Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol

Summary

La oxidación de la proteína tiol tiene implicaciones significativas en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas normales. Describimos los detalles de un método cuantitativo de proteómica redox, que utiliza captura asistida por resina, etiquetado isobárico y espectrometría de masas, lo que permite la identificación y cuantificación de proteínas de cisteína oxidadas reversibles.

Abstract

Las modificaciones oxidativas reversibles en los tioles proteicos han surgido recientemente como mediadores importantes de la función celular. Aquí describimos el procedimiento detallado de un método cuantitativo de proteómica redox que utiliza la captura asistida por resina (RAC) en combinación con el etiquetado isobárico de etiqueta de masa en tándem (TMT) y la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS) para permitir la cuantificación estoquiométrica multiplexada de tioles de proteínas oxidadas a nivel de proteoma. La información cuantitativa específica del sitio sobre residuos de cisteína oxidada proporciona información adicional sobre los impactos funcionales de tales modificaciones.

El flujo de trabajo es adaptable a través de muchos tipos de muestras, incluidas las células cultivadas (por ejemplo, mamíferos, procariotas) y tejidos enteros (por ejemplo, corazón, pulmón, músculo), que inicialmente se lisan / homogeneizan y con tioles libres alquilados para evitar la oxidación artificial. Los tioles de proteínas oxidadas se reducen y capturan mediante una resina de afinidad por tiol, que agiliza y simplifica los pasos del flujo de trabajo al permitir que los procedimientos de digestión, etiquetado y lavado se realicen sin transferencia adicional de proteínas / péptidos. Finalmente, los péptidos marcados son eluyidos y analizados por LC-MS / MS para revelar cambios estequiométricos completos relacionados con la oxidación del tiol en todo el proteoma. Este método mejora en gran medida la comprensión del papel de la regulación dependiente de redox en estados fisiológicos y fisiopatológicos relacionados con la oxidación de proteínas tiol.

Introduction

En condiciones homeostáticas, las células generan especies reactivas de oxígeno, nitrógeno o azufre que ayudan a facilitar procesos, como el metabolismo y la señalización ^1,2,3, extendiéndose tanto a procariotas como a eucariotas. Los niveles fisiológicos de estas especies reactivas son necesarios para la función celular adecuada, también conocida como “eustrés”^1,4. Por el contrario, un aumento de oxidantes que conduce a un desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes puede causar estrés oxidativo, o “angustia”¹, que conduce al daño celular. Los oxidantes transducen señales a las vías biológicas modificando diferentes biomoléculas, incluyendo proteínas, ADN, ARN y lípidos. En particular, los residuos de cisteína de las proteínas son sitios altamente reactivos propensos a la oxidación debido al grupo tiol en la cisteína, que es reactivo hacia diferentes tipos de oxidantes⁵. Esto da lugar a una amplia gama de modificaciones postraduccionales reversibles basadas en redox (PTM) para cisteína, incluyendo nitrosilación (SNO), glutationilación (SSG), sulfenilación (SOH), persulfuración (SSH), polisulfuración (SS_nH), acilación y disulfuros. Las formas irreversibles de oxidación de cisteína incluyen sulfinilación (SO₂H) y sulfonilación (SO₃H).

Las modificaciones oxidativas reversibles de los residuos de cisteína pueden desempeñar funciones protectoras que impiden una mayor oxidación irreversible o servir como moléculas de señalización para las vías celulares aguas abajo ^6,7. La reversibilidad de algunos PTM redox de tiol permite que los sitios de cisteína funcionen como “interruptores redox”^8,9, en los que los cambios en el estado redox de estos sitios alteran la función de las proteínas para regular su papel en los procesos transitorios. Los efectos moduladores de los PTMs redox 10 se han observado en muchos aspectos de la función proteica¹¹, incluyendo catálisis¹², interacciones proteína-proteína 13, cambio de conformación 14, coordinación de iones metálicos 15 o unión de inhibidores farmacológicos ¹⁶. Además, los PTM redox están involucrados en sitios de cisteína de proteínas que regulan vías como la transcripción¹⁷, la traducción 18 o el metabolismo¹⁹. Dado el impacto que los PTM redox tienen en la función de las proteínas y los procesos biológicos, es importante cuantificar el grado de oxidación que sufre un sitio de cisteína en respuesta a una perturbación del estado redox.

