Hartsassisterad fångst i kombination med isobar tandemmassetikettmärkning för multiplexerad kvantifiering av proteintioloxidation

Summary

Proteintioloxidation har betydande konsekvenser under normala fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Vi beskriver detaljerna i en kvantitativ redoxproteomikmetod, som använder hartsassisterad infångning, isobarisk märkning och masspektrometri, vilket möjliggör platsspecifik identifiering och kvantifiering av reversibelt oxiderade cysteinrester av proteiner.

Abstract

Reversibla oxidativa modifieringar på proteintioler har nyligen framträtt som viktiga mediatorer av cellulär funktion. Häri beskriver vi det detaljerade förfarandet för en kvantitativ redoxproteomikmetod som använder hartsassisterad infångning (RAC) i kombination med tandemmasstagg (TMT) isobarisk märkning och vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) för att möjliggöra multiplexerad stochiometrisk kvantifiering av oxiderade proteintioler på proteomnivå. Den platsspecifika kvantitativa informationen om oxiderade cysteinrester ger ytterligare inblick i de funktionella effekterna av sådana modifieringar.

Arbetsflödet är anpassningsbart över många provtyper, inklusive odlade celler (t.ex. däggdjur, prokaryota) och hela vävnader (t.ex. hjärta, lunga, muskler), som initialt lyseras / homogeniseras och med fria tioler som alkyleras för att förhindra artificiell oxidation. De oxiderade proteintiolerna reduceras sedan och fångas upp av ett tiolaffinitetsharts, vilket effektiviserar och förenklar arbetsflödesstegen genom att tillåta att de fortsatta matsmältnings-, märknings- och tvättprocedurerna utförs utan ytterligare överföring av proteiner / peptider. Slutligen elueras och analyseras de märkta peptiderna av LC-MS / MS för att avslöja omfattande stökiometriska förändringar relaterade till tioloxidation över hela proteomet. Denna metod förbättrar avsevärt förståelsen för rollen av redoxberoende reglering under fysiologiska och patofysiologiska tillstånd relaterade till proteintioloxidation.

Introduction

Under homeostatiska förhållanden genererar celler reaktiva syre-, kväve- eller svavelarter som hjälper till att underlätta processer, såsom metabolism och signalering ^1,2,3, som sträcker sig till både prokaryoter och eukaryoter. Fysiologiska nivåer av dessa reaktiva arter är nödvändiga för korrekt cellulär funktion, även känd som ‘^{eustress’1,4}. Däremot kan en ökning av oxidanter som leder till en obalans mellan oxidanter och antioxidanter orsaka oxidativ stress, eller “nöd”¹, vilket leder till cellskador. Oxidanter omvandlar signaler till biologiska vägar genom att modifiera olika biomolekyler, inklusive protein, DNA, RNA och lipider. I synnerhet är cysteinrester av proteiner mycket reaktiva platser benägna att oxidera på grund av tiolgruppen på cystein, som är reaktiv mot olika typer av oxidanter⁵. Detta ger upphov till ett varierat utbud av reversibla redoxbaserade posttranslationella modifieringar (PTM) för cystein, inklusive nitrosylering (SNO), glutationylering (SSG), sulfenylering (SOH), persulfidering (SSH), polysulfidering (SS_nH), acylering och disulfider. Irreversibla former av cysteinoxidation innefattar sulfinylering (_SO2H) och sulfonylering (_SO3H).

Reversibla oxidativa modifieringar av cysteinrester kan tjäna skyddande roller som förhindrar ytterligare irreversibel oxidation eller fungera som signalmolekyler för nedströms cellulära vägar ^6,7. Reversibiliteten hos vissa tiol redox PTM gör det möjligt för cysteinställen att fungera som “redoxomkopplare”^8,9, varvid förändringar i redoxtillståndet på dessa platser förändrar proteinfunktionen för att reglera deras roll i övergående processer. De modulerande effekterna av redox PTM 10 har observerats i många aspekter av proteinfunktion 11, inklusive katalys 12, protein-proteininteraktioner 13, konformationsförändring 14, metalljonkoordinering¹⁵ eller farmakologisk inhibitorbindning ¹⁶. Dessutom är redox-PTM involverade i cysteinställen för proteiner som reglerar vägar såsom transkription 17, översättning¹⁸ eller metabolism¹⁹. Med tanke på den inverkan som redox PTM har på proteinfunktion och biologiska processer är det viktigt att kvantifiera omfattningen av oxidation som en cystein plats genomgår som svar på en störning av redoxtillståndet.

