לכידה בסיוע שרפים בשילוב עם תיוג תג מסת טנדם איזוברי לכימות מרובב של חמצון חלבון תיול
Summary
לחמצון חלבון תיול יש השלכות משמעותיות בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים רגילים. אנו מתארים את הפרטים של שיטת פרוטאומיקה כמותית של חמצון-חיזור, המשתמשת בלכידה בסיוע שרף, תיוג איזוברי וספקטרומטריית מסה, ומאפשרת זיהוי וכימות ספציפיים לאתר של שאריות ציסטאין מחומצנות באופן הפיך של חלבונים.
Abstract
שינויים חמצוניים הפיכים בתיולים חלבוניים התגלו לאחרונה כמתווכים חשובים של תפקוד התאים. להלן נתאר את ההליך המפורט של שיטת פרוטאומיקה כמותית של חמצון-חיזור המשתמשת בלכידה בסיוע שרף (RAC) בשילוב עם תיוג איזוברי של תג מסה טנדם (TMT) וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם (LC-MS/MS) כדי לאפשר כימות סטוכיומטרי מרובב של תיולים חלבוניים מחומצנים ברמת הפרוטאום. המידע הכמותי הספציפי לאתר על שאריות ציסטאין מחומצן מספק תובנה נוספת לגבי ההשפעות הפונקציונליות של שינויים כאלה.
זרימת העבודה ניתנת להתאמה על פני סוגי דגימות רבים, כולל תאים בתרבית (למשל, יונקים, פרוקריוטים) ורקמות שלמות (למשל, לב, ריאות, שרירים), אשר בתחילה שוכבים/הומוגניים ועם תיולים חופשיים להיות alkylated כדי למנוע חמצון מלאכותי. לאחר מכן, תיול החלבון המחומצן מצטמצם ונלכד על ידי שרף זיקה לתיול, אשר מייעל ומפשט את שלבי זרימת העבודה בכך שהוא מאפשר לבצע את הליכי העיכול, הסימון והשטיפה ללא העברה נוספת של חלבונים/פפטידים. לבסוף, הפפטידים המסומנים עוברים אלוט וניתוח על ידי LC-MS/MS כדי לחשוף שינויים סטויכיומטריים מקיפים הקשורים לחמצון תיול על פני הפרוטאום כולו. שיטה זו משפרת מאוד את ההבנה של התפקיד של ויסות תלוי חמצון-חיזור במצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים הקשורים לחמצון חלבון תיול.
Introduction
בתנאים הומאוסטטיים, תאים מייצרים חמצן, חנקן או מיני גופרית תגובתיים המסייעים להקל על תהליכים, כגון חילוף חומרים ואיתות 1,2,3, המגיעים הן לפרוקריוטים והן לאאוקריוטים. רמות פיזיולוגיות של מינים תגובתיים אלה נחוצות לתפקוד תקין של התאים, הידוע גם בשם ‘eustress’1,4. לעומת זאת, עלייה במחמצנים שמובילה לחוסר איזון בין מחמצנים לנוגדי חמצון עלולה לגרום לעקה חמצונית, או ‘מצוקה’1, שמובילה לפגיעה בתאים. מחמצנים מתמרים אותות למסלולים ביולוגיים על ידי שינוי ביומולקולות שונות, כולל חלבונים, דנ”א, רנ”א ושומנים. בפרט, שאריות ציסטאין של חלבונים הן אתרים תגובתיים מאוד המועדים לחמצון עקב קבוצת התיול על ציסטאין, שהוא תגובתי כלפי סוגים שונים של מחמצנים5. זה יוצר מגוון רחב של שינויים פוסט-טרנסלציוניים הפיכים מבוססי חמצון-חיזור (PTMs) עבור ציסטאין, כולל ניטרוזילציה (SNO), גלוטתיוניל (SSG), סולפנילציה (SOH), פרסולפידציה (SSH), פוליסולפידציה (SSnH), אצילציה ודיסולפידים. צורות בלתי הפיכות של חמצון ציסטאין כוללות סולפינילציה (SO2H) וסולפונילציה (SO3H).