La identificación de sitios de cisteína con estados redox alterados se centra en la comparación del estado de oxidación a nivel específico del sitio entre condiciones normales y perturbadas. Las mediciones de cambio de pliegue a menudo se utilizan para determinar qué sitios están alterados significativamente, ya que esto ayuda a los usuarios a interpretar qué sitios de cisteína pueden ser fisiológicamente significativos para el estudio. Alternativamente, las mediciones estequiométricas de la oxidación reversible del tiol a través de un tipo de muestra específico dan una imagen general del estado fisiológico con respecto a la oxidación celular, una medida importante que a menudo se pasa por alto y se infrautiliza. La estequiometría de modificación se basa en cuantificar el porcentaje de tiol modificado como relación con la proteína tiol total (modificada y no modificada)^20,21. Como resultado, las mediciones estequiométricas ofrecen una medición más precisa que el cambio de pliegue, especialmente cuando se utiliza espectrometría de masas. La importancia del aumento en la oxidación se puede determinar más fácilmente mediante el uso de estequiometría para determinar la ocupación de PTM de un sitio particular de cisteína. Por ejemplo, un aumento de 3 veces en la oxidación del tiol podría resultar de una transición de tan solo 1% a 3% o tan grande como 30% a 90%. Un aumento de 3 veces en la oxidación para un sitio que está solo al 1% de ocupación puede tener poco impacto en la función de una proteína; Sin embargo, un aumento de 3 veces para un sitio con una ocupación del 30% en estado de reposo puede verse afectado de manera más sustancial. Las mediciones estequiométricas, cuando se realizan entre tioles oxidados totales y modificaciones oxidativas específicas, incluida la glutationilación de proteínas (SSG) y la nitrosilación (SNO), pueden revelar proporciones e información cuantitativa con respecto a tipos de modificación específicos.

Debido a que la oxidación reversible del tiol es típicamente una modificación postraduccional de baja abundancia, se han desarrollado múltiples enfoques para el enriquecimiento de proteínas que contienen estas modificaciones a partir de muestras biológicas. Un enfoque temprano ideado por Jaffrey y otros, llamado la técnica de cambio de biotina (BST)^22, implica múltiples pasos en los que los tioles no modificados se bloquean a través de alquilación, los tioles modificados reversiblemente se reducen a tioles libres nacientes, los tioles libres nacientes se marcan con biotina y las proteínas marcadas se enriquecen con la tirada de afinidad de estreptavidina. Esta técnica se ha utilizado para perfilar SNO y SSG en muchos estudios y se puede adaptar para sondear otras formas de oxidación reversible de tiol^23,24. Si bien BST se ha utilizado para investigar diferentes formas de oxidación reversible de tiol, una preocupación con este enfoque es que el enriquecimiento se ve afectado por la unión no específica de proteínas no biotiniladas a la estreptavidina. Un enfoque alternativo desarrollado en nuestro laboratorio, llamado captura asistida por resina (RAC)^25,26 (Figura 1), evita el problema del enriquecimiento de grupos tiol a través del sistema biotina-estreptavidina.

