Summary
我们介绍了直接培养、直接暴露培养和暴露培养三种方法，用于评估可生物降解植入物材料的 体外 细胞相容性。这些 体外 方法模仿不同的 体内 细胞 - 植入物相互作用，可以应用于研究各种可生物降解的材料。
Abstract
在过去的几十年中，可生物降解材料已被广泛探索用于生物医学应用，如骨科，牙科和颅颌面植入物。为了筛选用于生物医学应用的可生物降解材料，有必要从 体外 细胞反应，细胞相容性和细胞毒性的角度评估这些材料。国际标准化组织（ISO）标准已被广泛用于生物材料的评估。然而，大多数ISO标准最初是为了评估不可降解材料的细胞毒性而建立的，因此为筛选可生物降解材料提供的价值有限。
本文介绍并讨论了三种不同的培养方法，即直接培养法、直接暴露培养法和暴露培养方法，用于评估具有不同细胞类型的可生物降解植入物材料（包括可生物降解聚合物、陶瓷、金属及其复合材料）的 体外 细胞相容性。研究表明，培养方法会影响细胞对可生物降解材料的反应，因为它们的动态降解会在界面和局部环境中引起时空差异。具体而言，直接培养方法揭示了直接接种在植入物上的细胞的反应;直接暴露培养方法阐明了与植入物接触的已建立宿主细胞的反应;暴露培养方法评估已建立的宿主细胞，这些细胞不与植入物直接接触，但由于植入物降解而受到局部环境变化的影响。
本文提供了这三种培养方法的示例，用于研究可生物降解植入物材料的 体外 细胞相容性及其与骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）的相互作用。它还描述了如何收获，传代，培养，播种，固定，染色，表征细胞以及分析培养后培养基和材料。本文中描述的 体外 方法模拟了 体内 环境的不同场景，拓宽了不同生物材料的 体外 细胞相容性测试对各种生物医学应用的适用性和相关性。
Introduction
几十年来，可生物降解材料已被广泛研究并用于生物医学应用，如骨科1，2，牙科3，4和颅颌面5 应用。与永久性植入物和材料不同，可生物降解的金属，陶瓷，聚合物及其复合材料随着时间的推移，通过生理环境中的不同化学反应在体内逐渐降解。例如，可生物降解的金属，如镁（Mg）合金1，6，7 和锌（Zn）合金8，9 是用于骨固定装置的有前途的材料。它们的生物降解性可以消除二次手术在骨愈合后移除植入物的必要性。可生物降解的陶瓷，如磷酸钙水泥（CPC），在治疗经皮后凸成形术中骨质疏松性椎体压缩性骨折方面显示出令人兴奋的潜力10。CPC为骨折的椎体提供机械支撑，并在骨折愈合后逐渐降解。
可生物降解的聚合物，如一些多糖和聚酯，也被广泛探索用于生物医学应用。例如，壳聚糖水凝胶作为可生物降解的多糖已经显示出其预防感染和再生皮肤组织的能力11。聚L-乳酸（PLLA），聚乙醇酸（PGA）和聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）是被广泛研究的聚酯，用于制造用于组织工程应用的2D或3D多孔支架12，13，14。此外，复合材料集成了金属、陶瓷和聚合物的两相或两相，为广泛的生物医学应用提供高级功能15，16，17。例如，PLGA和磷酸钙复合材料可用于制造可生物降解的支架，用于修复颅骨缺陷等应用18。这些可生物降解的支架和植入物可以支持和促进细胞和组织的生长，然后随着时间的推移在体内逐渐降解。
如 补充表1所示，不同的可生物降解材料可能具有不同的降解机理、产物和速率。例如，镁合金，如Mg-2重量%锌-0.5重量%钙（ZC21）1，Mg-4重量%锌-1重量%Sr（ZSr41）19和Mg-9重量%Al-1重量%锌（AZ91）20，通过与水反应降解，其降解产物主要包括Mg2 + 离子，OH- 离子，H2 气体和矿物沉积物。可生物降解金属的降解速率根据其不同的成分，几何形状和降解环境而变化。例如，Cipriano等人19 报告说，ZSr41线（Ø1.1×15毫米）在植入大鼠胫骨47天后损失了85%的质量，而具有相同几何形状的纯Mg线损失了40%的质量。