Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio tutte le fasi necessarie per ottenere i progenitori ematopoietici CD34+ derivati dal leucofiltro e la loro differenziazione e maturazione in vitro in megacariociti portatori di proplatelet che sono in grado di rilasciare piastrine nel terreno di coltura. Questa procedura è utile per l'analisi approfondita dei meccanismi cellulari e molecolari che controllano la megacariopoiesi.
Abstract
L'espansione e la differenziazione in vitro di progenitori ematopoietici umani in megacariociti in grado di allungare i proplatatori e rilasciare piastrine consente uno studio approfondito dei meccanismi alla base della biogenesi piastrinica. I protocolli di coltura disponibili si basano principalmente su progenitori ematopoietici derivati dal midollo osseo o dal sangue del cordone ombelicale che sollevano una serie di preoccupazioni etiche, tecniche ed economiche. Se ci sono già protocolli disponibili per ottenere cellule CD34 dal sangue periferico, questo manoscritto propone un protocollo semplice e ottimizzato per ottenere cellule CD34 + da filtri leucodeplezione prontamente disponibili nei centri del sangue. Queste cellule sono isolate dai filtri leucodepletici utilizzati nella preparazione di prodotti trasfusionali, corrispondenti a otto donazioni di sangue. Questi filtri sono pensati per essere scartati. Viene descritta una procedura dettagliata per raccogliere progenitori ematopoietici identificati come cellule CD34+ da questi filtri. Il metodo per ottenere megacariociti maturi che estendono i proplati mentre discutono della loro evoluzione fenotipica è anche dettagliato. Infine, il protocollo presenta un metodo di pipettaggio calibrato, per rilasciare in modo efficiente piastrine morfologicamente e funzionalmente simili a quelle native. Questo protocollo può servire come base per valutare i composti farmacologici che agiscono in varie fasi del processo per sezionare i meccanismi sottostanti e avvicinarsi alle rese piastriniche in vivo.
Introduction
Le piastrine del sangue provengono da grandi cellule poliploidi specializzate, i megacariociti (MK), che provengono da un processo di produzione costante e messo a punto noto come megacariopoiesi (MKP). All'apice di questo processo ci sono le cellule staminali ematopoietiche che, a contatto con l'ambiente del midollo osseo (citochine, fattori di trascrizione, nicchia ematopoietica), saranno in grado di proliferare e differenziarsi in progenitori ematopoietici (HP) in grado di impegnarsi verso la via megacariocitica, dando origine a NK immaturi1. Sotto l'influenza di varie citochine, e in particolare della trombopoietina (TPO), che è la principale citochina di MKP; l'MK subirà quindi due principali fasi di maturazione: l'endomitosi e lo sviluppo delle membrane di demarcazione (DMS). Questo MK completamente maturo appare quindi vicino a un vaso sinusoide in cui può emettere estensioni citoplasmatiche, le proplatelet, che verranno rilasciate sotto il flusso sanguigno e successivamente rimodellate in piastrine funzionali2. La clonazione di TPO nel 19943 ha fornito una spinta nello studio di MKP accelerando lo sviluppo di tecniche di coltura in vitro che consentono la differenziazione HP e la maturazione MK.
Ci sono molte patologie che colpiscono le piastrine del sangue, sia in termini di numero di piastrine (aumento o diminuzione) che di funzione4,5. Essere in grado di ricapitolare MKP in vitro da HP umano potrebbe migliorare la comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari alla base di questo processo e, in definitiva, la gestione terapeutica dei pazienti.
