Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Summary

Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.

Abstract

Reversibele oxidatieve modificaties op eiwitthiolen zijn onlangs naar voren gekomen als belangrijke mediatoren van cellulaire functie. Hierin beschrijven we de gedetailleerde procedure van een kwantitatieve redox proteomics-methode die gebruik maakt van resin-assisted capture (RAC) in combinatie met tandem mass tag (TMT) isobare etikettering en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) om multiplexed stochiometrische kwantificering van geoxideerde eiwitthiolen op proteoomniveau mogelijk te maken. De site-specifieke kwantitatieve informatie over geoxideerde cysteïneresiduen biedt extra inzicht in de functionele effecten van dergelijke modificaties.

De workflow is aanpasbaar voor vele soorten monsters, waaronder gekweekte cellen (bijv. Zoogdier, prokaryote) en hele weefsels (bijv. Hart, long, spier), die aanvankelijk worden gelyseerd / gehomogeniseerd en waarbij vrije thiolen worden gealkyleerd om kunstmatige oxidatie te voorkomen. De geoxideerde eiwitthiolen worden vervolgens gereduceerd en gevangen door een thiolaffiniteitshars, die de workflowstappen stroomlijnt en vereenvoudigt door de lopende verterings-, etiketterings- en wasprocedures uit te voeren zonder extra overdracht van eiwitten / peptiden. Ten slotte worden de gelabelde peptiden geëlueerd en geanalyseerd door LC-MS / MS om uitgebreide stoichiometrische veranderingen te onthullen die verband houden met thioloxidatie in het hele proteoom. Deze methode verbetert het begrip van de rol van redox-afhankelijke regulatie onder fysiologische en pathofysiologische toestanden gerelateerd aan eiwitthioloxidatie aanzienlijk.

Introduction

Onder homeostatische omstandigheden genereren cellen reactieve zuurstof-, stikstof- of zwavelsoorten die helpen om processen te vergemakkelijken, zoals metabolisme en signalering ^1,2,3, die zich uitstrekken tot zowel prokaryoten als eukaryoten. Fysiologische niveaus van deze reactieve soorten zijn noodzakelijk voor een goede cellulaire functie, ook bekend als ‘^{eustress’1,4}. Daarentegen kan een toename van oxidanten die leidt tot een onbalans tussen oxidanten en antioxidanten oxidatieve stress of ‘^distress’1 veroorzaken, wat leidt tot cellulaire schade. Oxidanten transduceren signalen naar biologische routes door verschillende biomoleculen te modificeren, waaronder eiwitten, DNA, RNA en lipiden. In het bijzonder zijn cysteïneresiduen van eiwitten zeer reactieve plaatsen die vatbaar zijn voor oxidatie als gevolg van de thiolgroep op cysteïne, die reactief is op verschillende soorten oxidanten⁵. Dit geeft aanleiding tot een breed scala aan reversibele redox-gebaseerde posttranslationele modificaties (PTM’s) voor cysteïne, waaronder nitrosylatie (SNO), glutathionylering (SSG), sulfenylering (SOH), persulfidatie (SSH), polysulfidatie (SS_nH), acylering en disulfiden. Onomkeerbare vormen van cysteïne-oxidatie omvatten sulfinylering (SO₂H) en sulfonylering (SO₃H).

Omkeerbare oxidatieve modificaties van cysteïneresiduen kunnen beschermende rollen vervullen om verdere onomkeerbare oxidatie te voorkomen of dienen als signaalmoleculen voor stroomafwaartse cellulaire routes ^6,7. De omkeerbaarheid van sommige thiol redox PTM’s zorgt ervoor dat cysteïneplaatsen kunnen functioneren als “redoxschakelaars”^8,9, waarbij veranderingen in de redoxtoestand van deze sites de eiwitfunctie veranderen om hun rol in voorbijgaande processen te reguleren. De modulerende effecten van redox PTM’s¹⁰ zijn waargenomen in vele aspecten van eiwitfunctie¹¹, waaronder katalyse¹², eiwit-eiwitinteracties¹³, conformatieverandering¹⁴, metaalionencoördinatie¹⁵ of farmacologische inhibitorbinding¹⁶. Bovendien zijn redox PTM’s betrokken bij cysteïneplaatsen van eiwitten die routes reguleren zoals transcriptie¹⁷, translatie¹⁸ of metabolisme¹⁹. Gezien de impact die redox PTM’s hebben op de eiwitfunctie en biologische processen, is het belangrijk om de mate van oxidatie te kwantificeren die een cysteïneplaats ondergaat als reactie op een verstoring van de redoxtoestand.