可生物降解的陶瓷材料，如羟基磷灰石（HA）和β-磷酸三钙（β-TCP），可以通过溶液驱动的细胞外液体溶解降解或分解成小颗粒，然后通过细胞外液体溶解和细胞介导的再吸收过程降解。这些磷酸钙基陶瓷的降解产物可能包括Ca2 + 离子，（PO4）3- 离子，OH- 离子和矿物沉积21。磷酸钙陶瓷的降解速率受其晶体结构的显著影响。例如，Van Blitterswijk等人报告说 ，具有40 vol.%微孔的HA在植入兔子的胫骨3个月后没有失去任何质量，而具有40 vol.%微孔的β-TCP损失了30±4%的质量。诸如PLGA14，23 的聚合物可能由于酯键在水的存在下水解而降解，降解产物主要包括乳酸和乙醇酸。PLGA 50/50 可能需要一个月的时间，PLGA 95/5 可能需要几个月的时间才能实现完全降级24。
细胞反应和细胞相容性测试对于评估和筛选这些可生物降解的植入材料用于生物医学应用至关重要。然而，国际标准化组织（ISO）的现行标准，如ISO 10993-5：2009“医疗器械的生物学评估 - 体外 细胞毒性测试第5部分”，最初旨在评估不可降解生物材料的细胞毒性，如Ti合金和Cr-Co合金 在体外25。具体而言，ISO 10993-5：2009仅涵盖提取物的 体外 细胞毒性测试，直接接触和间接接触测试。在提取物测试中，通过将样品浸入提取液中，例如在标准时间和温度条件下用血清和生理盐水溶液培养基中的样品来制备提取物。然后将收集的提取物或稀释液加入细胞培养物中以研究细胞毒性。对于直接接触测试，通过将测试样品放在已建立的（粘附的）细胞层上来实现样品与细胞之间的直接接触。在间接接触试验中，将含有血清和融化琼脂的培养基移液以覆盖已建立的细胞。然后将样品放入固化的琼脂层上，有或没有过滤器。
ISO标准在应用于体 外评估可生物降解材料时显示出一些局限性。与不可降解材料不同，可生物降解材料的降解行为是动态的，可以在不同的时间或不同的环境条件（例如，温度、湿度、培养基组成和细胞类型）发生变化。提取物测试仅评估材料降解产物的细胞毒性，不反映样品降解的动态过程。ISO标准的直接和间接接触测试仅表征已建立的细胞和样品之间的相互作用。此外，在间接接触试验中，材料和细胞处于不同的微环境中，不反映 体内 环境，不捕捉可生物降解材料的动态降解。
本文的目的是介绍和讨论各种可生物降解植入材料的细胞相容性测试方法，以解决当前ISO标准中描述的方法的上述局限性。本文提出的方法考虑了植入材料的动态降解行为以及 体内细胞-材料相互作用的不同情况。具体而言，本文提供了三种细胞相容性测试方法，即直接培养，直接暴露培养和各种可生物降解材料的暴露培养，包括用于医疗植入物应用的可生物降解聚合物，陶瓷，金属及其复合材料。
在直接培养方法中，悬浮在培养基中的细胞直接接种在样品上，从而评估新接种的细胞与植入物之间的相互作用。在直接暴露培养物中，将样品直接放置在已建立的细胞层上，以模拟植入物与体内已建立的宿主细胞的相互作用。在暴露培养物中，将样品放置在各自的孔插入物中，然后用已建立的细胞引入培养孔，这表征了当它们不与植入物直接接触时，已建立的细胞对植入物降解引起的局部环境变化的反应。直接培养和直接暴露培养方法评估与同一培养井中的植入材料直接或间接接触的细胞。暴露培养物表征细胞在同一培养井中与植入材料间接接触的规定距离。
本文详细介绍了不同可生物降解材料的细胞相容性测试及其与模型细胞（即骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs））的相互作用。这些方案包括细胞的收获，培养，接种，固定，染色和成像，以及培养后材料和培养基的分析，适用于各种可生物降解的植入材料和各种细胞类型。这些方法可用于筛选不同生物医学应用的可生物降解材料，包括细胞反应和 体外细胞相容性。
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Protocol