Sono adatte varie fonti di HP umano: sangue cordonale, midollo osseo e sangue periferico6,7,8. La raccolta di HP dal sangue periferico solleva meno problemi logistici ed etici rispetto al loro recupero dal sangue del cordone ombelicale o dal midollo osseo. L'HP può essere recuperato dalla leucoaferesi o dal buffy coat, ma queste fonti sono costose e non sempre disponibili nei centri del sangue. Altri protocolli, meno costosi e più facili da eseguire, consentono il recupero diretto delle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) senza la necessità di un precedente isolamento guidato da CD344,8. Tuttavia, la purezza dei megacariociti non è soddisfacente con questo metodo e una selezione di cellule CD34 + da PBMC è raccomandata per una differenziazione ottimale in MK. Questo ci ha portato a implementare una purificazione HP da filtri a leucoriduzione (LRF), abitualmente utilizzati nelle banche del sangue per rimuovere i globuli bianchi ed evitare così reazioni immunologiche avverse9. Infatti, dal 1998, i concentrati piastrinici sono stati automaticamente leucodepliati in Francia. Alla fine di questo processo, gli LRF vengono scartati e tutte le cellule trattenute nell'LRF vengono distrutte. Le celle nei LRF sono, quindi, prontamente disponibili senza costi aggiuntivi. Gli LRF hanno un contenuto cellulare vicino a quello ottenuto dalla leucaferesi o in buffy coats, in particolare nella loro composizione di CD34+ HP che li rende una fonte notevolmente attraente10. LRF come fonte umana di HP ha già dimostrato di fornire alle cellule capacità funzionali intatte11. Questa fonte ha il vantaggio di essere abbondante e conveniente per la ricerca di laboratorio. In questo contesto, questo articolo descrive successivamente: i) l'estrazione e la selezione di CD34+ HP da LRF; ii) una coltura ottimizzata in due fasi, che ricapitola l'impegno di HP nella via megacariocitica e la maturazione di MK in grado di emettere proplatelet; iii) un metodo per rilasciare in modo efficiente piastrine da questi MK; e iv) una procedura per la fenotipizzazione di MK e piastrine coltivate.
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Protocol
I campioni umani di controllo sono stati ottenuti da donatori di sangue volontari che hanno dato il consenso informato scritto reclutato dal centro trasfusionale in cui è stata eseguita la ricerca (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Tutte le procedure sono state registrate e approvate dal Ministero francese dell'istruzione superiore e della ricerca e registrate con il numero AC_2015_2371.I donatori hanno dato la loro approvazione nel modulo di consenso CODHECO ac- 2008 - 562, affinché i campioni vengano utilizzati a fini di ricerca. Gli studi sull'uomo sono stati condotti secondo la dichiarazione di Helsinki.
1. Estrazione e selezione di celle CD34+ (HP) da LRF
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Preparazione del reagente (per un LRF)
- Preparare 25 mL di tampone di eluizione filtrato: 21,25 mL di Soluzione Salina Tamponata con Fosfato (PBS), 2,5 mL di Acido-Citrato-Destrosio (ACD) e 1,25 mL di Siero Bovino Fetale Decomplementato (FBS). Filtrare su 0,22 μm e posizionare a 37 °C.
- Preparare 500 mL di PBS con 2 mM di acido etilendiamminatetraacetico (EDTA).
- Smaltire 25 mL di gradiente di densità medio (DGM) (1.077 g/mL) in due tubi da 50 mL.
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Modalità di risciacquo LRF (Figura 1)
NOTA: questo passaggio richiede una saldatrice per tubi sterile, che consenta il collegamento sterile di tubi termoplastici.- Innanzitutto, collegare l'LRF a un sacchetto di trasferimento vuoto da 600 ml e l'LRF a un set di tubi (Figura 1A). Sotto l'armadio di biosicurezza, iniettare il volume totale del tampone di eluizione filtrato e preparato corrispondente al numero di LRF movimentati (xLRF x 25 mL) nel sacchetto vuoto. Quindi, utilizzando una siringa da 30 mL per aspirare delicatamente l'intero contenuto del sacchetto attraverso l'LRF, eseguire il backflush e trasferire le cellule in un nuovo tubo da 50 mL (Figura 1B).
