Summary
Этот протокол подробно описывает все этапы, связанные с получением гемопоэтических прародителей CD34+ на основе лейкофильтра и их дифференцировкой in vitro и созреванием в проплателетоносные мегакариоциты, способные высвобождать тромбоциты в культуральная среда. Эта процедура полезна для углубленного анализа клеточных и молекулярных механизмов, контролирующих мегакариопоезис.
Abstract
Расширение in vitro и дифференциация кроветворных прародителей человека в мегакариоциты, способные удлинивать проplatelets и высвобождать тромбоциты, позволяет углубленно изучить механизмы, лежащие в основе биогенеза тромбоцитов. Доступные протоколы культивирования в основном основаны на кроветворных прародителях, полученных из костного мозга или пуповинной крови, что вызывает ряд этических, технических и экономических проблем. Если уже существуют доступные протоколы получения КЛЕТОК CD34 из периферической крови, эта рукопись предлагает простой и оптимизированный протокол для получения клеток CD34+ из фильтров лейкодесопощения, легко доступных в центрах крови. Эти клетки выделяют из лейкодеплеционных фильтров, используемых при приготовлении продуктов переливания крови, соответствующих восьми донорствам крови. Эти фильтры предназначены для удаления. Описана подробная процедура сбора гемопоэтических прародителей, идентифицированных как клетки CD34+, из этих фильтров. Также подробно описан способ получения зрелых мегакариоцитов, расширяющих проплацелеты при обсуждении их фенотипической эволюции. Наконец, протокол представляет собой калиброванный метод пипетирования для эффективного высвобождения тромбоцитов, которые морфологически и функционально похожи на нативные. Этот протокол может служить основой для оценки фармакологических соединений, действующих на различных этапах процесса, для препарирования основных механизмов и приближения к выходу тромбоцитов in vivo.
Introduction
Тромбоциты крови происходят из специализированных крупных полиплоидных клеток, мегакариоцитов (МК), которые происходят из постоянного и тонко настроенного производственного процесса, известного как мегакариопоезис (MKP). На вершине этого процесса находятся гемопоэтические стволовые клетки, которые при контакте с средой костного мозга (цитокины, факторы транскрипции, кроветворная ниша) смогут размножаться и дифференцироваться в кроветворные прародители (НР), способные фиксироваться в направлении мегакариоцитного пути, давая начало незрелым МК1. Под влиянием различных цитокинов, и в частности тромбопоэтина (ТПО), который является основным цитокином МКФ; Затем МК пройдет две основные стадии созревания: эндомитоз и развитие демаркационных мембран (ДМС). Этот полностью зрелый МК затем появляется близко к синусоидальному сосуду, в котором он может испускать цитоплазматические расширения, проplatelets, которые будут высвобождаться под кровотоком и впоследствии реконструироваться в функциональные тромбоциты2. Клонирование ТПО в 1994г.3 обеспечило импульс в изучении МКП за счет ускорения разработки методов культивирования in vitro, позволяющих дифференцировать НР и созревание МК.
Существует множество патологий, поражающих тромбоциты крови, как по количеству тромбоцитов (увеличение или уменьшение), так и по функции4,5. Возможность рекапитулировать MKP in vitro от человеческой HP может улучшить понимание молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе этого процесса и, в конечном счете, терапевтического ведения пациентов.