该协议已获得加州大学河滨分校（UCR）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，用于细胞和组织收获。视频中以一只12周龄的雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠为例。较年轻的雌性和雄性大鼠是首选。
1. 细胞培养制备
注意：本文中描述的三种培养方法通常适用于贴壁的不同细胞类型。在这里，将从大鼠断奶中收获的BMSC作为细胞培养制备的一个例子。根据其与特定医疗应用的相关性，可以使用不同的细胞类型，包括从动物或人类供体中收获的原代细胞以及来自细胞/组织库的细胞系。
- 从大鼠断奶中收获BMSC
注： 图1 中的示意图显示了从大鼠断奶中收获BMSC的步骤。- 通过吸入CO2 对Sprague Dawley（SD）大鼠实施安乐死。
- 取出皮肤和肌肉以及结缔组织，将股骨从安乐死的大鼠身上解剖出来。将股骨置于含有细胞培养基的15 mL锥形管（聚丙烯）中。将锥形管放在冰上，直到进行细胞提取。
注意：胫骨也可用于收获BMSC。细胞培养基是Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM），补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P / S）。 - 将骨头转移到生物安全柜中的培养皿中。使用手术刀片切割骨头的末端，并使用带有251/2 G针头的注射器用细胞培养基清洗骨髓腔，将骨髓冲洗到50 mL锥形管（聚丙烯）中。
注意：将带有18 G针头的注射器插入带有骨髓的培养基中。缓慢而轻柔地，拿起并分配培养基以分解大块骨髓，直到没有可见的细胞/组织附聚物存在。 - 使用70μm过滤器过滤细胞悬浮液，然后以126× g （1，000rpm）离心5分钟以获得细胞沉淀。
- 吸出上清液培养基，并补充 10 mL 新鲜培养基。使用10 mL血清学移液器轻轻地上下移液以重悬细胞。
- 将悬浮液直接移取在T-75烧瓶的内底部，并加入培养基以使体积达到25 mL。在标准无菌细胞培养环境（即37°C，加湿气氛，5%CO 2 和95%空气）的培养箱中培养细胞。
- 3-7天后，通过吸出旧培养基并用新鲜培养基补充来冲洗掉不粘附的细胞。继续培养并用新鲜培养基喂养细胞，直到它们准备好进行细胞传代，冷冻或用于实验。
- 电池维护
- 定期更换细胞培养基以除去细胞废物并大约每隔一天补充营养物质，直到细胞90%-100%汇合。在90%汇合时，传代，冷冻或在实验中使用细胞。
- 传代细胞
注意：传代，也称为传代培养，是一个术语，适用于细胞从一种培养物转移到另一种培养物。新鲜收获的细胞处于传代阶段0（P0）。本文中描述的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液（胰蛋白酶-EDTA）和培养基的量适用于T-75烧瓶。- 在光学显微镜下检查细胞，以确认细胞融合90%。
- 从细胞烧瓶中吸出培养基。
- 使用血清学移液器将 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 分液到烧瓶中。轻轻摇动烧瓶，用PBS冲洗细胞;吸出所有 PBS。
注意：此步骤可作为额外的冲洗，以确保在传代过程中不会转移死细胞或细胞废物。 - 将3mL胰蛋白酶-EDTA分配到细胞烧瓶中，直接分配到细胞表面。轻轻摇动烧瓶，以确保带有细胞的整个表面被胰蛋白酶-EDTA覆盖。
- 将装有胰蛋白酶-EDTA的细胞烧瓶放入培养箱5分钟，以使细胞分离。
- 在培养箱中5分钟后，在光学显微镜下检查细胞以确认细胞被分离。如果某些细胞尚未分离，请轻轻敲击细胞烧瓶的侧面，然后再次检查烧瓶。
- 向细胞烧瓶中加入9mL新鲜培养基以稀释胰蛋白酶-EDTA。这为胰蛋白酶-EDTA提供了更容易获得的蛋白质，使其结合而不是裂解细胞。
- 移出培养基中的细胞和胰蛋白酶-EDTA，并将它们分配到15 mL锥形管中。将细胞以126×g（1，000rpm）离心5分钟。
- 在不干扰细胞沉淀的情况下，用胰蛋白酶-EDTA吸出培养基。