שינויים חמצוניים הפיכים של שאריות ציסטאין עשויים לשמש כמגנים ולמנוע חמצון בלתי הפיך נוסף או לשמש כמולקולות איתות למסלולים תאיים במורד הזרם 6,7. ההפיכות של חלק מה-PTMs של חמצון-חיזור מחדש של תיול מאפשרת לאתרי ציסטאין לתפקד כ”מתגי חמצון-חיזור”8,9, כאשר שינויים במצב חמצון-חיזור של אתרים אלה משנים את תפקוד החלבון כדי לווסת את תפקידם בתהליכים חולפים. ההשפעות המווסתות של PTMs10 של חמצון-חיזור נצפו בהיבטים רבים של תפקוד חלבונים11, כולל קטליזה12, אינטראקציות חלבון-חלבון 13, שינוי קונפורמציה 14, תיאום יוני מתכת 15, או קשירת מעכבים פרמקולוגית 16. בנוסף, PTMs של חמצון-חיזור מעורבים באתרי ציסטאין של חלבונים המווסתים מסלולים כגון שעתוק17, תרגום 18 או חילוף חומרים19. בהתחשב בהשפעה שיש ל-PTMs של חמצון-חיזור על תפקוד חלבונים ותהליכים ביולוגיים, חשוב לכמת את מידת החמצון שעובר אתר ציסטאין בתגובה להפרעה במצב חמצון-חיזור.
הזיהוי של אתרי ציסטאין עם מצבי חמצון-חיזור משתנים מתמקד בהשוואה של מצב החמצון ברמה הספציפית לאתר בין תנאים נורמליים לתנאים מופרעים. מדידות שינוי קיפול משמשות לעתים קרובות כדי לקבוע אילו אתרים משתנים באופן משמעותי מכיוון שזה עוזר למשתמשים לפרש אילו אתרי ציסטאין עשויים להיות משמעותיים מבחינה פיזיולוגית למחקר. לחלופין, מדידות סטויכיומטריות של חמצון תיול הפיך על פני סוג דגימה מסוים נותנות תמונה כללית של המצב הפיזיולוגי ביחס לחמצון התאים, מדידה חשובה שלעתים קרובות מתעלמים ממנה ולא מנצלים אותה. סטויכיומטריה של שינוי מבוססת על כימות אחוז התיול המהונדס כיחס לסך החלבון תיול (שונה ולא שונה)20,21. כתוצאה מכך, מדידות סטויכיומטריות מציעות מדידה מדויקת יותר מאשר שינוי קיפול, במיוחד בעת שימוש בספקטרומטריית מסות. ניתן לברר ביתר קלות את משמעות העלייה בחמצון על ידי שימוש בסטויכיומטריה כדי לקבוע את תפוסת ה- PTM של אתר ציסטאין מסוים. לדוגמה, עלייה של פי 3 בחמצון תיול יכולה לנבוע ממעבר של 1% ל-3% או מגודל של 30% עד 90%. עלייה של פי 3 בחמצון עבור אתר שנמצא בתפוסה של 1% בלבד עשויה להיות בעלת השפעה מועטה על תפקוד החלבון; עם זאת, עלייה של פי 3 עבור אתר עם תפוסה של 30% במצב מנוחה עשויה להיות מושפעת באופן משמעותי יותר. מדידות סטויכיומטריות, כאשר הן מבוצעות בין סך כל התיולים המחומצנים לבין שינויים חמצוניים ספציפיים, כולל חלבון גלוטתיוניל (SSG) וניטרוסילציה (SNO), יכולות לחשוף יחסים ומידע כמותי ביחס לסוגי שינויים ספציפיים.