- Alla sedimentazione dei globuli rossi, diluire la sospensione cellulare della metà con Destrone 2% e mescolare bene per aggregare i globuli rossi. Attendere 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
Figura 1: Modalità di risciacquo della LRF. (A) Schema rappresentativo di (i) il collegamento sterile del sacchetto di trasferimento al LRF e (ii) il set di tubi al LRF. (B) Schema rappresentativo del collegamento delle siringhe per la raccolta delle cellule. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Collezione PBMC
- Dopo la sedimentazione dei globuli rossi, rimuovere e trasferire il surnatante in un tubo da 50 ml e riempirlo con PBS-EDTA 2 mM. Sovrapporre delicatamente il surnatante sul DGM sopra preparato. Lasciate che il surnatante scorra delicatamente senza rompere il piano superficiale del gradiente di densità. Centrifuga a 400 x g a RT per 30 minuti in modalità brake off.
- Raccogliere lo strato PBMC con una pipetta di trasferimento usa e getta. Trasferire le cellule da ciascun tubo DGM in un nuovo tubo sterile da 50 ml. Riempire ogni tubo con PBS-EDTA 2 mM e lavare due volte in 50 mL di PBS-EDTA 2 mM a 200 x g per 10 minuti a RT in modalità brake on.
- Pipettare e mettere in comune il pellet della cella con 50 mL PBS-EDTA 2 mM.
NOTA: C'è la possibilità di interrompere la procedura mantenendo le cellule raccolte sotto agitazione a 4 °C durante la notte. Quindi, filtrare la sospensione con un filtro cellulare da 40 μm per rimuovere gli aggregati formati.
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Selezione delle celle CD34+
- Determinare il numero di cellule e centrifugare a 400 x g a temperatura ambiente per 10 minuti con la rottura attivata.
- Aspirare completamente il surnatante e riaspensionare nel volume appropriato di PBS-EDTA 2 mM dettagliato dal produttore del kit di selezione CD34 (300 μL di PBS-EDTA per 108 celle). Aggiungere il reagente bloccante FcR e le microsfere CD34 nella concentrazione appropriata (50 μL per 108 cellule).
- Dopo 30 minuti a 4 °C, lavare la sospensione cellulare e risospenare nel volume appropriato di PBS-EDTA 2 mM dettagliato dal produttore del kit di selezione CD34 (500 μL per 108 celle).
NOTA: La selezione viene effettuata su colonne di ordinamento per il passaggio di massimo 2 x 109 celle per colonna. - Passare il campione sulla colonna bagnata del magnete. Lavare due volte con 3 mL di PBS-EDTA 2 mM ed eluire le cellule con 5 mL di PBS-EDTA 2 mM. Una seconda esecuzione su una nuova colonna seguendo la stessa procedura è necessaria per migliorare la purezza del campione.
NOTA: un numero previsto di 6,1 x 105 celle/LRF (Figura 2A). Per numeri LRF più elevati, aumentare di conseguenza i reagenti e i metodi.
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Valutazione della purezza cellulare CD34+
- Aggiungere ad un'aliquota di 100 μL di sospensione ottenuta dopo la selezioneCD34+, 2 μL di anticorpo umano CD34-PE o 2 μL di IgG - PE (controllo). Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 °C.
- Lavare le celle aggiungendo 2 ml di PBS e centrifugare a 400 x g per 5 min. Aspirare completamente il surnatante e spese in 200 μL di PBS.
- Analizzare la purezza mediante citometria a flusso come mostrato nella Figura 2A e nella Discussione.
NOTA: si prevede una purezza delle celle CD34+ superiore al 90% (Figura 2Bii). - Utilizzare le celle CD34+ direttamente o congelare per un ulteriore utilizzo.
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Congelamento delle cellule CD34+
NOTA: il congelamento delle cellule CD34+ viene eseguito a una densità di10 6 celle per ml.- Dopo la determinazione del numero di cellule CD34+, preparare i seguenti mezzi di crioconservazione: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) e consentire il raffreddamento a 4 °C.
- Centrifugare le celle CD34+ a 400 x g a temperatura ambiente per 5 min e risusciere il pellet in soluzione fredda 1 e poi aggiungere immediatamente alla soluzione fredda 2 (v/v).