- 向离心管中加入5-10mL新鲜培养基，并使用10mL血清学移液管轻轻重悬培养基中的细胞。
- 将悬浮在培养基中的细胞移出离心管，并将体积分成2-3个新鲜培养瓶。加入足够的培养基，使每个烧瓶的总培养基体积达到25 mL。
注意：传代培养过程中的分裂比例可能因细胞类型和特定生长特征而异。 - 在光学显微镜下检查细胞并将其放回培养箱中。
- 冷冻细胞
- 在光学显微镜下检查细胞，以确认细胞融合90%。
- 重复步骤 1.2.2.2 到 1.2.2.9。
- 将900μL新鲜培养基加入具有100-1000μL微量移液器的离心管中。使用相同的微量移液器缓慢而轻柔地将细胞重悬于培养基中。
- 将900μL细胞悬浮液转移到冷冻管中。加入100μL二甲基亚砜（DMSO）。
- 尽快将冷冻管放入旨在调节温度降低的圆柱形泡沫容器中（见 材料表）。将泡沫容器置于-80°C冰箱中。
- 解冻细胞
- 在水浴中解冻冷冻细胞。取一个充满5 mL新鲜培养基的无菌15 mL锥形管，将细胞置于锥形管中，并以126× g （1，000rpm）离心5分钟。
- 吸出含有DMSO的培养基。
- 将5-10mL新鲜培养基加入15mL锥形细胞管中。缓慢而轻柔地上下移液以重悬细胞。
- 将悬浮在培养基中的细胞从15mL锥形管中移出，然后分配到新的T-75烧瓶中。分配细胞时，使用扫掠动作将细胞尽可能均匀地分布在细胞烧瓶的底部。
- 加入足够的新鲜培养基，使每个T-75烧瓶的总培养基体积达到25 mL。
- 在光学显微镜下检查细胞，并将细胞瓶放回培养箱中。
2. 样品制备和灭菌
- 样品制备
- 使用组织培养处理的板（如 6、12、24、48 或 96 孔板）进行本文所述的细胞培养实验。根据不同的实验设计（如样品尺寸）选择组织培养板的类型和每个孔中培养基的体积。
- 在细胞培养前对所有可生物降解的样品进行灭菌或消毒。
注意：消毒是可以接受的 in vitro 研究样品在某些涉及高温、氧化剂和/或自由基的灭菌条件下容易发生化学和/或表面变化的情况。不同样品类型的灭菌或消毒方法因材料（如聚合物、金属和陶瓷）的不同性质而异。灭菌或消毒过程可能涉及热、气体、辐射、化学品、高压或这些因素的组合。- 可生物降解金属
- 通常，使用紫外线（UV）辐射对可生物降解的金属进行消毒 ，以进行体外 研究。
注：例如，Zhang等人报告说，纯镁（Mg）和ZC21 Mg合金样品在紫外线辐射下消毒4小时，然后才用于细胞研究1。对于 体内 研究，通常需要对样品进行灭菌。对于许多可生物降解的金属，如镁或镁合金，应避免使用蒸汽高压灭菌，因为这些样品可能会在水中氧化或腐蚀6。建议使用石英培养皿进行紫外线消毒，因为它比大多数玻璃和塑料提供更好的紫外线透明度。 - 在100-200°C的温度范围内，在烘箱或高压灭菌器中干热灭菌Mg合金样品。
注意：由于某些金属合金在空气中的高温下仍可能在表面上氧化，因此在某些情况下，可以使用高强度辐射作为替代方案。但是，在对薄金属箔进行灭菌时，应避免高强度辐射，例如α或γ辐射。它可能导致材料内的原子位移，改变材料的微观结构。 - 使用环氧乙烷（EtO）气体灭菌作为对热和辐射敏感的可生物降解金属的替代方法26。
- 通常，使用紫外线（UV）辐射对可生物降解的金属进行消毒 ，以进行体外 研究。
- 可生物降解陶瓷
- 通常， 在体外 研究之前，使用紫外线辐射或70%乙醇溶液对可生物降解的陶瓷进行消毒。
注意：例如，Liu等人报告说，磷酸钙样品通过浸入70%乙醇中消毒1小时，并在每侧暴露于紫外线下12小时，然后用于 体外 细胞相容性测试27。 - 如果高温和水蒸气不会损坏其堆肥和微观结构，请使用高压灭菌器对可生物降解的陶瓷进行灭菌。
注意：某些陶瓷可能会受到高压灭菌的影响。例如，当钇稳定氧化锆陶瓷在121°C下高压灭菌15分钟时，发现相变和表面粗糙化。此外，CPC不能通过蒸汽高压灭菌进行灭菌，因为样品会与水发生反应。 - 对上述钇稳定氧化锆陶瓷和CPC样品使用替代灭菌方法，例如钴-60辐射28。
