Cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica Tandem Mass Tag per la quantificazione multiplexata dell'ossidazione del tiolo proteico

Summary

L’ossidazione del tiolo proteico ha implicazioni significative in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche normali. Descriviamo i dettagli di un metodo di proteomica redox quantitativa, che utilizza la cattura assistita da resina, la marcatura isobarica e la spettrometria di massa, consentendo l’identificazione sito-specifica e la quantificazione dei residui di cisteina ossidati in modo reversibile delle proteine.

Abstract

Modificazioni ossidative reversibili sui tioli proteici sono recentemente emerse come importanti mediatori della funzione cellulare. Qui descriviamo la procedura dettagliata di un metodo di proteomica redox quantitativa che utilizza la cattura assistita da resina (RAC) in combinazione con la marcatura isobarica tandem mass tag (TMT) e la cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) per consentire la quantificazione stechiometrica multiplata dei tioli proteici ossidati a livello di proteoma. Le informazioni quantitative sito-specifiche sui residui di cisteina ossidati forniscono ulteriori informazioni sugli impatti funzionali di tali modifiche.

Il flusso di lavoro è adattabile a molti tipi di campioni, comprese le cellule in coltura (ad esempio, mammiferi, procarioti) e interi tessuti (ad esempio, cuore, polmone, muscolo), che sono inizialmente lisati / omogeneizzati e con tioli liberi alchilati per prevenire l’ossidazione artificiale. I tioli proteici ossidati vengono quindi ridotti e catturati da una resina di affinità tiolica, che ottimizza e semplifica le fasi del flusso di lavoro consentendo l’esecuzione delle procedure di digestione, etichettatura e lavaggio senza ulteriore trasferimento di proteine / peptidi. Infine, i peptidi marcati vengono eluiti e analizzati da LC-MS/MS per rivelare cambiamenti stechiometrici completi relativi all’ossidazione del tiolo attraverso l’intero proteoma. Questo metodo migliora notevolmente la comprensione del ruolo della regolazione redox-dipendente negli stati fisiologici e fisiopatologici correlati all’ossidazione del tiolo proteico.

Introduction

In condizioni omeostatiche, le cellule generano specie reattive di ossigeno, azoto o zolfo che aiutano a facilitare i processi, come il metabolismo e la segnalazione ^1,2,3, estendendosi sia ai procarioti che agli eucarioti. I livelli fisiologici di queste specie reattive sono necessari per il corretto funzionamento cellulare, noto anche come “eustress”^1,4. Al contrario, un aumento degli ossidanti che porta a uno squilibrio tra ossidanti e antiossidanti può causare stress ossidativo, o “distress”¹, che porta a danni cellulari. Gli ossidanti trasducono i segnali ai percorsi biologici modificando diverse biomolecole, tra cui proteine, DNA, RNA e lipidi. In particolare, i residui di cisteina delle proteine sono siti altamente reattivi inclini all’ossidazione a causa del gruppo tiolo sulla cisteina, che è reattivo verso diversi tipi di ossidanti⁵. Ciò dà origine a una vasta gamma di modificazioni post-traduzionali reversibili a base redox (PTM) per la cisteina, tra cui nitrosilazione (SNO), glutationilazione (SSG), solfenilazione (SOH), persolfurazione (SSH), polisolfurazione (SS_nH), acilazione e disolfuri. Le forme irreversibili di ossidazione della cisteina includono la sulfinilazione (SO₂H) e la sulfonilazione (SO₃H).

Le modificazioni ossidative reversibili dei residui di cisteina possono svolgere ruoli protettivi che impediscono un’ulteriore ossidazione irreversibile o servire come molecole di segnalazione per le vie cellulari a valle ^6,7. La reversibilità di alcuni PTM redox tiolici consente ai siti della cisteina di funzionare come “interruttori redox”^8,9, in cui i cambiamenti nello stato redox di questi siti alterano la funzione proteica per regolare il loro ruolo nei processi transitori. Gli effetti modulatori dei PTM redox¹⁰ sono stati osservati in molti aspetti della funzione proteica 11, tra cui la catalisi 12, le interazioni proteina-proteina 13, il cambiamento di conformazione 14, la coordinazione degli ioni metallici 15 o il legame dell’inibitore farmacologico ¹⁶. Inoltre, i PTM redox sono coinvolti nei siti di cisteina delle proteine che regolano percorsi come la trascrizione 17, la traduzione¹⁸ o il metabolismo¹⁹. Dato l’impatto che i PTM redox hanno sulla funzione proteica e sui processi biologici, è importante quantificare l’entità dell’ossidazione che un sito di cisteina subisce in risposta a una perturbazione dello stato redox.