- Posizionare immediatamente i criotubi in un congelatore a -80 °C per 24 ore e quindi trasferire i criotubi nel serbatoio dell'azoto liquido.
2. Coltura e differenziamento di cellule CD34+ per produrre megacariociti maturi portatori di proplatelet
NOTA: Protocollo di coltura cellulare (Figura 3A), schema rappresentativo della procedura di coltura cellulare sono dettagliati in questa sezione.
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Scongelamento delle celle CD34+ (se necessario)
- Preparare la soluzione di scongelamento: 13 ml di PBS-20% FBS e posizionare a 37 °C per 15 min. Trasferire rapidamente i criotubi a bagnomaria a 37 °C fino a un solo piccolo cristallo di ghiaccio. Sotto l'armadio della coltura biologica, pipettare l'intero contenuto e trasferire lentamente in 13 ml di soluzione di scongelamento prebellica.
- Determinare il numero di cellule e la vitalità delle cellule.
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Protocollo di coltura, fase 1: dal giorno 0 al giorno 7
NOTA: Di solito le colture sono fatte in piastre a 24 pozzetti con 1 mL di mezzo per pozzetti ad una densità di 40.000 cellule vitali / mL, corrispondenti a 20.000 cellule vitali / cm2. È fondamentale rispettare questa densità se è previsto uno scale-up.- Preparazione del mezzo di crescita : Nei mezzi di espansione delle cellule ematopoietiche privi di siero (precedentemente riscaldati a 37 °C) aggiungere Penicillina-Streptomicina-Glutammina (PSG) 1x, Lipoproteina umana a bassa densità (hLDL) a 20 μg/mL, cocktail di citochine di espansione dei megacariociti 1x e Stemregenina 1 (SR1) a 1 μM.
- Semina cellulare : Centrifugare le cellule CD34+ scongelate a 400 x g a temperatura ambiente per 5 min. Rimuovere accuratamente il surnatante e risusegare il pellet cellulare in 1 mL di substrato di coltura ed eseguire una numerazione cellulare e la vitalità per determinare il volume appropriato per seminare le cellule.
- Centrifugare le celle 400 x g a temperatura ambiente per 5 minuti e risusciere il pellet nel volume appropriato del terreno di crescita caldo. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 per 7 giorni.
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Protocollo di coltura, fase 2: dal giorno 7 al giorno 13(Figura 3B,immagini rappresentative al giorno 13)
NOTA: Di solito le colture sono fatte in piastre a 24 pozzetti con 1 mL di mezzo per pozzetti ad una densità di 50.000 cellule vitali / mL, corrispondenti a 25.000 cellule vitali / cm². È fondamentale rispettare questa densità se è previsto uno scale-up.- Preparazione del mezzo di maturazione: nei mezzi di espansione delle cellule ematopoietiche privi di siero (precedentemente riscaldati a 37 °C) aggiungere PSG 1x, hLDL a 20 μg/mL, TPO a 50 ng/mL e SR1 a 1 μM.
- Esaminare le cellule al microscopio. Al giorno 7, le cellule mostrano un aspetto rotondo e omogeneo riempiendo i pozzezze o i palloni senza essere troppo confluenti.
- Sotto un armadio di biosicurezza, trasferire delicatamente le cellule in un tubo da 15 ml. Lavare i pozzi con PBS. Quindi, determinare il numero di cellule e la loro vitalità per calcolare il volume appropriato per seminare le cellule.
- Centrifugare le celle a 400 x g a temperatura ambiente per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospentare le cellule nel volume appropriato di mezzo caldo calcolato nel passaggio precedente. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 6 giorni.
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Rilascio piastrinico coltivato al giorno 13
- Aggiungere 0,5 μM di prostaglandina I2 (IGP2) e 0,02 U/mL di apirasi alla coltura ed eseguire il pipettaggio successivo cinque volte con una pipetta da 1 mL.