Подойдут различные источники НР человека: пуповинная кровь, костный мозг, периферическая кровь6,7,8. Сбор HP из периферической крови вызывает меньше логистических и этических проблем, чем их восстановление из пуповинной крови или костного мозга. ГП можно восстановить после лейкафереза или пышной шерсти, но эти источники дороги и не всегда доступны в центрах крови. Другие протоколы, менее дорогие и простые в выполнении, позволяют напрямую восстанавливать мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMCs) без необходимости предварительной изоляции CD344,8. Однако чистота мегакариоцитов не является удовлетворительной при этом методе, и для оптимальной дифференцировки в МК рекомендуется отбор клеток CD34+ из PBMC. Это привело нас к внедрению очистки HP от фильтров лейкоредукции (LRF), обычно используемых в банках крови для удаления белых кровяных клеток и, таким образом, предотвращения неблагоприятных иммунологических реакций9. Действительно, с 1998 года концентраты тромбоцитов автоматически лейкодеплируются во Франции. В конце этого процесса LRF выбрасываются, и все клетки, оставшиеся в LRF, разрушаются. Таким образом, ячейки в LRF легко доступны без каких-либо дополнительных затрат. LRF имеют клеточное содержание, близкое к тому, которое получено путем лейкафереза или в пушистых слоях, особенно в их составе CD34 + HP, что делает их удивительно привлекательным источником10. Уже было продемонстрировано, что LRF как человеческий источник HP обеспечивает клетки с неповрежденными функциональными способностями11. Этот источник имеет то преимущество, что он обильен и доступен для лабораторных исследований. В этом контексте в данной статье последовательно описываются: i) извлечение и выбор CD34+ HP из LRF; ii) двухфазная оптимизированная культура, которая рекапитулирует приверженность HP в мегакариоцитарный путь и созревание MK, способного испускать проплацелеты; iii) способ эффективного высвобождения тромбоцитов из этих МК; и iv) процедура фенотипирования МК и культивированных тромбоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Контрольные образцы человека были получены от доноров крови, которые дали письменное информированное согласие, полученное центром переливания крови, где проводилось исследование (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Все процедуры были зарегистрированы и одобрены Министерством высшего образования и исследований Франции и зарегистрированы под номером AC_2015_2371.Доноры дали свое одобрение в форме согласия CODHECO No AC- 2008 - 562, чтобы образцы использовались в исследовательских целях. Исследования на людях проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией.
1. Извлечение и отбор клеток CD34+ (HP) из LRF
-
Препарат реагента (для одного LRF)
- Приготовьте 25 мл фильтрованного буфера элюации: 21,25 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), 2,5 мл кислотно-цитрат-декстрозы (ACD) и 1,25 мл декомплементированной фетальной бытовой сыворотки (FBS). Фильтровать на 0,22 мкм и размещать при 37 °C.
- Приготовьте 500 мл PBS с 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
- Утилизируйте 25 мл среды градиента плотности (DGM) (1,077 г/мл) в двух пробирках по 50 мл.
-
Методы обратной промывки LRF (Рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа требуется стерильный аппарат для сварки труб, позволяющий стерильное соединение термопластичных трубок.- Во-первых, подключите LRF к пустому мешку для переноса 600 мл, а LRF к комплекту труб(рисунок 1A). Под шкаф биобезопасности вводят в пустой мешок общий объем отфильтрованного и подготовленного элюирующего буфера, соответствующего количеству обрабатываемых LRF (xLRF x 25 мл). Затем, используя шприц объемом 30 мл, мягко аспирировать все содержимое мешочка через LRF, продуть обратно и перенести клетки в новую трубку объемом 50 мл(рисунок 1B).
- Для осаждения эритроцитов разбавьте клеточную суспензию пополам декстраном на 2% и хорошо перемешайте для агрегирования эритроцитов. Подождите 30 мин при комнатной температуре (RT).
Рисунок 1:Условия обратной промывки LRF. (A)Репрезентативная схема(i)стерильного соединения передаточного мешка с LRF и(ii)трубки, установленной на LRF. (B) Репрезентативная схема подключения шприцев для клеточного сбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
-
Коллекция PBMC
- После осаждения эритроцитов удалите и перенесите супернатант в пробирку 50 мл и заполните ее PBS-EDTA 2 мМ. Аккуратно наложим супернатант на вышеприготовленный ДГМ. Пусть супернатант течет мягко, не нарушая поверхностную плоскость градиента плотности. Центрифуга при 400 х г при RT в течение 30 мин в режиме выключения тормоза.
- Соберите слой PBMC с помощью одноразовой трансферной пипетки. Перенесите клетки из каждой трубки DGM в новую стерильную трубку 50 мл. Заполните каждую трубку PBS-EDTA 2 мМ и дважды промыть в 50 мл PBS-EDTA 2 мМ при 200 х г в течение 10 мин при RT в режиме торможения.
- Пипетка отключите и объедините гранулу ячейки с 50 мл PBS-EDTA 2 мМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует возможность остановить процедуру, поддерживая собранные клетки при перемешивании при 4 °C в течение ночи. Затем отфильтруйте суспензию с помощью клеточного ситечкового фильтра 40 мкм, чтобы удалить образовавшемся заполнитель.