De identificatie van cysteïneplaatsen met veranderde redoxtoestanden is gericht op de vergelijking van de oxidatietoestand op het locatiespecifieke niveau tussen normale en verstoorde omstandigheden. Vouwveranderingsmetingen worden vaak gebruikt om te bepalen welke sites aanzienlijk zijn gewijzigd, omdat dit gebruikers helpt te interpreteren welke cysteïnesites fysiologisch significant kunnen zijn voor het onderzoek. Als alternatief geven stoichiometrische metingen van omkeerbare thioloxidatie over een specifiek monstertype een algemeen beeld van de fysiologische toestand met betrekking tot cellulaire oxidatie, een belangrijke meting die vaak over het hoofd wordt gezien en onderbenut. Modificatie stoichiometrie is gebaseerd op het kwantificeren van het percentage gemodificeerde thiol als verhouding tot totaal eiwit thiol (gemodificeerd en ongewijzigd)^20,21. Als gevolg hiervan bieden stoichiometrische metingen een nauwkeurigere meting dan vouwverandering, vooral bij gebruik van massaspectrometrie. De betekenis van de toename van oxidatie kan gemakkelijker worden vastgesteld door stoichiometrie te gebruiken om de PTM-bezetting van een bepaalde cysteïneplaats te bepalen. Een 3-voudige toename van thioloxidatie kan bijvoorbeeld het gevolg zijn van een overgang van slechts 1% naar 3% of zo groot als 30% tot 90%. Een 3-voudige toename van oxidatie voor een site die slechts 1% bezetting heeft, kan weinig invloed hebben op de functie van een eiwit; een 3-voudige toename voor een site met 30% bezetting in rusttoestand kan echter meer substantieel worden beïnvloed. Stoichiometrische metingen, wanneer uitgevoerd tussen totaal geoxideerde thiolen en specifieke oxidatieve modificaties, waaronder eiwitgluutathionylering (SSG) en nitrosylering (SNO), kunnen verhoudingen en kwantitatieve informatie onthullen met betrekking tot specifieke modificatietypen.

Omdat reversibele thioloxidatie typisch een posttranslationele modificatie met een lage abundantie is, zijn er meerdere benaderingen ontwikkeld voor de verrijking van eiwitten die deze modificaties bevatten uit biologische monsters. Een vroege aanpak bedacht door Jaffrey en anderen, genaamd de biotine switch techniek (BST)²², omvat meerdere stappen waarbij ongewijzigde thiolen worden geblokkeerd door alkylering, reversibel gemodificeerde thiolen worden gereduceerd tot ontluikende vrije thiolen, ontluikende vrije thiolen worden gelabeld met biotine en de gelabelde eiwitten worden verrijkt door streptavidin affiniteit pulldown. Deze techniek is in veel studies gebruikt om SNO en SSG te profileren en kan worden aangepast om te onderzoeken op andere vormen van reversibele thioloxidatie^23,24. Hoewel BST is gebruikt om te onderzoeken op verschillende vormen van omkeerbare thioloxidatie, is een zorg bij deze aanpak dat verrijking wordt beïnvloed door de niet-specifieke binding van niet-geïnbiotinyleerde eiwitten aan streptavidin. Een alternatieve aanpak die in ons laboratorium is ontwikkeld, genaamd resin-assisted capture (RAC)^25,26 (figuur 1), omzeilt de kwestie van verrijking van thiolgroepen via het biotine-streptavidin-systeem.