NOTA: le piastrine vengono ora rilasciate nel mezzo.
- Aggiungere 0,5 μM di prostaglandina I2 (IGP2) e 0,02 U/mL di apirasi alla coltura ed eseguire il pipettaggio successivo cinque volte con una pipetta da 1 mL.
3. Analisi della citometria a flusso (fenotipizzazione MK e conta piastrinica in coltura)
NOTA: Questo protocollo può essere applicato alla fenotipizzazione delle cellule nei giorni di coltura selezionati. Permette inoltre la determinazione del numero del rilascio piastrinico coltivato (Figura 4A,B).
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Preparazione per l'analisi MK
- Etichettare quattro set di tubi microcentrifuga come segue: Celle non etichettate come controllo, celle + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Celle + 5 μL CD34 - PECy7, Celle + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Utilizzare un minimo di 1,105 celle per tubo, non superare 1,106 celle per tubo. Aggiungere a 100 μL di sospensione cellulare per tubo citometrico e i diversi anticorpi. Incubare al buio per 30 minuti a 4 °C.
- Quindi, aggiungere 2 ml di PBS-EDTA 2 mM per tubo e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Durante la centrifugazione, preparare una soluzione di PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomicina-D (7AAD) (1/100), consentire una soluzione di 300 μL per tubo.
- Rimuovere il surnatante e prendere il pellet in 300 μL di PBS-EDTA 2 mM con 7AAD. Eseguire i campioni attraverso il citometro a flusso entro 30 minuti.
NOTA: La strategia di analisi per la citometria a flusso è mostrata nella Figura 3C e nella Discussione.
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Preparazione del tubo per l'analisi piastrinica in coltura
- Etichettare quattro set di tubi microcentrifuga come segue: Celle non etichettate come controllo, Celle + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Celle + 20 μL CD42a - PE, Celle + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Dopo cinque pipettaggio successivi in pozzo di coltura, trasferire 300 μL della sospensione in tubo per citometria contenente un numero calibrato di perle fluorescenti.
- Aggiungere anticorpi e incubare al buio a RT per 30 minuti.
- Eseguire i campioni attraverso il citometro a flusso entro 30 minuti e impostare l'acquisizione per il passaggio di 5.000 perle.
NOTA: La strategia di analisi per la citometria a flusso è mostrata nella Figura 4B e nella Discussione.
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Representative Results
Estrazione e selezione di celle CD34+ da LRF
Qui, il metodo, derivato da Peytour et al.9, descrive l'estrazione e la selezione di cellule CD34+ da LRF scartati disponibili nelle banche del sangue dopo la rimozione dei leucociti. Seguendo la procedura di backflush, di solito 1,03 x10 9 ± 2,45 x 108 celle / LRF (Mean±SEM; n = 155) vengono recuperati con una vitalità del 94,88 ± 0,10% (Figura 2A i). Dopo la selezione CD34 positiva, si ottiene una media di 615,54 x10 3 ± 12,28 cellule/LRF (n = 155) (Figura 2A ii). Se il numero di celle è inferiore a 300.000, si deve concludere che la procedura non è stata eseguita correttamente e deve essere interrotta. Per valutare il successo della selezione CD34, la purezza delle cellule CD34+ viene valutata mediante citometria a flusso (Figura 2B). Di routine, si prevede una purezza superiore al 90% (91,88 ± 0,79%) (Figura 2B). Una purezza inferiore al 75% potrebbe significare che c'è stato un problema nella conduzione del protocollo e in particolare nell'eluizione delle colonne. Al di sotto di una purezza del 75% le cellule non vengono conservate per esperimenti di coltura.