-
Выбор ячеек CD34+
- Определяют номер ячейки и центрифугу при 400 х г при комнатной температуре в течение 10 мин с включенной паузой.
- Аспирировать супернатант полностью и повторно суспендировать в соответствующем объеме PBS-EDTA 2 мМ, подробно описанном производителем селекционного комплекта CD34 (300 мкл PBS-EDTA на 108 ячеек). Добавьте блокирующий FcR реагент и микрограницы CD34 в соответствующей концентрации (50 мкл на 108 клеток).
- Через 30 мин при 4 °C промыть клеточную суспензию и повторно суспендировали в соответствующем объеме PBS-EDTA 2 мМ, подробно описанном производителем селекционного комплекта CD34 (500 мкл на 108 ячеек).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор производится на сортировке столбцов для прохождения максимум 2 x 109 ячеек на столбец. - Пропустите образец над мокрым столбом магнита. Дважды промыть 3 мл PBS-EDTA 2 мМ и элюлируем клетки 5 мл PBS-EDTA 2 мМ. Второй прогона на новой колонке после той же процедуры необходим для повышения чистоты образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемое число 6,1 х 105 ячеек/LRF(рисунок 2A). Для более высоких чисел LRF масштабируйте реагенты и методы соответственно.
-
Оценка чистоты клеток CD34+
- Добавьте к аликвоте 100 мкл суспензии, полученной послеcd34+ селекции, 2 мкл человеческого CD34-PE антитела или 2 мкл IgG-PE (контроль). Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 °C.
- Промывайте ячейки, добавляя 2 мл PBS и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин. Аспират супернатант полностью и повторно суспендируется в 200 мкл PBS.
- Проанализируйте чистоту с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 2А и в обсуждении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается чистота клеток CD34+ выше 90%(рисунок 2Bii). - Используйте клетки CD34+ напрямую или заморозьте для дальнейшего использования.
-
Замораживание клеток CD34+
ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание клеток CD34+ производится при плотности 106 клеток в мл.- После определения количества клеток CD34+ подготовьте следующие криоконсервационные среды: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) и позвольте охладить при 4 °C.
- Центрифугируют ячейки CD34+ при 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин и повторно суспендируют гранулу в холодном растворе 1, а затем сразу добавляют в холодный раствор 2 (v/v).
- Поместите криотрубки непосредственно в морозильную камеру при -80 °C в течение 24 ч, а затем переложите криотрубки в резервуар для жидкого азота.
2. Культивация и дифференцировка клеток CD34+ для получения зрелых проплателет-несущих мегакариоцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол клеточной культуры(рисунок 3A),репрезентативная схема процедуры клеточной культуры подробно описаны в этом разделе.
-
Оттаивание клеток CD34+ (при необходимости)
- Готовят раствор для размораживания: 13 мл PBS-20% FBS и помещают при 37 °C в течение 15 мин. Быстро перенесите криотрубы на водяную баню с 37 °C до одного маленького кристалла льда. Под биологический культурологический шкаф пипетку выкладываем все содержимое и медленно перекладываем в 13 мл предварительно выморохивающего оттаивающего раствора.
- Определите количество клеток и жизнеспособность клеток.
-
Протокол культивной культуры, шаг 1: с 0-го дня по 7-й день
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно культуры изготавливают в 24-скважинных пластинах с 1 мл среды на скважину при плотности 40 000 жизнеспособных клеток/мл, что соответствует 20 000 жизнеспособныхклеток/см2. Крайне важно соблюдать эту плотность, если планируется какое-либо расширение.- Препарат питательной среды: В свободные от сыворотки среды расширения гемопоэтических клеток (предварительно нагретые до 37 °C) добавляют пенициллин-стрептомицин-глутамин (PSG) 1x, липопротеин низкой плотности человека (hLDL) при 20 мкг/мл, цитокиновый коктейль расширения мегакариоцитов 1x и stemregenin 1 (SR1) при 1 мкм.
- Посев клеток: Центрифугирование размороженных клеток CD34+ при 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Тщательно удаляют супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл культурального носителя и выполняют нумерацию и жизнеспособность клеток для определения соответствующего объема для засева клеток.