Tras la reducción de los tioles oxidados reversiblemente, las proteínas con tioles libres nacientes se enriquecen con la resina de afinidad tiol, que captura covalentemente los grupos tiol libres, lo que permite un enriquecimiento más específico de proteínas que contienen cisteína que el BST. El acoplamiento de RAC con el poder de multiplexación de los recientes avances en el etiquetado isobárico y la espectrometría de masas crea un flujo de trabajo robusto y sensible para el enriquecimiento, identificación y cuantificación de residuos de cisteína oxidados reversiblemente a nivel de proteoma en todo el proteoma. Los avances recientes en espectrometría de masas han permitido un perfil mucho más profundo del proteoma redox de tiol, aumentando la comprensión tanto de la causa como del efecto de la oxidación de la proteína tiol²⁷. La información obtenida de datos cuantitativos específicos del sitio permite estudios adicionales de los impactos mecanicistas y los efectos posteriores de las modificaciones oxidativas reversibles²⁸. La utilización de este flujo de trabajo ha proporcionado información sobre los impactos fisiológicos de la oxidación reversible de cisteína con respecto a los eventos fisiológicos normales, como el envejecimiento, en los que los niveles de SSG diferían con respecto a la edad. Los efectos del envejecimiento sobre la SSG se revirtieron parcialmente utilizando SS-31 (elamipretide), un nuevo péptido que mejora la función mitocondrial y reduce los niveles de SSG en ratones envejecidos, lo que hace que tengan un perfil de SSG más similar al de los ratones jóvenes²⁹.

Se ha demostrado que las condiciones fisiopatológicas atribuidas a la exposición a nanopartículas involucran SSG en un modelo de macrófagos de ratón. Usando RAC junto con espectrometría de masas, los autores mostraron que los niveles de SSG estaban directamente correlacionados con el grado de estrés oxidativo y el deterioro de la función fagocítica de los macrófagos. Los datos también revelaron diferencias específicas de la vía en respuesta a diferentes nanomateriales diseñados que inducen diferentes grados de estrés oxidativo³⁰. El método también ha demostrado su utilidad en especies procariotas, donde se aplicó para estudiar los efectos de los ciclos diurnos en cianobacterias fotosintéticas con respecto a la oxidación del tiol. Se observaron amplios cambios en la oxidación del tiol en varios procesos biológicos clave, incluido el transporte de electrones, la fijación de carbono y la glucólisis. Además, a través de la validación ortogonal, se confirmó la modificación de varios sitios funcionales clave, lo que sugiere roles reguladores de estas modificaciones oxidativas⁶.

Aquí, describimos los detalles de un flujo de trabajo estandarizado (Figura 1), demostrando la utilidad del enfoque RAC para el enriquecimiento de tioles de cisteína oxidada total de proteínas y su posterior etiquetado y cuantificación estequiométrica. Este flujo de trabajo se ha implementado en estudios del estado redox en diferentes tipos de muestras, incluyendo cultivos celulares^27,30 y tejidos enteros (por ejemplo, músculo esquelético, corazón, pulmón)29,31,32,33. Aunque no se incluye aquí, el protocolo RAC también se adapta fácilmente para la investigación de formas específicas de modificaciones redox reversibles, incluyendo SSG, SNO y S-acilación, como se mencionó anteriormente^25,29,34.

Protocol

Todos los procedimientos descritos en el protocolo relacionados con muestras/tejidos animales o humanos fueron aprobados y siguieron las directrices institucionales del comité de ética de investigación humana y animal. 1. Homogeneización/lisis de la muestra Muestras de tejido congeladoPicar tejido congelado (~ 30 mg) en un portaobjetos de microscopio de vidrio sobre hielo seco con una cuchilla de afeitar preenfriada y pinzas. Transfiera el tejido picado a un tubo de polie…

Representative Results

La finalización del protocolo resultará en un enriquecimiento altamente específico de péptidos que contienen cisteína previamente oxidados, a menudo con una especificidad del >95% 27,35,36. Sin embargo, varios pasos clave del protocolo requieren atención especial, por ejemplo, el bloqueo inicial de tioles libres antes de la lisis/homogeneización de la muestra, que prohíbe la oxidación artificial y el enriquecimiento no …

Discussion

La captura asistida por resina se ha utilizado en una variedad de tipos de muestras y sistemas biológicos para la investigación de modificaciones oxidativas de residuos de cisteína^25,29,30. Este método permite la evaluación de muestras en múltiples niveles y lecturas, incluyendo proteínas y péptidos utilizando SDS-PAGE y análisis de Western blot, así como sitios individuales de cisteína utilizando espectrometría de m…

Materials

2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236