
