L’identificazione di siti di cisteina con stati redox alterati è focalizzata sul confronto dello stato di ossidazione a livello sito-specifico tra condizioni normali e perturbate. Le misurazioni del cambiamento di piega sono spesso utilizzate per determinare quali siti sono significativamente alterati in quanto ciò aiuta gli utenti a interpretare quali siti di cisteina possono essere fisiologicamente significativi per lo studio. In alternativa, le misurazioni stechiometriche dell’ossidazione tiolicica reversibile in un tipo specifico di campione forniscono un quadro generale dello stato fisiologico rispetto all’ossidazione cellulare, una misura importante che viene spesso trascurata e sottoutilizzata. La stechiometria di modifica si basa sulla quantificazione della percentuale di tiolo modificato in rapporto al tiolo proteico totale (modificato e non modificato)^20,21. Di conseguenza, le misurazioni stechiometriche offrono una misurazione più precisa rispetto al cambio di piega, specialmente quando si utilizza la spettrometria di massa. Il significato dell’aumento dell’ossidazione può essere più facilmente accertato utilizzando la stechiometria per determinare l’occupazione PTM di un particolare sito di cisteina. Ad esempio, un aumento di 3 volte dell’ossidazione del tiolo potrebbe derivare da una transizione da un minimo dell’1% al 3% o dal 30% al 90%. Un aumento di 3 volte dell’ossidazione per un sito che è solo all’1% di occupazione può avere un impatto minimo sulla funzione di una proteina; Tuttavia, un aumento di 3 volte per un sito con un’occupazione del 30% allo stato di riposo può essere influenzato in modo più sostanziale. Le misure stechiometriche, quando eseguite tra tioli ossidati totali e specifiche modificazioni ossidative, tra cui la glutationilazione proteica (SSG) e la nitrosilazione (SNO), possono rivelare rapporti e informazioni quantitative rispetto a specifici tipi di modificazione.

Poiché l’ossidazione reversibile del tiolo è tipicamente una modifica post-traduzionale a bassa abbondanza, sono stati sviluppati diversi approcci per l’arricchimento di proteine contenenti queste modifiche da campioni biologici. Un primo approccio ideato da Jaffrey e altri, chiamato biotina switch technique (BST)²², prevede più passaggi in cui i tioli non modificati sono bloccati attraverso l’alchilazione, i tioli modificati in modo reversibile sono ridotti a tioli liberi nascenti, i tioli liberi nascenti sono etichettati con biotina e le proteine marcate sono arricchite dal pulldown dell’affinità streptavidina. Questa tecnica è stata utilizzata per profilare SNO e SSG in molti studi e può essere adattata per sondare altre forme di ossidazione reversibile del tiolo^23,24. Mentre la BST è stata utilizzata per sondare diverse forme di ossidazione reversibile del tiolo, una preoccupazione con questo approccio è che l’arricchimento è influenzato dal legame non specifico delle proteine non biotinilate alla streptavidina. Un approccio alternativo sviluppato nel nostro laboratorio, denominato cattura assistita da resina (RAC)^25,26 (Figura 1), aggira il problema dell’arricchimento dei gruppi tiolici attraverso il sistema biotina-streptavidina.