- Центрифугируют ячейки 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин и повторно суспендируют гранулу в соответствующем объеме теплой питательной среды. Инкубируют клетки при 37 °C с 5% CO2 в течение 7 дней.
-
Протокол культивной культуры, шаг 2: с 7-го по 13-й день(рисунок 3В,репрезентативные изображения на 13-й день)
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно культуры изготавливают в 24-скважинных пластинах с 1 мл среды на скважину при плотности 50 000 жизнеспособных клеток/мл, что соответствует 25 000 жизнеспособных клеток/см². Крайне важно соблюдать эту плотность, если планируется какое-либо расширение.- Приготовление среды созревания: В свободной от сыворотки среде расширения гемопоэтических клеток (предварительно нагретой до 37 °C) добавляют PSG 1x, hLDL при 20 мкг/мл, TPO при 50 нг/мл и SR1 при 1 мкМ.
- Исследуйте клетки под микроскопом. На 7-й день клетки демонстрируют круглый и однородный вид, заполняя колодцы или колбы, не будучи слишком слишком слизыми.
- Под шкафом биобезопасности аккуратно перенесите клетки в пробирку 15 мл. Промывайте колодцы с PBS. Затем определите количество клеток и их жизнеспособность, чтобы рассчитать соответствующий объем для посева клеток.
- Центрифугировать ячейки при 400 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируете ячейки в соответствующем объеме теплой среды, рассчитанном на предыдущем этапе. Инкубируют клетки при 37 °C, 5% CO2 в течение 6 дней.
-
Высвобождение культивированных тромбоцитов на 13-й день
- Добавьте к культуре 0,5 мкМ простагландина I2 (PGI2) и 0,02 Ед/мл апиразы и выполните последовательную пипетку пять раз пипеткой 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тромбоциты теперь высвобождаются в среду.
- Добавьте к культуре 0,5 мкМ простагландина I2 (PGI2) и 0,02 Ед/мл апиразы и выполните последовательную пипетку пять раз пипеткой 1 мл.
3. Анализ проточной цитометрии (фенотипирование МК и количество культивированных тромбоцитов)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть применен к фенотипированием клеток в выбранные дни культивирования. Он также позволяет определить количество культивированного высвобождения тромбоцитов(рисунок 4A,B).
-
Подготовка к анализу МК
- Обозначьте четыре набора микроцентрифужных трубок следующим образом: Немаркированные клетки в качестве контрольных, клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488, Клетки + 5 мкл CD34 - PECy7, Клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 мкл CD34 - PECy7. Используйте минимум 1,105 клеток на трубку, не превышайте 1,106 клеток на трубку. Добавьте к 100 мкл клеточной суспензии на цитометрическую трубку и различные антитела. Инкубировать в темноте в течение 30 мин при 4 °C.
- Затем добавляют 2 мл PBS-EDTA 2 мМ на пробирку и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Во время центрифугирования готовят раствор PBS-EDTA 2 мМ + 7-Аминоактиномицин-D (7AAD) (1/100), дают по 300 мкл раствора на пробирку.
- Удалите супернатант и возьмите гранулу в 300 мкл PBS-EDTA 2 мМ с 7AAD. Прогоняйте образцы через проточный цитометр в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия анализа для проточной цитометрии показана на рисунке 3C и в обсуждении.
-
Подготовка пробирки для анализа тромбоцитов
- Обозначьте четыре набора микроцентрифужных трубок следующим образом: Немаркированные клетки в качестве контрольных, Клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488, Клетки + 20 мкл CD42a - ПЭ, Клетки + 5 мкл CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 мкл CD42a - ПЭ. После пяти последовательных пипеток в культуре скважины переложите 300 мкл суспензии в трубку для цитометрии, содержащую калиброванное количество флуоресцентных шариков.
- Добавьте антитела и инкубируют в темноте при RT в течение 30 мин.