Na de reductie van reversibel geoxideerde thiolen, worden eiwitten met ontluikende vrije thiolen verrijkt met de thiolaffiniteitshars, die covalent vrije thiolgroepen vangt, waardoor meer specifieke verrijking van cysteïnebevattende eiwitten mogelijk is dan BST. Het koppelen van RAC aan de multiplexingkracht van de recente vooruitgang in isobare etikettering en massaspectrometrie creëert een robuuste en gevoelige workflow voor de verrijking, identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen op proteoombreed niveau. Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie hebben een veel diepere profilering van het thiol redoxproteoom mogelijk gemaakt, waardoor het begrip van zowel de oorzaak als het gevolg van eiwitthioloxidatie^{is toegenomen 27}. De informatie die wordt verkregen uit locatiespecifieke kwantitatieve gegevens maakt verdere studies mogelijk van de mechanistische effecten en downstream-effecten van omkeerbare oxidatieve modificaties²⁸. Het gebruik van deze workflow heeft inzicht gegeven in de fysiologische effecten van omkeerbare cysteïne-oxidatie met betrekking tot normale fysiologische gebeurtenissen zoals veroudering, waarbij de niveaus van SSG verschilden met betrekking tot leeftijd. De verouderingseffecten op SSG werden gedeeltelijk omgekeerd met behulp van SS-31 (elamipretide), een nieuw peptide dat de mitochondriale functie verbetert en de SSG-niveaus bij oudere muizen verlaagt, waardoor ze een SSG-profiel hebben dat meer lijkt op jonge muizen²⁹.

Van pathofysiologische aandoeningen die worden toegeschreven aan blootstelling aan nanodeeltjes is aangetoond dat SSG betrokken is bij een macrofaagmodel van muizen. Met behulp van RAC in combinatie met massaspectrometrie toonden de auteurs aan dat SSG-niveaus direct gecorreleerd waren met de mate van oxidatieve stress en aantasting van de macrofaagfagocytische functie. De gegevens onthulden ook pathway-specifieke verschillen in reactie op verschillende gemanipuleerde nanomaterialen die verschillende graden van oxidatieve stress induceren³⁰. De methode heeft ook zijn nut bewezen bij prokaryote soorten, waar het werd toegepast om de effecten van dagcyclussen in fotosynthetische cyanobacteriën met betrekking tot thioloxidatie te bestuderen. Brede veranderingen in thioloxidatie in verschillende belangrijke biologische processen werden waargenomen, waaronder elektronentransport, koolstoffixatie en glycolyse. Bovendien werd door orthogonale validatie bevestigd dat verschillende belangrijke functionele locaties werden gewijzigd, wat suggereert dat deze regulerende rollen van deze oxidatieve modificaties⁶.

Hierin beschrijven we de details van een gestandaardiseerde workflow (figuur 1), die het nut van de RAC-benadering aantoont voor de verrijking van totale geoxideerde cysteïnethiolen van eiwitten en hun daaropvolgende etikettering en stoichiometrische kwantificering. Deze workflow is geïmplementeerd in studies naar de redoxtoestand in verschillende monstertypen, waaronder celculturen ^27,30 en hele weefsels (bijv. skeletspieren, hart, longen)29,31,32,33. Hoewel het hier niet is opgenomen, is het RAC-protocol ook gemakkelijk aan te passen voor het onderzoek naar specifieke vormen van omkeerbare redoxmodificaties, waaronder SSG, SNO en S-acylering, zoals eerder vermeld 25,29,34.

Protocol

Alle in het protocol beschreven procedures met betrekking tot dierlijke of menselijke monsters/weefsels werden goedgekeurd door en volgden de institutionele richtlijnen van de ethische commissie voor onderzoek bij mens en dier. 1. Homogenisatie/lysis van het monster Ingevroren weefselmonstersGehakt bevroren weefsel (~ 30 mg) op een glazen microscoop glaasje op droogijs met behulp van een vooraf gechilleerd scheermesje en een tang. Breng het gehakte weefsel over in een vooraf …

Representative Results

Voltooiing van het protocol zal resulteren in zeer specifieke verrijking van voorheen geoxideerde cysteïnebevattende peptiden, vaak met >95% specificiteit 27,35,36. Verschillende belangrijke stappen van het protocol vereisen echter speciale aandacht, bijvoorbeeld de initiële blokkering van vrije thiolen voorafgaand aan monsterlysis / homogenisatie, die kunstmatige oxidatie en niet-specifieke verrijking van kunstmatig geoxideer…

Discussion

Harsondersteunde afvang is gebruikt in een verscheidenheid aan monstertypen en biologische systemen voor het onderzoek naar oxidatieve modificaties van cysteïneresiduen 25,29,30. Deze methode maakt de evaluatie van monsters op meerdere niveaus en uitlezingen mogelijk, waaronder eiwitten en peptiden met behulp van SDS-PAGE en western blot-analyse, evenals individuele cysteïnesites met behulp van massaspectrometrie. Ongeacht het…

Materials

2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236