タンパク質チオール酸化の多重化定量のための同重体タンデム質量タグ標識と組み合わせた樹脂支援キャプチャ(英語)
Summary
タンパク質チオール酸化は、通常の生理学的および病態生理学的条件下で重要な意味を持ちます。レジンアシストキャプチャー、アイソバリック標識、質量分析を利用して、タンパク質の可逆的に酸化されたシステイン残基の部位特異的同定と定量を可能にする定量的レドックスプロテオミクス法の詳細について説明します。
Abstract
タンパク質チオールの可逆的酸化修飾は、最近、細胞機能の重要なメディエーターとして浮上しています。ここでは、タンデム質量タグ(TMT)同重体標識および液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)と組み合わせて、酸化タンパク質チオールのマルチプレックス確率法をプロテオームレベルで定量できる、樹脂支援捕捉(RAC)を利用した定量的レドックスプロテオミクス法の詳細な手順について説明します。酸化システイン残基に関する部位特異的な定量情報は、そのような修飾の機能的影響に関するさらなる洞察を提供します。
このワークフローは、培養細胞(哺乳類、原核生物など)や組織全体(心臓、肺、筋肉など)など、多くのサンプルタイプに適応でき、最初に溶解/ホモジナイズされ、人工酸化を防ぐために遊離チオールがアルキル化されます。酸化されたタンパク質チオールは、チオール親和性樹脂によって還元および捕捉されるため、タンパク質/ペプチドを追加で移すことなく、消化、標識、洗浄手順を実行できるため、ワークフローのステップが合理化および簡素化されます。最後に、標識ペプチドを溶出し、LC-MS/MSで分析して、プロテオーム全体にわたるチオール酸化に関連する包括的な化学量論的変化を明らかにします。この方法は、タンパク質チオール酸化に関連する生理学的および病態生理学的状態下での酸化還元依存性調節の役割の理解を大幅に向上させます。
Introduction
恒常性条件下では、細胞は活性酸素、窒素、または硫黄種を生成し、代謝やシグナル伝達などのプロセスを促進するのに役立ちます1,2,3、原核生物と真核生物の両方にまで及びます。これらの反応性種の生理学的レベルは、「ユーストレス」としても知られる適切な細胞機能に必要です1,4。対照的に、酸化剤と抗酸化物質のバランスを崩す酸化剤の増加は、酸化ストレス、または「苦痛」1を引き起こし、細胞の損傷につながる可能性があります。酸化剤は、タンパク質、DNA、RNA、脂質などのさまざまな生体分子を修飾することにより、生物学的経路にシグナルを伝達します。特に、タンパク質のシステイン残基は、システイン上のチオール基に起因して酸化を起こしやすい反応性の高い部位であり、異なる種類の酸化剤に対して反応性を示す5。これにより、ニトロシル化(SNO)、グルタチオニル化(SSG)、スルフェニル化(SOH)、ペルスルフィド化(SSH)、ポリスルフィド化(SSnH)、アシル化、ジスルフィドなど、システインに対するさまざまな可逆的レドックスベースの翻訳後修飾(PTM)が生じます。システイン酸化の不可逆的な形態には、スルフィニル化(SO2H)およびスルホニル化(SO3H)が含まれる。
システイン残基の可逆的酸化修飾は、さらなる不可逆的酸化を防止する保護的役割を果たすか、または下流の細胞経路のシグナル伝達分子として役立ち得る6,7。一部のチオールレドックスPTMの可逆性により、システイン部位は「レドックススイッチ」として機能し8,9、これらの部位の酸化還元状態の変化はタンパク質機能を変化させ、一過性プロセスにおける役割を調節します。酸化還元PTMs10の調節効果は、触媒作用12、タンパク質間相互作用13、立体配座変化14、金属イオン配位15、または薬理学的阻害剤結合16を含むタンパク質機能11の多くの側面において観察されている。さらに、レドックスPTMは、転写17、翻訳18、または代謝19などの経路を調節するタンパク質のシステイン部位に関与しています。酸化還元PTMがタンパク質の機能と生物学的プロセスに与える影響を考えると、酸化還元状態の摂動に応答してシステイン部位が受ける酸化の程度を定量化することが重要です。
酸化還元状態が変化したシステイン部位の同定は、通常の条件と摂動状態の間の部位特異的レベルでの酸化状態の比較に焦点を当てています。フォールド変化測定は、どのシステイン部位が研究にとって生理学的に重要であるかをユーザーが解釈するのに役立つため、どの部位が大幅に変化しているかを判断するためによく使用されます。あるいは、特定のサンプルタイプにわたる可逆的なチオール酸化の化学量論的測定は、細胞酸化に関する生理学的状態の全体像を示しますが、これは見過ごされ、十分に活用されていないことが多い重要な測定値です。修飾化学量論は、修飾チオールの割合を総タンパク質チオール(修飾および未修飾)に対する比率として定量することに基づいています20,21。その結果、化学量論的測定は、特に質量分析を使用する場合、倍率変化よりも正確な測定を提供します。酸化の増加の重要性は、化学量論を使用して特定のシステイン部位のPTM占有率を決定することにより、より容易に確認できます。たとえば、チオール酸化の3倍の増加は、わずか1%から3%、または30%から90%の大きな遷移に起因する可能性があります。占有率が1%しかない部位の酸化が3倍に増加しても、タンパク質の機能にはほとんど影響しない可能性があります。ただし、休止状態で30%の占有率を持つサイトの3倍の増加は、より実質的に影響を受ける可能性があります。化学量論的測定は、総酸化チオールとタンパク質グルタチオニル化(SSG)およびニトロシル化(SNO)を含む特定の酸化修飾との間で実行されると、特定の修飾タイプに関する比率および定量的情報を明らかにすることができる。
可逆チオール酸化は通常、低存在量の翻訳後修飾であるため、これらの修飾を含むタンパク質を生物学的サンプルから濃縮するために複数のアプローチが開発されています。Jaffreyらが考案したビオチンスイッチ技術(BST)22と呼ばれる初期のアプローチには、未修飾のチオールをアルキル化によってブロックし、可逆的に修飾されたチオールを新生の遊離チオールに還元し、新生の遊離チオールをビオチンで標識し、標識タンパク質をストレプトアビジン親和性プルダウンによって濃縮する複数のステップが含まれます。この技術は、多くの研究でSNOおよびSSGのプロファイリングに使用されており、他の形態の可逆チオール酸化のプローブに適合させることができます23,24。BSTは、さまざまな形態の可逆的チオール酸化のプローブに利用されてきましたが、このアプローチの懸念の1つは、非ビオチン化タンパク質のストレプトアビジンへの非特異的結合によって濃縮が影響を受けることです。私たちの研究室で開発された別のアプローチである樹脂支援捕獲(RAC)25,26(図1)は、ビオチン-ストレプトアビジン系を介したチオール基の濃縮の問題を回避します。