מאחר שחמצון תיול הפיך הוא בדרך כלל שינוי פוסט-טרנסלציוני בעל שפע נמוך, פותחו גישות רבות להעשרת חלבונים המכילים שינויים אלה מתוך דגימות ביולוגיות. גישה מוקדמת שהומצאה על ידי ג’פרי ואחרים, שנקראה טכניקת מתג הביוטין (BST)22, כוללת שלבים מרובים שבהם תיולים ללא שינוי נחסמים באמצעות אלקילציה, תיולים שעברו שינוי הפיך מצטמצמים לתיולים חופשיים מתהווים, תיולים חופשיים מתהווים מסומנים בביוטין, והחלבונים המסומנים מועשרים על ידי משיכה של זיקה לסטרפטאווידין. טכניקה זו שימשה לפרופיל SNO ו- SSG במחקרים רבים וניתן להתאים אותה כדי לחקור צורות אחרות של חמצון תיול הפיך23,24. בעוד ש-BST נוצל כדי לחקור צורות שונות של חמצון תיול הפיך, אחד החששות בגישה זו הוא שההעשרה מושפעת מהקשירה הלא ספציפית של חלבונים לא ביוטינילטים לסטרפטאבידין. גישה חלופית שפותחה במעבדה שלנו, שנקראת לכידה בסיוע שרף (RAC)25,26 (איור 1), עוקפת את הנושא של העשרת קבוצות תיול באמצעות מערכת ביוטין-סטרפטאווידין.
בעקבות הפחתה של תיולים מחומצנים באופן הפיך, חלבונים עם תיולים חופשיים מתהווים מועשרים על ידי שרף זיקה תיול, אשר לוכד באופן קוולנטי קבוצות תיול חופשי, ומאפשר העשרה ספציפית יותר של חלבונים המכילים ציסטאין מאשר BST. צימוד RAC עם כוח הריבוב של ההתקדמות האחרונה בתיוג איזוברי וספקטרומטריית מסות יוצר זרימת עבודה חזקה ורגישה להעשרה, זיהוי וכימות של שאריות ציסטאין מחומצנות באופן הפיך ברמה הרחבה של פרוטאום. ההתקדמות האחרונה בספקטרומטריית מסות אפשרה פרופיל עמוק הרבה יותר של פרוטאום החיזור של תיול, מה שהגביר את ההבנה של הסיבה והתוצאה של חמצון תיול חלבון27. המידע המתקבל מנתונים כמותיים ספציפיים לאתר מאפשר מחקרים נוספים על ההשפעות המכניסטיות וההשפעות במורד הזרם של שינויים חמצוניים הפיכים28. שימוש בתהליך עבודה זה סיפק תובנה לגבי ההשפעות הפיזיולוגיות של חמצון ציסטאין הפיך ביחס לאירועים פיזיולוגיים נורמליים כגון הזדקנות, שבהם רמות ה- SSG היו שונות ביחס לגיל. השפעות ההזדקנות על SSG התהפכו חלקית באמצעות SS-31 (אלמיפרטיד), פפטיד חדש המשפר את תפקוד המיטוכונדריה ומפחית את רמות ה-SSG בעכברים מבוגרים, מה שגורם להם להיות בעלי פרופיל SSG דומה יותר לעכברים צעירים29.
הודגם כי תנאים פתופיזיולוגיים המיוחסים לחשיפה לננו-חלקיקים מערבים SSG במודל מקרופאגים של עכברים. באמצעות RAC בשילוב עם ספקטרומטריית מסות, החוקרים הראו כי רמות SSG היו בקורלציה ישירה למידת העקה החמצונית ולפגיעה בתפקוד הפאגוציטי של מקרופאגים. הנתונים גם חשפו הבדלים ספציפיים למסלול בתגובה לננו-חומרים מהונדסים שונים הגורמים לדרגות שונות של עקה חמצונית30. השיטה הוכיחה את תועלתה גם במינים פרוקריוטים, שם היא יושמה כדי לחקור את ההשפעות של מחזורים יומיים בציאנובקטריה פוטוסינתטית ביחס לחמצון תיול. נצפו שינויים נרחבים בחמצון תיול במספר תהליכים ביולוגיים מרכזיים, כולל הובלת אלקטרונים, קיבוע פחמן וגליקוליזה. יתר על כן, באמצעות אימות אורתוגונלי, מספר אתרים פונקציונליים מרכזיים אושרו לשינוי, מה שמרמז על תפקידים רגולטוריים של שינויים חמצוניים אלה6.