- Прогоняйте образцы через проточный цитометр в течение 30 минут и установите комплектование на прохождение 5000 бусин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия анализа для проточной цитометрии показана на рисунке 4B и в обсуждении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Извлечение и отбор клеток CD34+ из LRF
Здесь способ, полученный из Peytour et al.9,описывает экстракцию и отбор CD34+ клеток из выброшенных LRF, доступных в банках крови после удаления лейкоцитов. После процедуры обратной проливки обычно восстанавливается 1,03x 10 9 ± 2,45 x10 8 клеток/LRF (Mean±SEM; n = 155) с жизнеспособностью 94,88 ± 0,10%(рисунок 2A i). После положительного отбора CD34 получается в среднем 615,54 х 103 ± 12,28 клеток/LRF (n = 155)(рисунок 2A ii). Если количество клеток меньше 300 000, необходимо сделать вывод, что процедура была проведена неправильно и должна быть остановлена. Чтобы оценить успех селекции CD34, чистоту клеток CD34+ оценивают с помощью проточной цитометрии(рисунок 2B). Обычно ожидается чистота выше 90% (91,88 ± 0,79%)(рисунок 2B). Чистота ниже 75% может означать, что возникла проблема в проведении протокола и, в частности, в элюированием колонок. Ниже чистоты 75% клетки не сохраняются для культурных экспериментов.
Рисунок 2:Анализ чистоты CD34+ cell number/LRF и CD34. (A)(i)Проводится анализ по счетчику клеток количества клеток и их жизнеспособности, полученных в результате процедуры, включая как сбор PBMC, так и отбор CD34 ((1.03.109 ± 2.45.108 клеток/LRF (Средняя ± SEM; n=155) с жизнеспособностью 94,88 ± 0,10% (n = 155)). ii)Анализ по счетчику клеток также проводится после отбора CD34 (615,54 x 103 ± 12,28 клеток/LRF (n = 155)). (B) Чистота CD34 анализируется с помощью проточной цитометрии. (i)Клетки окрашивали антителом CD34-PE и идентифицировали по их параметрам FSC/SSC. (ii)На основе анализа рассеянного сигнала и экспрессии CD34 определяется чистота. Был использован предварительный затвор позитивности CD34 на основе отрицательного контроля для маркера CD34. iii)Как видно на гистограмме, ожидается чистота клеток CD34+ выше 90% (91,88 ± 0,79% (n = 17)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дифференциация и созревание МК-подшипниковых пластин
Описанная процедура культивирует клетки делится на два этапа. Первый, от дня (D) 0 до D7, посвящен пролиферации HP и вовсению в мегакариоцитарный путь в ответ на комбинацию цитокинов и добавление химического соединения SR1. Второй, от D7 до D13, ориентирован на созревание MK и расширение проплатлетов после добавления TPO и SR1(рисунок 3A). В качестве контроля качества культуры подсчет клеток, определение жизнеспособности клеток и фенотипирование клеток выполняются при D7 и D10. Эти этапы были выбраны потому, что они имеют решающее значение для обязательств HP, созревания D7 и MK, D10 соответственно (персональные данные). При D7 и 10 пролиферация обычно составляет x4,16 ± 0,25 (n = 34) и x2,30 ± 0,16 (n = 5), соответственно, при этом жизнеспособность клеток составляет от 86,38 ± 0,73% (n = 34); и 84,80 ± 2,67% (n = 5)(рисунок 3B). Что касается фенотипирования клеток, как показано на рисунке 3C,при D0 более 90% клеток являются положительными для CD34. Затем клетки CD34+ становятся приверженными мегакариоцитарной линии, о чем свидетельствует явление CD41, специфического и раннего маркера MKP. Действительно, при D7 50,20 ± 2,90% клеток положительны как для CD34, так и для CD41(рисунок 3Bii). Затем МК улучшает их созревание. При D10 большинство МК являются зрелыми, причем менее 15,60 ± 4,70% клеток отрицательны для CD41, 47,90 ± 8,90% - CD34+CD41+ и 36,40 ± 12,40% - CD34-CD41+ (рисунок 3Biii).