Identifieringen av cystein platser med förändrade redoxtillstånd är inriktad på jämförelsen av oxidationstillståndet på platsspecifik nivå mellan normala och störda förhållanden. Fold change mätningar används ofta för att avgöra vilka platser som är signifikant förändrade eftersom detta hjälper användare att tolka vilka cystein platser kan vara fysiologiskt betydelsefulla för studien. Alternativt ger stökiometriska mätningar av reversibel tioloxidation över en specifik provtyp en allmän bild av det fysiologiska tillståndet med avseende på cellulär oxidation, en viktig mätning som ofta förbises och underutnyttjas. Modifieringsstökiometri baseras på kvantifiering av procentandelen modifierad tiol som ett förhållande till totalt proteintiol (modifierat och omodifierat)^20,21. Som ett resultat erbjuder stökiometriska mätningar en mer exakt mätning än vikförändring, särskilt vid användning av masspektrometri. Betydelsen av ökningen av oxidation kan lättare fastställas genom att använda stökiometri för att bestämma PTM-beläggningen för en viss cysteinplats. Till exempel kan en 3-faldig ökning av tioloxidation bero på en övergång på så lite som 1% till 3% eller så stor som 30% till 90%. En 3-faldig ökning av oxidationen för en plats som endast har 1% beläggning kan ha liten inverkan på ett proteins funktion; En 3-faldig ökning för en plats med 30% beläggning i viloläge kan dock påverkas mer väsentligt. Stökiometriska mätningar, när de utförs mellan totala oxiderade tioler och specifika oxidativa modifieringar, inklusive proteinglutationylering (SSG) och nitrosylering (SNO), kan avslöja förhållanden och kvantitativ information med avseende på specifika modifieringstyper.

Eftersom reversibel tioloxidation vanligtvis är en posttranslationell modifiering med låg överflöd, har flera metoder utvecklats för anrikning av proteiner som innehåller dessa modifieringar ur biologiska prover. Ett tidigt tillvägagångssätt som utarbetats av Jaffrey och andra, som heter biotinomkopplartekniken (BST)²², involverar flera steg där omodifierade tioler blockeras genom alkylering, reversibelt modifierade tioler reduceras till begynnande fria tioler, framväxande fria tioler är märkta med biotin och de märkta proteinerna berikas av streptavidinaffinitetsdragning. Denna teknik har använts för att profilera SNO och SSG i många studier och kan anpassas för att undersöka andra former av reversibel tioloxidation^23,24. Medan BST har använts för att undersöka olika former av reversibel tioloxidation, är ett problem med detta tillvägagångssätt att anrikning påverkas av den icke-specifika bindningen av obiotinylerade proteiner till streptavidin. Ett alternativt tillvägagångssätt som utvecklats i vårt laboratorium, kallat hartsassisterad fångst (RAC)^25,26 (figur 1), kringgår frågan om anrikning av tiolgrupper via biotin-streptavidinsystemet.