- 通常， 在体外 研究之前，使用紫外线辐射或70%乙醇溶液对可生物降解的陶瓷进行消毒。
- 可生物降解聚合物
- 通常，在 体外细胞研究中使用可生物降解聚合物之前，使用紫外线辐射或70%乙醇对它们进行消毒。
注意：某些聚合物在紫外线辐射下可能会发生化学变化。对于灭菌，可以使用伽马射线处理，例如钴-60辐射。例如，淀粉粉末在钴-60辐射下灭菌后再用于 体外 细胞研究29。 - 可耐高温和潮湿的高压灭菌高分子材料。
注意：例如，聚丙烯等聚合物可以高温高压灭菌，因为它们可以耐受高压灭菌温度（即121-134°C）。一些聚合物如聚己内酯（PCL）由于其相对较低的熔点（即约60°C）而不能高压灭菌30。 - 使用 EtO 气体对对热敏感的聚合物材料进行灭菌或辐射灭菌。
- 通常，在 体外细胞研究中使用可生物降解聚合物之前，使用紫外线辐射或70%乙醇对它们进行消毒。
- 可生物降解金属
3. 细胞培养方法
- 直接培养方法
注： 图2A 中的示意图显示了直接培养方法的步骤。在本文中，将BMSC培养在放置在12孔组织培养处理板的孔内的Mg衍生板上培养，作为示例来说明培养方法。- 按照步骤1.2.2.1-1.2.2.10中描述的步骤获得细胞悬浮液。
- 使用90%汇合烧瓶使用血细胞计数器测定细胞悬浮液中的细胞浓度。使用新鲜培养基将细胞悬浮液稀释至 体外细胞研究所需的规定细胞浓度。
注意：细胞的接种密度由实验设计决定。例如，2，000-40，000个细胞/ cm 2 的细胞密度已用于具有可生物降解材料的不同细胞研究中。 - 将样品（Mg板）置于12孔处理的组织培养板的中心。依次用2 mL PBS和2 mL DMEM冲洗培养板，以在无菌条件下校准渗透压。将3mL稀释的细胞悬浮液加入每个孔中，以达到目的样品。
- 在标准细胞培养条件下在培养箱中培养细胞24小时。
注意：培养时间可能长于或短于24小时，具体取决于实验设计。
- 直接接触培养
注： 图2B 中的示意图显示了直接暴露培养的步骤。- 如步骤3.1.1和3.1.2中所述，根据不同细胞类型和预期应用的实验设计，制备具有所需细胞浓度的细胞悬浮液。
- 依次用2 mL PBS和2 mL DMEM冲洗培养板，以在无菌条件下校准渗透压。将3mL稀释的细胞悬浮液加入每个孔中。在标准细胞培养条件下，在加湿的培养箱中培养细胞24小时或直到细胞达到50-80%汇合。
注意：细胞汇合水平可能因不同的细胞类型和实验设计而异。 - 24小时后，使用移液器用PBS冲洗孔板中的细胞以除去漂浮的死细胞。
- 将消毒或灭菌的样品直接放在粘附的细胞上。将3毫升新鲜培养基加入每个孔中。
- 在标准细胞培养条件下将细胞再培养24小时。
注意：培养时间可能长于或短于24小时，具体取决于实验设计。
- 接触文化
注： 图2C 中的示意图显示了暴露培养方法的步骤。- 细胞制备的初始步骤与暴露培养相同。如步骤3.1.1和3.1.2中所述，用所需的细胞制备细胞悬浮液。与步骤3.2.1和3.2.2类似，将细胞以所需密度接种在孔板中，并在标准细胞培养条件下在培养箱中培养24小时。
- 24小时后，用PBS冲洗贴壁细胞以除去漂浮的死细胞，然后在每个孔中加入3mL新鲜培养基。
- 之后，将样品放入膜孔径为0.4μm的孔插入物中，并将与样品一起的孔插入物放入每个孔中。
- 在标准细胞培养条件下将细胞再培养24小时。
注意：培养时间可能长于或短于24小时，具体取决于实验设计。
4. 细胞的培养后表征
注意：对于直接培养和直接暴露培养，固定，染色，成像和分析孔板和样品上的细胞贴壁。对于暴露培养，分析粘附在孔板上的细胞。
- 细胞固定
- 将每个孔中的后培养基收集到相应的15 mL锥形管中以进行进一步分析。培养后收集所有样品以进行进一步分析。
- 使用PBS冲洗样品和孔板上贴壁的细胞3次。
- 将1mL的4%多聚甲醛（PFA，10%中性缓冲福尔马林）加入每个孔板中。将盖子放回孔板上，让PFA反应20分钟。
- 20分钟后，吸出PFA并将其分配到废瓶中。使用PBS冲洗孔板3次以除去PFA，并将废物转移到废物瓶中。