Рисунок 3:Дифференциация и созревание МК-подшипниковых пластин. (A) Репрезентативная схема процедуры культивирования клеток. Используется двухэтапный метод: этап пролиферации от D0 до D7 (SR1 и коктейль цитокинов) и этап созревания от D7 до D13 (SR1 и TPO). При D13 культивирование тромбоцитов может высвобождаться после пяти последовательных пипеток. (B)(i)Скорость пролиферации при D7 (x4,16 ± 0,25 (n = 34)) и жизнеспособность клеток (86,38 ± 0,73% (n = 34)). ii)скорость пролиферации при D10 (x2,30 ± 0,16 (n = 5)) и жизнеспособность клеток (84,80 ± 2,67% (n = 5)). (C) Анализ состояния анализа проточной цитометрии фенотипической эволюции МК в культуре. При D0 95,80 ± 0,80% клеток являются CD34 положительными (n = 3). При D7 50,20 ± 2,90% клеток положительны на CD34 и CD41. При D10 менее 15,60 ± 4,70% клеток отрицательны для CD41. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Высвобождение культивированных тромбоцитов, день 13
Обследование скважин на Д13 показывает круглый МК и проплатоносный МК(рисунок 4А). В среднем 35% культивированных МК распространяют проплателеты12. Следует отметить, что D13 представляет собой оптимальный день для расширения проплатлетов и высвобождения тромбоцитов. Если требуемый уровень МК, способный излучать проплацеты, не достигнут, то, должно быть, что-то пошло не так в процессе культивирования и результаты не должны учитываться.
Хотя точные механизмы, способствующие высвобождению тромбоцитов из зрелого МК, все еще плохо изучены, хорошо известно, что гемодинамические силы незаменимы. Чтобы имитировать эти силы in vitro,суспензию, содержащую прослекольсодержащую МК, аспирируют и отталкивают пять раз конусом P1000, а затем анализируют с помощью проточной цитометрии. Для этого используются трубки, содержащие калиброванное количество флуоресцентных шариков. Во-первых, шарики, присутствующие в трубке, закрыты на окне CD41-Alexa-fluor 488/PErcP-Cy5(рисунок 4Bi,красным цветом). Затем культивируемые тромбоциты визуализируются в предвратнике (тромбоцитоподобные элементы), определяемые по параметрам прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) нативных тромбоцитов(рисунок 4Bii). Затем количество тромбоцитов определяется по их положительности CD41/CD42a(рисунок 4Biii). Подсчет клеток останавливается в этом протоколе на 5000 бусин, но в зависимости от рекомендации поставщика может использоваться другое фиксированное число. Из полученных данных количество тромбоцитов, подсчитанных на 5000 бусин, обычно составляет в среднем 24,01 ± 92 (n = 15)(рисунок 4C). Зная объем аспирируемого проточным цитометром на счет 5000 шариков (рассчитывается для каждого цитометра) и общий объем культуры, можно получить приближение к общему количеству выделяемых культивируемых тромбоцитов.
Рисунок 4:Высвобождение культивированных тромбоцитов на 13 день. (А) Репрезентативная световая микроскопия изображения МК, излучающих проplatelets на D13. (B)Стратегия количественной оценки высвобождения культивируемых тромбоцитов. (i)Бусины закрыты на окне CD41-Alexa-fluor 488/PErcP-Cy5 (красным цветом). (ii)Тромбоцитоподобные элементы визуализируются в затворе, определяемом по параметрам FSC/SSC нативных тромбоцитов (серые точки). (iii)Культивируются тромбоциты по их положительной CD41/CD42 (фиолетовой). (C)Количество тромбоцитов, подсчитанных на 5000 бусин, может быть получено, обычно в среднем 24 011 ± 919 (n = 15). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Краткий обзор процедуры
Чтобы лучше обобщить метод и понять каждый шаг, плакат, обобщающий протокол шаг за шагом, представлен на рисунке 5. Этот сводный лист может отображаться в культурной комнате и служить памяткой. Следует отметить, что успех экспериментов гарантируется только ссылками на продукты, указанными в предоставленной таблице.
Рисунок 5:Изоляция CD34+. Плакат, обобщающий протокол шаг за шагом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает способ получения МК, способного испускать проплацелеты из ГП, полученных из крови, и высвобождать тромбоциты из культурального носителя. HP получают из LRF, побочного продукта банков крови, используемого для удаления загрязняющих лейкоцитов из клеточных продуктов крови и предотвращения побочных реакций. Хотя этот метод относительно прост, несколько моментов заслуживают особого внимания.