In seguito alla riduzione dei tioli ossidati in modo reversibile, le proteine con tioli liberi nascenti vengono arricchite dalla resina di affinità tiolica, che cattura covalentemente i gruppi tiolici liberi, consentendo un arricchimento più specifico delle proteine contenenti cisteina rispetto alla BST. L’accoppiamento di RAC con il potere multiplexante dei recenti progressi nella marcatura isobarica e nella spettrometria di massa crea un flusso di lavoro robusto e sensibile per l’arricchimento, l’identificazione e la quantificazione di residui di cisteina ossidati in modo reversibile a livello di proteoma. I recenti progressi nella spettrometria di massa hanno permesso una profilazione molto più profonda del proteoma redox del tiolo, aumentando la comprensione sia della causa che dell’effetto dell’ossidazione del tiolo proteico²⁷. Le informazioni ottenute dai dati quantitativi sito-specifici consentono ulteriori studi sugli impatti meccanicistici e sugli effetti a valle delle modificazioni ossidative reversibili²⁸. L’utilizzo di questo flusso di lavoro ha fornito informazioni sugli impatti fisiologici dell’ossidazione reversibile della cisteina rispetto ai normali eventi fisiologici come l’invecchiamento, in cui i livelli di SSG differivano rispetto all’età. Gli effetti dell’invecchiamento su SSG sono stati parzialmente invertiti utilizzando SS-31 (elamipretide), un nuovo peptide che migliora la funzione mitocondriale e riduce i livelli di SSG nei topi anziani, causando loro un profilo SSG più simile ai topi giovani²⁹.

È stato dimostrato che le condizioni fisiopatologiche attribuite all’esposizione alle nanoparticelle coinvolgono SSG in un modello di macrofago murino. Utilizzando RAC accoppiato con spettrometria di massa, gli autori hanno dimostrato che i livelli di SSG erano direttamente correlati al grado di stress ossidativo e compromissione della funzione fagocitaria dei macrofagi. I dati hanno anche rivelato differenze specifiche del percorso in risposta a diversi nanomateriali ingegnerizzati che inducono diversi gradi di stress ossidativo³⁰. Il metodo ha anche dimostrato la sua utilità nelle specie procariotiche, dove è stato applicato per studiare gli effetti dei cicli diurni nei cianobatteri fotosintetici rispetto all’ossidazione del tiolo. Sono stati osservati ampi cambiamenti nell’ossidazione del tiolo in diversi processi biologici chiave, tra cui il trasporto di elettroni, la fissazione del carbonio e la glicolisi. Inoltre, attraverso la validazione ortogonale, è stato confermato che diversi siti funzionali chiave sono stati modificati, suggerendo ruoli regolatori di queste modificazioni ossidative⁶.

Qui descriviamo i dettagli di un flusso di lavoro standardizzato (Figura 1), dimostrando l’utilità dell’approccio RAC per l’arricchimento di tioli totali ossidati di cisteina delle proteine e la loro successiva marcatura e quantificazione stechiometrica. Questo flusso di lavoro è stato implementato in studi sullo stato redox in diversi tipi di campioni, comprese le colture cellulari^27,30 e tessuti interi (ad esempio, muscolo scheletrico, cuore, polmone)29,31,32,33. Sebbene non incluso qui, il protocollo RAC è anche facilmente adattabile per lo studio di forme specifiche di modificazioni redox reversibili, tra cui SSG, SNO e S-acilazione, come precedentemente menzionato^25,29,34.

Protocol

Tutte le procedure descritte nel protocollo relative a campioni/tessuti animali o umani sono state approvate e hanno seguito le linee guida istituzionali del comitato etico per la ricerca umana e animale. 1. Omogeneizzazione/lisi del campione Campioni di tessuto congelatiTritare il tessuto congelato (~ 30 mg) su un vetrino da microscopio su ghiaccio secco usando una lama di rasoio prerefrigerata e una pinza. Trasferire il tessuto tritato in un tubo di polistirene a fondo tond…

Representative Results

Il completamento del protocollo comporterà un arricchimento altamente specifico di peptidi precedentemente ossidati contenenti cisteina, spesso con specificità del >95% 27,35,36. Tuttavia, diverse fasi chiave del protocollo richiedono un’attenzione speciale, ad esempio il blocco iniziale dei tioli liberi prima della lisi/omogeneizzazione del campione, che vieta l’ossidazione artificiale e l’arricchimento non specifico dei tiol…

Discussion

La cattura assistita da resina è stata utilizzata in una varietà di tipi di campioni e sistemi biologici per lo studio delle modificazioni ossidative dei residui di cisteina^25,29,30. Questo metodo consente la valutazione di campioni a più livelli e letture, comprese proteine e peptidi utilizzando SDS-PAGE e analisi western blot, nonché singoli siti di cisteina utilizzando la spettrometria di massa. Indipendentemente dal tipo…

Materials

2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236