במאמר זה נתאר את הפרטים של זרימת עבודה מתוקננת (איור 1), המדגימה את התועלת של גישת RAC להעשרת סך כל תיולי ציסטאין מחומצנים של חלבונים ואת התיוג והכימות הסטויכיומטרי שלהם לאחר מכן. תהליך עבודה זה יושם במחקרים של מצב חמצון-חיזור בסוגי דגימות שונים, כולל תרביות תאים27,30 ורקמות שלמות (למשל, שרירי שלד, לב, ריאות)29,31,32,33. למרות שאינו כלול כאן, פרוטוקול RAC מותאם בקלות גם לחקירה של צורות ספציפיות של שינויי חמצון-חיזור הפיכים, כולל SSG, SNO ו-S-acylation, כפי שצוין קודם לכן25,29,34.
Protocol
Representative Results
Discussion
לכידה בסיוע שרף שימשה במגוון סוגי דגימות ומערכות ביולוגיות לחקר שינויים חמצוניים של שאריות ציסטאין25,29,30. שיטה זו מאפשרת הערכה של דגימות ברמות וקריאות מרובות, כולל חלבונים ופפטידים באמצעות SDS-PAGE וניתוח כתמים מערביים, כמו גם אתרי ציסטאין ב?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חלקים מהעבודה נתמכו על ידי מענקי NIH R01 DK122160, R01 HL139335 ו- U24 DK112349
Materials
| 2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride | Med Chem Express | HY-101794 | Reagent for in-house resin synthesis |
| 2.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 22431048 | |
| 5.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 30108310 | |
| 5.0 mL round bottom tubes | Falcon | 352054 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Activated Thiol–Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Potential replacement for thiol-affinity resin |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Bicinchonicic acid (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Protein Assay Reagent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Homogenizer | BioSpec Products | 985370 | |
| Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reagent for in-house resin synthesis |
| QIAvac 24 Plus vacuum manifold | Qiagen | 19413 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
| Spin columns | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E reverse phase columns | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Peptide desalting |
| Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
| Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details). |
| TMT isobaric labels (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Peptide labeling reagent; available in multiple formats |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin | Promega | V5820 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | vacuum concentrator |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
- Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular signaling. Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).
- Olson, K. R. The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824 (2021).
- Sies, H. Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis. Redox Biology. 41, 101867 (2021).
- Poole, L. B. The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry. Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).
- Guo, J., et al. Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).
- Shi, X., Qiu, H. Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress. Antioxidants. 9 (11), 1051 (2020).
- Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. Cysteines as redox molecular switches and targets of disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167 (2017).
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
- Go, Y. M., Jones, D. P. The redox proteome. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26512-26520 (2013).
- Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. Cysteine reactivity across the subcellular universe. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).
- Skryhan, K., et al. The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1. PLoS One. 10 (9), 0136997 (2015).
- Su, Z., et al. Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt. Nature Communications. 10 (1), 5486 (2019).
- Liebthal, M., Schuetze, J., Dreyer, A., Mock, H. -. P., Dietz, K. -. J. Redox conformation-specific protein-protein interactions of the 2-cysteine peroxiredoxin in Arabidopsis. Antioxidants. 9 (6), 515 (2020).
- Pace, N. J., Weerapana, E. Zinc-binding cysteines: diverse functions and structural motifs. Biomolecules. 4 (2), 419-434 (2014).
- Schwartz, P. A., et al. Covalent EGFR inhibitor analysis reveals importance of reversible interactions to potency and mechanisms of drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 173 (2014).
- Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms. Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).
- Topf, U., et al. Quantitative proteomics identifies redox switches for global translation modulation by mitochondrially produced reactive oxygen species. Nature Communications. 9 (1), 324 (2018).
- Gao, X. -. H., et al. Discovery of a redox thiol switch: implications for cellular energy metabolism. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (5), 852-870 (2020).
- Prus, G., Hoegl, A., Weinert, B. T., Choudhary, C. Analysis and interpretation of protein post-translational modification site stoichiometry. Trends in Biochemical Sciences. 44 (11), 943-960 (2019).
