Capture assistée par résine couplée à un étiquetage de masse en tandem isobare pour la quantification multiplexée de l’oxydation des protéines thiols

Summary

L’oxydation des protéines thiols a des implications significatives dans des conditions physiologiques et physiopathologiques normales. Nous décrivons les détails d’une méthode quantitative de protéomique redox, qui utilise la capture assistée par résine, le marquage isobare et la spectrométrie de masse, permettant l’identification et la quantification spécifiques au site des résidus de cystéine oxydés de protéines de manière réversible.

Abstract

Les modifications oxydatives réversibles sur les thiols protéiques sont récemment apparues comme des médiateurs importants de la fonction cellulaire. Nous décrivons ici la procédure détaillée d’une méthode quantitative de protéomique redox qui utilise la capture assistée par résine (RAC) en combinaison avec le marquage isobare par étiquette de masse en tandem (TMT) et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS) pour permettre la quantification stochiométrique multiplexée des thiols de protéines oxydées au niveau du protéome. Les informations quantitatives spécifiques au site sur les résidus oxydés de cystéine fournissent des informations supplémentaires sur les impacts fonctionnels de ces modifications.

Le flux de travail est adaptable à de nombreux types d’échantillons, y compris les cellules en culture (par exemple, mammifères, procaryotes) et les tissus entiers (par exemple, le cœur, les poumons, les muscles), qui sont initialement lysés / homogénéisés et avec des thiols libres alkylés pour empêcher l’oxydation artificielle. Les thiols de protéines oxydées sont ensuite réduits et capturés par une résine d’affinité thiol, qui rationalise et simplifie les étapes du flux de travail en permettant aux procédures de digestion, d’étiquetage et de lavage d’être effectuées sans transfert supplémentaire de protéines / peptides. Enfin, les peptides marqués sont élués et analysés par LC-MS/MS pour révéler des changements stœchiométriques complets liés à l’oxydation du thiol sur l’ensemble du protéome. Cette méthode améliore considérablement la compréhension du rôle de la régulation redox-dépendante dans les états physiologiques et physiopathologiques liés à l’oxydation des protéines thiol.

Introduction

Dans des conditions homéostatiques, les cellules génèrent des espèces réactives d’oxygène, d’azote ou de soufre qui aident à faciliter les processus, tels que le métabolisme et la signalisation ^1,2,3, s’étendant à la fois aux procaryotes et aux eucaryotes. Les niveaux physiologiques de ces espèces réactives sont nécessaires au bon fonctionnement cellulaire, également connu sous le nom d’«eustress»^1,4. En revanche, une augmentation des oxydants qui entraîne un déséquilibre entre les oxydants et les antioxydants peut provoquer un stress oxydatif, ou « détresse »¹, qui entraîne des dommages cellulaires. Les oxydants transduisent les signaux aux voies biologiques en modifiant différentes biomolécules, y compris les protéines, l’ADN, l’ARN et les lipides. En particulier, les résidus de cystéine des protéines sont des sites très réactifs sujets à l’oxydation en raison du groupe thiol sur la cystéine, qui est réactif envers différents types d’oxydants⁵. Cela donne lieu à une gamme variée de modifications post-traductionnelles réversibles à base de redox (PTM) pour la cystéine, y compris la nitrosylation (SNO), la glutathionylation (SSG), la sulfénylation (SOH), la persulfidation (SSH), la polysulfuration (SS_nH), l’acylation et les disulfures. Les formes irréversibles d’oxydation de la cystéine comprennent la sulfinylation (SO₂H) et la sulfonylation (SO₃H).

Les modifications oxydatives réversibles des résidus de cystéine peuvent jouer un rôle protecteur empêchant une oxydation irréversible ultérieure ou servir de molécules de signalisation pour les voies cellulaires en aval ^6,7. La réversibilité de certains PTM redox thiol permet aux sites cystéine de fonctionner comme des « commutateurs redox»^8,9, dans lesquels les changements dans l’état redox de ces sites modifient la fonction protéique pour réguler leur rôle dans les processus transitoires. Les effets modulateurs des PTM redox 10 ont été observés dans de nombreux aspects de la fonction protéique¹¹, notamment la catalyse 12, les interactions protéine-protéine 13, le changement de conformation 14, la coordination des ions métalliques 15 ou la liaison inhibitrice pharmacologique ¹⁶. De plus, les PTM redox sont impliqués dans les sites cystéine des protéines qui régulent des voies telles que la transcription¹⁷, la traduction 18 ou le métabolisme¹⁹. Compte tenu de l’impact que les PTM redox ont sur la fonction protéique et les processus biologiques, il est important de quantifier l’étendue de l’oxydation qu’un site cystéine subit en réponse à une perturbation de l’état redox.