可逆的に酸化されたチオールの還元に続いて、新生遊離チオールを有するタンパク質は、遊離チオール基を共有結合的に捕捉するチオール親和性樹脂によって濃縮され、BSTよりもシステイン含有タンパク質のより特異的な濃縮を可能にする。RACと、アイソバリック標識および質量分析の最近の進歩のマルチプレックスパワーを組み合わせることで、プロテオーム全体のレベルで可逆的に酸化されたシステイン残基の濃縮、同定、定量のための堅牢で高感度なワークフローが作成されます。質量分析の最近の進歩により、チオールレドックスプロテオームのより深いプロファイリングが可能になり、タンパク質チオール酸化の原因と結果の両方の理解が深まりました27。部位特異的な定量データから得られた情報は、可逆的酸化修飾の機構的影響および下流効果のさらなる研究を可能にする28。このワークフローを利用することで、SSGのレベルが年齢に関して異なる老化などの通常の生理学的イベントに対する可逆的なシステイン酸化の生理学的影響についての洞察が得られました。SSGに対する老化効果は、ミトコンドリア機能を高め、老化マウスのSSGレベルを低下させる新規ペプチドであるSS-31(エラミプレチド)を使用して部分的に逆転し、若いマウスにより類似したSSGプロファイルを持つようになりました29。
ナノ粒子曝露に起因する病態生理学的状態は、マウスマクロファージモデルにおいてSSGが関与することが示されている。RACと質量分析を組み合わせて使用することで、SSGレベルが酸化ストレスの程度とマクロファージ貪食機能の障害に直接相関していることが示された。データはまた、異なる程度の酸化ストレスを誘発する異なる工学的ナノ材料に応答する経路特異的な違いを明らかにした30。この方法は、原核生物種でもその有用性を証明しており、チオール酸化に関する光合成シアノバクテリアの日周周期の影響を研究するために適用されました。電子伝達、炭素固定、解糖など、いくつかの重要な生物学的プロセスにわたるチオール酸化の広範な変化が観察されました。さらに、直交検証により、いくつかの重要な機能部位が修飾されていることが確認され、これらの酸化的修飾の調節的役割が示唆された6。
ここでは、標準化されたワークフローの詳細を説明し(図1)、タンパク質の総酸化システインチオールの濃縮とその後の標識および化学量論定量に対するRACアプローチの有用性を実証します。このワークフローは、細胞培養物27,30および全組織(例えば、骨格筋、心臓、肺)29,31,32,33を含む異なるサンプルタイプにおける酸化還元状態の研究において実施されている。ここには含まれていないが、RACプロトコルは、前述のように、SSG、SNO、およびS-アシル化を含む特定の形態の可逆的酸化還元修飾の調査にも容易に適合させる25,29,34。
Protocol
Representative Results
Discussion
樹脂支援捕捉は、システイン残基の酸化的修飾の研究のために、様々なサンプルタイプおよび生物学的系にわたって利用されている25、29、30。この方法では、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を使用したタンパク質およびペプチド、ならびに質量分析を使用した個々のシステイン部位を含む、複数のレベルおよび読み?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作業の一部は、NIH助成金R01 DK122160、R01 HL139335、およびU24 DK112349によってサポートされました。
Materials
| 2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride | Med Chem Express | HY-101794 | Reagent for in-house resin synthesis |
| 2.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 22431048 | |
| 5.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 30108310 | |
| 5.0 mL round bottom tubes | Falcon | 352054 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Activated Thiol–Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Potential replacement for thiol-affinity resin |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Bicinchonicic acid (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Protein Assay Reagent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Homogenizer | BioSpec Products | 985370 | |
| Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reagent for in-house resin synthesis |
| QIAvac 24 Plus vacuum manifold | Qiagen | 19413 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
| Spin columns | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E reverse phase columns | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Peptide desalting |
| Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
| Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details). |
| TMT isobaric labels (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Peptide labeling reagent; available in multiple formats |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin | Promega | V5820 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | vacuum concentrator |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 |
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