- 细胞染色
- 按照制造商的说明准备染色剂的工作库存。
注意：例如，Alexa Fluor 488 Phalloidin用于染色F-肌动蛋白，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）用于染色细胞核。如果样品在染色溶液中迅速降解，则可以缩短染色时间。 - 向每个孔中加入200-400μL稀释的Alexa Fluor 488 Phalloidin染色剂，以覆盖孔板和样品上的细胞。将孔板包裹在铝箔中以防止光照，并让Alexa Fluor 488 Phalloidin在室温下反应20分钟。
- 收集Alexa Fluor 488 Phalloidin染色剂并将其分配到相应的废瓶中。使用PBS冲洗孔板3次，以除去多余的Alexa Fluor 488 Phalloidin，然后将用过的PBS分配到相应的废瓶中。
- 向每个孔中加入200-400μL稀释的DAPI，以覆盖孔中和样品上的细胞。将孔板包裹在铝箔中，让DAPI在室温下反应5分钟。
- 收集DAPI并将其分配到相应的废瓶中。使用PBS冲洗孔板3次以除去DAPI，然后将用过的PBS分配到相应的废瓶中。
- 按照制造商的说明准备染色剂的工作库存。
- 细胞成像
- 染色后，使用荧光显微镜对细胞进行成像。只要有可能，除了荧光图像外，还要拍摄细胞的相差图像。在可生物降解样品上尽快或染色后立即对细胞进行成像，以避免或减少样品连续降解引起的可能变化。固定后将细胞储存在2-8°C的缓冲溶液中的孔板中，并在染色后尽快对细胞进行成像，以避免荧光信号的损失。
- 对于直接培养和直接暴露培养，对两种类型的细胞进行成像和评估：（1）样品上的细胞（与样品直接接触）和（2）细胞贴附在样品周围的孔板上（与样品间接接触），如图 3A所示。
- 对于曝光培养，如图 3B所示，在拍摄细胞荧光图像时使用图像导轨，以确定细胞响应是否响应样品的动态降解梯度而不同。分别对位于内环（距中心3.5毫米）和外环（距中心7毫米）区域内的细胞进行成像和分析。
注：图像指南用于定义细胞和样品之间的距离。 - 对于培养板中的每个样品和孔，从每个感兴趣区域随机取至少五张图像，其中细胞在预定距离内与样品直接接触或间接接触。
- 图像分析
- 对于从步骤4.3获得的所有细胞图像，通过使用用于图像分析的ImageJ等软件测量细胞扩散面积和纵横比来量化细胞形态。
- 计算每个图像区域中的单元格数。将直接和间接接触条件下的细胞粘附密度计算为每单位面积的细胞数。
5. 培养基和样品的培养后分析
- 测量培养后培养基的pH值。
注意：一些样品在降解过程中会改变培养基的pH值。例如，可生物降解的金属（如镁合金）通常会因其降解而增加介质的pH值31。相比之下，可生物降解的聚合物（如PLGA）在降解时通常会降低培养基的pH值32。测量培养后培养基的pH值可以指示这些样品 在体外降解。- 在细胞固定之前，按照步骤4.1.1收集培养后培养基。
- 收集后立即使用预校准的pH计测量每个孔中培养后培养基的pH值。
注：由于CO2 水平和温度等环境条件，介质的pH值可能会随时间漂移，应予以考虑。
- 分析介质成分中可生物降解样品的降解行为。对于某些导致培养基颜色变化的样品，使用分光光度计或酶标仪测量培养后培养基的光密度（O.D.）值，以确定降解行为。或者，使用紫外可见光谱（UV-VIS）和傅里叶变换红外光谱衰减全反射率（FTIR-ATR）来分析培养后培养基中的降解产物。
注：测量培养后培养基中的降解产物对于了解样品的降解行为很有价值。最常见的方法之一是使用电感耦合等离子体光学发射光谱仪（ICP-OES）测量培养后培养基中感兴趣的离子。ICP-OES可用于测量金属和陶瓷的培养后培养基的成分，但可能不适用于聚合物。聚合物通常由碳，氢和氧组成，ICP-OES很难准确量化这些元素。- 在pH测量的步骤5.1.2之后，使用所需的稀释因子收集和稀释培养基，以最佳测量离子浓度。
- 使用ICP-OES测量培养后培养基中目标离子的浓度。
- 样品的培养后分析