- Zhang, T., Gaffrey, M. J., Li, X., Qian, W. J. Characterization of cellular oxidative stress response by stoichiometric redox proteomics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (2), 182-194 (2021).
- Jaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nature Cell Biology. 3 (2), 193-197 (2001).
- Alcock, L. J., Perkins, M. V., Chalker, J. M. Chemical methods for mapping cysteine oxidation. Chemical Society Reviews. 47 (1), 231-268 (2018).
- Li, R., Kast, J. Biotin switch assays for quantitation of reversible cysteine oxidation. Methods in Enzymology. 585, 269-284 (2017).
- Guo, J., et al. Resin-assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
- Liu, T., et al. High-throughput comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology. Analytical Chemistry. 76 (18), 5345-5353 (2004).
- Duan, J., et al. Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations. Redox Biology. 36, 101649 (2020).
- Mitchell, A. R., et al. Redox regulation of pyruvate kinase M2 by cysteine oxidation and S-nitrosation. Biochemical Journal. 475 (20), 3275-3291 (2018).
- Campbell, M. D., et al. Improving mitochondrial function with SS-31 reverses age-related redox stress and improves exercise tolerance in aged mice. Free Radical Biology & Medicine. 134, 268-281 (2019).
- Duan, J., et al. Quantitative profiling of protein S-glutathionylation reveals redox-dependent regulation of macrophage function during nanoparticle-induced oxidative stress. ACS Nano. 10 (1), 524-538 (2016).
- Wang, J., et al. Protein thiol oxidation in the rat lung following e-cigarette exposure. Redox Biology. 37, 101758 (2020).
- Kramer, P. A., et al. Fatiguing contractions increase protein S-glutathionylation occupancy in mouse skeletal muscle. Redox Biology. 17, 367-376 (2018).
- Chiao, Y. A., et al. Late-life restoration of mitochondrial function reverses cardiac dysfunction in old mice. Elife. 9, 55513 (2020).
- Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
- Su, D., et al. Quantitative site-specific reactivity profiling of S-nitrosylation in mouse skeletal muscle using cysteinyl peptide enrichment coupled with mass spectrometry. Free Radical Biology & Medicine. 57, 68-78 (2013).
- Su, D., et al. Proteomic identification and quantification of S-glutathionylation in mouse macrophages using resin-assisted enrichment and isobaric labeling. Free Radical Biology & Medicine. 67, 460-470 (2014).
- Searle, B. C., Yergey, A. L. An efficient solution for resolving iTRAQ and TMT channel cross-talk. Journal of Mass Spectrometry. 55 (8), 4354 (2020).
- Duan, J., Gaffrey, M. J., Qian, W. J. Quantitative proteomic characterization of redox-dependent post-translational modifications on protein cysteines. Molecular BioSystems. 13 (5), 816-829 (2017).
- Behring, J. B., et al. Spatial and temporal alterations in protein structure by EGF regulate cryptic cysteine oxidation. Science Signaling. 13 (615), 7315 (2020).
- Shakir, S., Vinh, J., Chiappetta, G. Quantitative analysis of the cysteine redoxome by iodoacetyl tandem mass tags. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (15), 3821-3830 (2017).
- Gorin, G., Martic, P. A., Doughty, G. Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners. Archives of Biochemistry and Biophysics. 115 (3), 593-597 (1966).
- Hsu, M. -. F., et al. Distinct effects of N-ethylmaleimide on formyl peptide- and cyclopiazonic acid-induced Ca2+ signals through thiol modification in neutrophils. Biochemical Pharmacology. 70 (9), 1320-1329 (2005).
- Li, R., Huang, J., Kast, J. Identification of total reversible cysteine oxidation in an atherosclerosis model using a modified biotin switch assay. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2026-2035 (2015).
- Wang, J., et al. Integrated dissection of cysteine oxidative post-translational modification proteome during cardiac hypertrophy. Journal of Proteome Research. 17 (12), 4243-4257 (2018).
- Patra, K. K., Bhattacharya, A., Bhattacharya, S. Molecular dynamics investigation of a redox switch in the anti-HIV protein SAMHD1. Proteins. 87 (9), 748-759 (2019).