Figura 2: Analisi del numero dicellule CD34+/LRF e della purezza cd34. (A) (i) Viene eseguita un'analisi, per contatore cellulare, del numero di cellule e della loro vitalità ottenuta seguendo la procedura comprendente sia la raccolta PBMC che la selezione CD34 ((1.03.109 ±2.45.10 8 cellule/LRF (mean ± SEM; n=155) con una vitalità di 94,88 ± 0,10% (n = 155)). (ii) Un'analisi, per contatore di cellule, viene eseguita anche dopo la selezione CD34 (615,54 x10 3 ± 12,28 celle/LRF (n = 155)). (B) La purezza del CD34 viene analizzata mediante citometria a flusso. (i) Le cellule sono state colorate con un anticorpo CD34-PE e identificate in base ai loro parametri FSC/SSC. (ii) Sulla base del segnale di dispersione e dell'analisi dell'espressione CD34, viene determinata la purezza. È stato utilizzato un pre-gate di positività CD34 basato sul controllo negativo per il marcatore CD34. (iii) Come si può vedere sul grafico a barre, si prevede una purezza di celle CD34+ superiore al 90% (91,88 ± 0,79% (n = 17)). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Differenziazione e maturazione dei proplatatori mk
La procedura di coltura cellulare descritta è divisa in due fasi. Il primo, dal giorno (D) 0 al D7, è dedicato alla proliferazione e all'impegno degli HP nella via megacariocitica in risposta a una combinazione di citochine e all'aggiunta di un composto chimico SR1. Il secondo, da D7 a D13, è focalizzato sulla maturazione MK e sull'estensione del proplatelet a seguito dell'aggiunta di TPO e SR1(Figura 3A). Come controllo di qualità della coltura, il conteggio cellulare, la determinazione della vitalità cellulare e la fenotipizzazione delle cellule, sono perfomed a D7 e D10. Queste fasi sono state scelte perché cruciali per l'impegno di HP, rispettivamente D7 e MK maturazione, D10 (dati personali). A D7 e 10, la proliferazione è abitualmente di x4,16 ± 0,25 (n = 34) e x2,30 ± 0,16 (n = 5), rispettivamente, con una vitalità cellulare compresa tra 86,38 ± 0,73% (n = 34); e 84,80 ± 2,67% (n = 5) (Figura 3B). Per quanto riguarda la fenotipizzazione cellulare, come mostrato in Figura 3C,a D0, oltre il 90% delle cellule è positivo per CD34. Quindi, le cellule CD34 + si impegnano verso il lignaggio megacariocitico, come testimoniato dall'apparizione di CD41, un marcatore specifico e precoce di MKP. Infatti, a D7, il 50,20 ± il 2,90% delle cellule sono positive sia per CD34 che per CD41 (Figura 3Bii). Quindi, MK migliora la loro maturazione. A D10, la maggior parte degli MK sono maturi, con meno del 15,60 ± il 4,70% delle cellule sono negative per CD41, il 47,90 ± l'8,90% è CD34+CD41+ e il 36,40 ± il 12,40% è CD34-CD41+ (Figura 3Biii).
Figura 3: Differenziazione e maturazione dei proplatelet mk.. (A) Schema rappresentativo della procedura di coltura cellulare. Viene utilizzato un metodo in due fasi: una fase di proliferazione da D0 a D7 (SR1 e cocktail di citochine) e una fase di maturazione da D7 a D13 (SR1 e TPO). A D13, le piastrine coltivate possono essere rilasciate dopo cinque pipettaggio successivi. (B) (i) Tasso di proliferazione a D7 (x4,16 ± 0,25 (n = 34)) e vitalità cellulare (86,38 ± 0,73% (n = 34)). (ii) Tasso di proliferazione a D10 (x2,30 ± 0,16 (n = 5)) e vitalità cellulare (84,80 ± 2,67% (n = 5)). (C) Analisi della citometria a flusso stategia dell'evoluzione fenotipica della MK in coltura. A D0, 95,80 ± lo 0,80% delle cellule sono CD34 positive (n = 3). A D7, il 50,20 ± il 2,90% delle cellule sono positive per CD34 e CD41. A D10, meno di 15,60 ± il 4,70% delle cellule sono negative per CD41. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Rilascio di piastrine coltivate, giorno 13
L'esame dei pozzi a D13 mostra MK rotondo e MK con protelet (Figura 4A). Una media del 35% di MK coltivato estende proplatelet12. Da notare, D13 rappresenta il giorno ottimale per l'estensione del proplatelet e il rilascio piastrinico. Se il livello richiesto di MK in grado di emettere proplatelet non viene raggiunto, qualcosa deve essere andato storto lungo il processo di coltura e i risultati non dovrebbero essere presi in considerazione.