Efter minskningen av reversibelt oxiderade tioler berikas proteiner med begynnande fria tioler av tiolaffinitetshartset, som kovalent fångar fria tiolgrupper, vilket möjliggör mer specifik anrikning av cysteinhaltiga proteiner än BST. Att koppla RAC med multiplexeringskraften i de senaste framstegen inom isobarisk märkning och masspektrometri skapar ett robust och känsligt arbetsflöde för anrikning, identifiering och kvantifiering av reversibelt oxiderade cysteinrester på proteomomfattande nivå. De senaste framstegen inom masspektrometri har möjliggjort mycket djupare profilering av tiol redoxproteomet, vilket ökar förståelsen för både orsak och effekt av proteintioloxidation²⁷. Den information som erhålls från platsspecifika kvantitativa data möjliggör ytterligare studier av de mekanistiska effekterna och nedströmseffekterna av reversibla oxidativa modifieringar²⁸. Att använda detta arbetsflöde har gett insikt i de fysiologiska effekterna av reversibel cysteinoxidation med avseende på normala fysiologiska händelser som åldrande, där nivåerna av SSG skilde sig åt med avseende på ålder. Åldringseffekterna på SSG vändes delvis med hjälp av SS-31 (elamipretid), en ny peptid som förbättrar mitokondriell funktion och minskar SSG-nivåerna hos åldrade möss, vilket gör att de har en SSG-profil som mer liknar unga möss²⁹.

Patofysiologiska tillstånd som tillskrivs nanopartikelexponering har visat sig involvera SSG i en musmakrofagmodell. Med hjälp av RAC i kombination med masspektrometri visade författarna att SSG-nivåerna var direkt korrelerade med graden av oxidativ stress och försämring av makrofagisk fagocytisk funktion. Data avslöjade också vägspecifika skillnader som svar på olika konstruerade nanomaterial som inducerar olika grader av oxidativ stress³⁰. Metoden har också visat sin användbarhet hos prokaryota arter, där den tillämpades för att studera effekterna av dagliga cykler i fotosyntetiska cyanobakterier med avseende på tioloxidation. Breda förändringar i tioloxidation över flera viktiga biologiska processer observerades, inklusive elektrontransport, kolfixering och glykolys. Dessutom, genom ortogonal validering, bekräftades flera viktiga funktionella platser att modifieras, vilket tyder på reglerande roller för dessa oxidativa modifieringar⁶.

Häri beskriver vi detaljerna i ett standardiserat arbetsflöde (figur 1), som visar nyttan av RAC-metoden för anrikning av totala oxiderade cysteintioler av proteiner och deras efterföljande märkning och stökiometriska kvantifiering. Detta arbetsflöde har implementerats i studier av redoxtillståndet i olika provtyper, inklusive cellkulturer^27,30 och hela vävnader (t.ex. skelettmuskulatur, hjärta, lunga)29,31,32,33. Även om det inte ingår här, är RAC-protokollet också lätt anpassat för undersökning av specifika former av reversibla redoxmodifieringar, inklusive SSG, SNO och S-acylation, som tidigare nämnts^25,29,34.

Protocol

Alla förfaranden som beskrivs i protokollet relaterade till djur- eller humana prover / vävnader godkändes av och följde de institutionella riktlinjerna för etikkommittén för forskning på människor och djur. 1. Provhomogenisering/-lys Frysta vävnadsproverHacka fryst vävnad (~ 30 mg) på ett glasmikroskop som glider på torris med ett förkylt rakblad och pincett. Överför den malet vävnaden till ett förkylt 5 ml rundbottnat polystyrenrör som innehåller 700 μl…

Representative Results

Slutförandet av protokollet kommer att resultera i mycket specifik anrikning av tidigare oxiderade cysteinhaltiga peptider, ofta med >95% specificitet 27,35,36. Flera viktiga steg i protokollet kräver emellertid särskild uppmärksamhet, t.ex. den initiala blockeringen av fria tioler före provlys/homogenisering, vilket förbjuder artificiell oxidation och icke-specifik anrikning av artificiellt oxiderade tioler<sup class="xre…

Discussion

Hartsassisterad fångst har använts i en mängd olika provtyper och biologiska system för undersökning av oxidativa modifieringar av cysteinrester^25,29,30. Denna metod möjliggör utvärdering av prover på flera nivåer och avläsningar, inklusive proteiner och peptider med hjälp av SDS-PAGE och western blot-analys, såväl som enskilda cysteinställen med masspektrometri. Oavsett provtyp eller slutlig slutpunkt möjliggör…

Materials

2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236