L’identification des sites de cystéine avec des états redox altérés est axée sur la comparaison de l’état d’oxydation au niveau spécifique du site entre les conditions normales et perturbées. Les mesures de changement de pli sont souvent utilisées pour déterminer quels sites sont significativement modifiés, car cela aide les utilisateurs à interpréter quels sites de cystéine peuvent être physiologiquement significatifs pour l’étude. Alternativement, les mesures stœchiométriques de l’oxydation réversible du thiol sur un type d’échantillon spécifique donnent une image générale de l’état physiologique par rapport à l’oxydation cellulaire, une mesure importante qui est souvent négligée et sous-utilisée. La stœchiométrie de modification est basée sur la quantification du pourcentage de thiol modifié par rapport au thiol protéique total (modifié et non modifié)^20,21. En conséquence, les mesures stœchiométriques offrent une mesure plus précise que le changement de pli, en particulier lors de l’utilisation de la spectrométrie de masse. L’importance de l’augmentation de l’oxydation peut être plus facilement déterminée en utilisant la stœchiométrie pour déterminer l’occupation PTM d’un site particulier de cystéine. Par exemple, une multiplication par 3 de l’oxydation du thiol pourrait résulter d’une transition d’aussi peu que 1% à 3% ou aussi grande que 30% à 90%. Une multiplication par 3 de l’oxydation pour un site qui n’est occupé qu’à 1% peut avoir peu d’impact sur la fonction d’une protéine; Cependant, une multiplication par 3 pour un site avec un taux d’occupation de 30% à l’état de repos peut être plus substantiellement affectée. Les mesures stœchiométriques, lorsqu’elles sont effectuées entre les thiols oxydés totaux et des modifications oxydatives spécifiques, y compris la glutathionylation des protéines (SSG) et la nitrosylation (SNO), peuvent révéler des ratios et des informations quantitatives par rapport à des types de modification spécifiques.

Étant donné que l’oxydation réversible du thiol est généralement une modification post-traductionnelle de faible abondance, de multiples approches ont été développées pour l’enrichissement des protéines contenant ces modifications à partir d’échantillons biologiques. Une première approche conçue par Jaffrey et d’autres, appelée la technique de commutation de la biotine (BST)²², implique plusieurs étapes dans lesquelles les thiols non modifiés sont bloqués par alkylation, les thiols modifiés de manière réversible sont réduits en thiols libres naissants, les thiols libres naissants sont marqués avec de la biotine et les protéines marquées sont enrichies par la pulldown d’affinité de streptavidine. Cette technique a été utilisée pour établir le profil de l’ONS et de la SSG dans de nombreuses études et peut être adaptée pour sonder d’autres formes d’oxydation réversible du thiol^23,24. Bien que la BST ait été utilisée pour sonder différentes formes d’oxydation réversible du thiol, l’une des préoccupations de cette approche est que l’enrichissement est affecté par la liaison non spécifique de protéines non biotinylées à la streptavidine. Une autre approche développée dans notre laboratoire, appelée capture assistée par résine (RAC)^25,26 (Figure 1), contourne la question de l’enrichissement des groupes thiol via le système biotine-streptavidine.