Sebbene i meccanismi esatti che promuovono il rilascio piastrinico dalla MK matura siano ancora poco conosciuti, è ben noto che le forze emodinamiche sono indispensabili. Per imitare queste forze in vitro,la sospensione contenente MK propulsore viene aspirata e respinta cinque volte con un cono P1000 e quindi analizzata mediante citometria a flusso. A tale scopo vengono utilizzati tubi contenenti un numero calibrato di pere fluorescenti. In primo luogo, le perle presenti nel tubo sono recintate sulla finestra CD41-Alexa-fluor 488/PErcP-Cy5(Figura 4Bi,in rosso). Quindi, le piastrine coltivate vengono visualizzate in un pre-gate (elementi simili a piastrine), determinato sui parametri di dispersione in avanti (FSC) e di dispersione laterale (SSC) delle piastrine native (Figura 4Bii). Il numero di piastrine viene quindi determinato sulla loro positività CD41/CD42a (Figura 4Biii). Il conteggio delle celle viene interrotto in questo protocollo a 5.000 perle, ma è possibile utilizzare un altro numero fisso a seconda della raccomandazione del fornitore. Dai dati acquisiti, il numero di piastrine contate per 5.000 perle è di routine ad una media di 24,01 ± 92 (n = 15) (Figura 4C). Conoscendo il volume aspirato dal citometro a flusso per contare 5.000 perle (da calcolare per ogni citometro) e il volume totale di coltura, è possibile ottenere un'approssimazione del numero totale di piastrine in coltura rilasciate.
Figura 4: Rilascio di piastrine coltivate al giorno 13. (A) Immagine rappresentativa al microscopio ottico di proplatelet che emettono MK a D13. (B) Strategia per quantificare il rilascio piastrinico in coltura. (i) Le perle sono recintate sulla finestra CD41-Alexa-fluor 488/PErcP-Cy5 (in rosso). ( ii ) Gli elementi simili alle piastrine sonovisualizzatiin un gate determinato sui parametri FSC/SSC delle piastrine native (punti grigi). (iii) Le piastrine coltivate sono determinate sulla loro positività CD41/CD42 (viola). (C) Numero di piastrine contate per 5.000 perle può essere ottenuto, di routine una media di 24.011 ± 919 (n = 15). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La procedura a colpo d'occhio
Per riassumere meglio il metodo e comprendere ogni passaggio, un poster che riassume il protocollo passo dopo passo è presentato nella Figura 5. Questo foglio di riepilogo può essere visualizzato nella sala cultura e fungere da promemoria. Da notare, il successo degli esperimenti è garantito solo con i riferimenti di prodotto indicati nella tabella fornita.
Figura 5: Isolamento di CD34+. Poster che riassume il protocollo passo dopo passo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per la produzione di MK in grado di emettere proplatelet da HP derivati dal sangue e di rilasciare piastrine dal terreno di coltura. Gli HP sono ottenuti da LRF, un sottoprodotto delle banche del sangue, utilizzato per rimuovere i leucociti contaminanti dagli emoderivati cellulari ed evitare reazioni avverse. Sebbene questo metodo sia relativamente semplice, alcuni punti meritano un'attenzione speciale.