Осаждение клеточной суспензии на среду градиента плотности (этап 1.3.1) должно выполняться осторожно, чтобы избежать смеси (содержание красного цвета). Если этот шаг не выполняется осторожно, протокол должен прекратиться на этом этапе. Аналогичным образом, и на этапе 1.3.1 тормоз должен быть включен в режим выключения, с тем чтобы избежать смешивания фракций. В этом случае выбор HP должен быть приостановлен. Как указано в протоколе, раздел 1.4, процедура может быть прервана после сбора PBMC. В этом случае клетки могут поддерживаться при перемешивании в течение ночи при 4 °C. Затем используйте клеточный сетчатый фильтр 40 мкм для удаления образовавшиеся агрегаты, которые могут повлиять на последующий отбор CD34. Следует отметить, что прерывание процедуры не влияет на выход и чистоту клетокCD34+. В конце отбора CD34 чистота должна быть больше 75% для посева клеток, поскольку в предыдущем исследовании дифференцировка и созревание MK были плохими ниже этой чистоты12 (рисунок 2).
Особое внимание необходимо уделить оттаиванию клетокCD34+, которое необходимо проводить быстро, чтобы избежать влияния на жизнеспособность клеток. Кроме того, промывные этапы необходимо проводить осторожно, чтобы не оставить следов сыворотки. Плотность посева клеток должна соблюдаться, поскольку она была тщательно выбрана для оптимальной приверженности CD34 пути MKP и созреванию MK(рисунок 3A).
Предложен протокол фенотипирования клеток для отслеживания дифференцировки и созревания МК. Этот протокол является относительно базовым, но важно иметь все контрольные трубки, как немаркированные, так и одиночные маркировочные трубки, доступные для каждого дня анализа, чтобы обеспечить надежные настройки на цитометре. Для обеспечения бесперебойной работы культуры важно собирать информацию о распространении в ходе процедуры. При D7 средняя пролиферация составляет от 2 до 4 раз13. Эта пролиферация мало варьируется между экспериментами, так как каждый LRF состоит из клеток от 8 доноров. Для дальнейшего сглаживания вариаций можно комбинировать полученные параллельно ячейки от 4 до 8 LRF.
Можно посмотреть на морфологию клеток с помощью световой микроскопии, но клетки не следует наблюдать каждый день, потому что они чувствительны к колебаниям температуры. При извлечении клеток из инкубатора следите за медленными движениями, чтобы избежать разрушения проплац.
Что касается высвобождения тромбоцитов, то требуется пятикратная последовательная пипетка. Меньшее количество не обеспечивает оптимального высвобождения тромбоцитов, а делать больше вредно для их функциональности12. Наиболее важным аспектом на этом этапе является использование точных и регулярных движений, чтобы генерировать регулярный поток, необходимый для высвобождения тромбоцитов14,15,16. Таким образом, метод пяти последовательных пипеток прост и легок в исполнении с удовлетворительными результатами производительности, основанными на урожайности, описанной в литературе. Количество высвобождаемых тромбоцитов можно определить, как указано в разделе 3.3, используя стратегию анализа проточной цитометрии, показанную на рисунке 4B. Качество высвобождаемых тромбоцитов было хорошо задокументировано в Do Sacramento et al. с точки зрения ультраструктуры (морфология, размер, содержание гранул) и функции (гемостаз), демонстрируя, что эти культивируемые тромбоциты очень похожи на нативные13.
Протокол, описанный здесь, особенно подходит для культур малого объема, но не применим к крупномасштабным культурам. Поэтому это оптимальный метод для изучения биогенеза тромбоцитов, чтобы лучше понять молекулярные и клеточные механизмы, управляющие производством тромбоцитов путем добавления небольших молекул, агонистов или антагонистов, например. Кроме того, для дальнейшего изучения механизмов, которые регулируют приверженность МК, созревание МК и производство тромбоцитов, теперь можно генетически манипулировать CD34+ HP с помощью метода редактирования генома CRISPR-Cas9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом ANR (Agence National de la Recherche) ANR- 17-CE14-0001-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- de Sauvage, F. J., et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand. Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).
- Almomani, M. H., Mangla, A. StatPearls. , (2020).
- Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).
- Delalat, B., et al. Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells. Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).
- Yin, T., Li, L. The stem cell niches in bone. The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).
- Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells. Bio-protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy. Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).
- Lapostolle, V., et al. Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction. Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).
- Ivanovic, Z., et al. Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy. Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).
- Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
- Do Sacramento, V., et al. Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells. Scientific Reports. 10 (1), 914 (2020).
- Blin, A., et al. Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics. Scientific Reports. 6, 21700 (2016).
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).