Après la réduction des thiols oxydés de manière réversible, les protéines avec des thiols libres naissants sont enrichies par la résine d’affinité thiol, qui capture de manière covalente les groupes thiols libres, permettant un enrichissement plus spécifique des protéines contenant de la cystéine que la BST. Le couplage du RAC avec la puissance de multiplexage des progrès récents du marquage isobare et de la spectrométrie de masse crée un flux de travail robuste et sensible pour l’enrichissement, l’identification et la quantification des résidus de cystéine oxydés de manière réversible au niveau du protéome. Les progrès récents de la spectrométrie de masse ont permis un profilage beaucoup plus approfondi du protéome thiol redox, améliorant ainsi la compréhension de la cause et de l’effet de l’oxydation des protéines thiol²⁷. Les informations obtenues à partir de données quantitatives spécifiques au site permettent d’étudier plus avant les impacts mécanistes et les effets en aval des modifications oxydatives réversibles²⁸. L’utilisation de ce flux de travail a permis de mieux comprendre les impacts physiologiques de l’oxydation réversible de la cystéine par rapport aux événements physiologiques normaux tels que le vieillissement, dans lesquels les niveaux de SSG différaient en fonction de l’âge. Les effets du vieillissement sur la SSG ont été partiellement inversés à l’aide de SS-31 (élamipretide), un nouveau peptide qui améliore la fonction mitochondriale et réduit les niveaux de SSG chez les souris âgées, ce qui leur donne un profil SSG plus similaire à celui des jeunes souris²⁹.

Il a été démontré que les conditions physiopathologiques attribuées à l’exposition aux nanoparticules impliquent la SSG dans un modèle de macrophage murin. En utilisant RAC couplé à la spectrométrie de masse, les auteurs ont montré que les niveaux de SSG étaient directement corrélés au degré de stress oxydatif et à l’altération de la fonction phagocytaire des macrophages. Les données ont également révélé des différences spécifiques à la voie dans la réponse à différents nanomatériaux manufacturés qui induisent différents degrés de stress oxydatif³⁰. La méthode a également prouvé son utilité chez les espèces procaryotes, où elle a été appliquée pour étudier les effets des cycles diurnes chez les cyanobactéries photosynthétiques en ce qui concerne l’oxydation du thiol. De vastes changements dans l’oxydation du thiol à travers plusieurs processus biologiques clés ont été observés, y compris le transport d’électrons, la fixation du carbone et la glycolyse. De plus, grâce à la validation orthogonale, plusieurs sites fonctionnels clés ont été confirmés comme étant modifiés, suggérant des rôles régulateurs de ces modifications oxydatives⁶.

Nous décrivons ici les détails d’un flux de travail standardisé (Figure 1), démontrant l’utilité de l’approche RAC pour l’enrichissement des thiols de cystéine oxydés totaux des protéines et leur marquage ultérieur et leur quantification stœchiométrique. Ce flux de travail a été mis en œuvre dans des études de l’état redox dans différents types d’échantillons, y compris les cultures cellulaires^27,30 et les tissus entiers (par exemple, muscle squelettique, cœur, poumon)29,31,32,33. Bien qu’il ne soit pas inclus ici, le protocole RAC est également facilement adapté à l’étude de formes spécifiques de modifications redox réversibles, y compris SSG, SNO et S-acylation, comme mentionné précédemment^25,29,34.

Protocol

Toutes les procédures décrites dans le protocole concernant les échantillons/tissus animaux ou humains ont été approuvées et suivies par les lignes directrices institutionnelles du comité d’éthique de la recherche sur les humains et les animaux. 1. Homogénéisation/lyse des échantillons Échantillons de tissus congelésHacher du tissu congelé (~30 mg) sur une lame de microscope en verre sur de la glace sèche à l’aide d’une lame de rasoir prérefroidie et d?…

Representative Results

L’achèvement du protocole entraînera un enrichissement hautement spécifique de peptides contenant de la cystéine anciennement oxydés, souvent avec une spécificité de >95% 27,35,36. Cependant, plusieurs étapes clés du protocole nécessitent une attention particulière, par exemple le blocage initial des thiols libres avant la lyse/homogénéisation de l’échantillon, qui interdit l’oxydation artificielle et l’enr…

Discussion

La capture assistée par résine a été utilisée dans divers types d’échantillons et systèmes biologiques pour étudier les modifications oxydatives des résidus de cystéine^25,29,30. Cette méthode permet d’évaluer des échantillons à plusieurs niveaux et lectures, y compris des protéines et des peptides à l’aide de SDS-PAGE et de Western blot, ainsi que des sites individuels de cystéine à l’aide de la spectro…

Materials

2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236