La deposizione della sospensione cellulare sul mezzo del gradiente di densità (fase 1.3.1) deve essere eseguita delicatamente per evitare la miscela (contenuto di rosso). Se questo passaggio non viene eseguito con attenzione, il protocollo dovrebbe fermarsi a questo punto. Allo stesso modo, anche nel punto 1.3.1, il freno deve essere in modalità off per evitare di mescolare le frazioni. In caso contrario, la selezione HP deve essere sospesa. Come indicato nel protocollo, paragrafo 1.4, la procedura può essere interrotta in seguito alla raccolta di PBMC. In questo caso, le cellule possono essere mantenute sotto agitazione durante la notte a 4 °C. Quindi, utilizzare un filtro cellulare da 40 μm per rimuovere gli aggregati formati, che possono avere un impatto sulla successiva selezione CD34. Da notare, l'interruzione della procedura non influisce sulla resa e sulla purezza dellecellule CD34 +. Alla fine della selezione CD34, la purezza deve essere superiore al 75% per seminare le cellule poiché, in uno studio precedente, la differenziazione e la maturazione di MK erano scarse al di sotto di questa purezza12 (Figura 2).
Particolare attenzione deve essere prestata allo scongelamento delle cellule CD34+, che deve essere effettuato rapidamente per evitare di compromettere la vitalità delle cellule. Inoltre, le fasi di lavaggio devono essere eseguite con attenzione per non lasciare traccia di siero. La densità di semina cellulare deve essere rispettata in quanto è stata rigorosamente scelta per l'impegno ottimale di CD34 per la via MKP e la maturazione MK (Figura 3A).
Si propone un protocollo di fenotipizzazione cellulare per seguire la differenziazione e la maturazione della MK. Questo protocollo è relativamente semplice, ma è importante avere tutti i tubi di controllo, sia non etichettati che singoli, disponibili per ogni giorno di analisi per garantire impostazioni affidabili sul citometro. Per garantire che la cultura funzioni senza intoppi, è importante raccogliere informazioni sulla proliferazione lungo la procedura. A D7, la proliferazione media è compresa tra 2 e 4 volte13. Questa proliferazione varia poco tra gli esperimenti, poiché ogni LRF comprende cellule di 8 donatori. Per appianare ulteriormente le variazioni, è possibile combinare celle ottenute in parallelo da 4 a 8 LRF.
È possibile osservare la morfologia delle cellule al microscopio ottico ma le cellule non devono essere osservate tutti i giorni perché sono sensibili alle variazioni di temperatura. Quando si rimuovono le cellule dall'incubatrice, assicurarsi di effettuare movimenti lenti per evitare di rompere i proplatelet.
Per quanto riguarda il rilascio piastrinico, sono necessari cinque volte il pipettaggio successivo. Fare meno non garantisce un rilascio piastrinico ottimale e fare di più è dannoso per la loro funzionalità12. L'aspetto più importante in questo passaggio è quello di utilizzare movimenti precisi e regolari, per generare un flusso regolare richiesto per il rilascio piastrinico14,15,16. Il metodo di cinque pipettaggio successivi è, quindi, semplice e facile da eseguire con risultati prestazionali soddisfacenti basati sulle rese descritte in letteratura. Il numero di piastrine rilasciate può essere determinato come indicato nel paragrafo 3.3 utilizzando la strategia di analisi della citometria a flusso mostrata nella Figura 4B. La qualità delle piastrine rilasciate è stata ben documentata in Do Sacramento et al. in termini di ultrastruttura (morfologia, dimensioni, contenuto di granuli) e funzione (emostasi), dimostrando che queste piastrine coltivate sono molto simili a quelle native13.
Il protocollo qui descritto è particolarmente adatto per colture di piccoli volumi, ma non è applicabile alla cultura su larga scala. È quindi un metodo ottimale per lo studio della biogenesi piastrinica al fine di comprendere meglio i meccanismi molecolari e cellulari che governano la produzione piastrinica aggiungendo piccole molecole, agonisti o antagonisti, per esempio. Inoltre, e per esplorare ulteriormente i meccanismi che regolano l'impegno MK, la maturazione MK e la produzione piastrinica, è ora possibile manipolare geneticamente il CD34+ HP utilizzando un metodo di editing del genoma CRISPR-Cas9.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
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