注意： 体外 细胞研究后，可生物降解样品的尺寸，质量，表面形态，微观结构和组成可能会发生变化。样品的培养后分析有助于了解样品的降解机制。- 细胞培养后，拍摄样品的照片，以显示样品尺寸，颜色，形态和其他可见特征的可能变化。
- 干燥或脱水后培养样品，并测量样品质量、尺寸和体积，以量化质量、尺寸和体积的任何变化。
- 使用扫描电子显微镜（SEM）表征样品的微观结构和形态。使用能量色散X射线光谱（EDX）和X射线衍射（XRD）来表征样品上降解产物的组成和相。使用FTIR-ATR检测样品表面上的化学键合。
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Representative Results
图4 显示了使用不同培养方法在直接和间接接触条件下BMSC的代表性荧光图像。 图4A、B 显示了与ZC21镁合金直接培养24小时后，在直接和间接接触条件下的BMSC1。ZC21合金由97.5重量%的镁，2重量%的锌和0.5重量%的钙组成。与ZC21合金样品没有直接接触的电池比与样品直接接触的电池扩散得更好。如图 4C，D所示，在直接和间接接触条件下，细胞在与Fe3 + 离子交联的透明质酸（HyA）水凝胶直接暴露24小时后均表现出正常的形态。然而，间接接触条件下的细胞数量低于直接接触条件下的细胞数量33。另一项研究报告了ZSr41合金（ф = 1.1 mm）在暴露培养24小时后对BMSC的降解的影响19。ZSr41合金由95重量%的镁，4重量%的锌和1重量%的锶组成。 图4E 显示了BMSC在距离孔中心3.5 mm的位置粘附在培养井中的代表性荧光图像，在用可生物降解的引脚暴露培养24小时后19。
图5 显示了量化细胞粘附密度的示例数据。 如图5A所示，在24小时直接暴露（24h_DE）培养物中，与ZC21直接接触的BMSC具有明显高于任何其他组的细胞粘附密度。在24 h直接培养（24h_D）中，与ZC21直接接触的BMSC显示出明显高于Mg基团的细胞粘附密度，明显低于Glass参考组，但与Ti合金（T64）对照组相比没有统计学差异。 如图5B所示，在直接暴露培养物的间接接触条件下，ZC21组的BMSC粘附密度明显高于Mg组。然而，与T64和仅细胞对照组相比，它没有显着差异。在直接培养的间接接触条件下，ZC21组的BMSC粘附密度明显高于Mg组，但与T64和仅细胞对照组相比，无显著差异1。
图6A显示了直接暴露培养和直接培养后培养基的pH值。对于直接暴露培养物，所有样品的培养基pH值范围为8.3至8.4。在直接培养物中，培养基的pH值在各组中范围为7.9至8。图9B显示了培养后培养基中的Mg2 +离子浓度。在直接暴露培养和直接培养中，ZC21和Mg组的Mg2 +离子浓度显着高于任何其他对照组1。图7显示了ZSr41和纯Mg在3天暴露培养后的XRD模式。在图7A中，在ZSr41表面发现了Mg、Ca（OH）2、ZnO、MgO∙H2O、Ca（HPO4）（H2O）2和Ca5（PO4）3（OH）（即羟基磷灰石或HA）、Mg17Sr2的晶相。图7B中，Mg、Ca（OH）2、Mg3（PO4）2、Mg7（PO4）2（OH）8、Ca2P2O7∙5H2O的结晶相位于纯Mg19表面。图8A显示了MgO包被Mg的Mg的表面元素组成的SEM图像和EDX图的叠加，以及BMSC直接培养24小时后Mg底物和玻璃的控制。图8B显示了样品表面的定量表面元素组成，表明细胞培养过程中形成的不同沉积34。
图1：示意图显示了从大鼠断奶中收获BMSC的步骤。 此数字由 35修改而来。缩写：BMSCs = 骨髓来源的间充质干细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：示意图显示了三种细胞培养方法。 （A）直接培养，（B）直接暴露培养和（C）暴露培养。此数字由 36修改而来。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：示意图显示直接培养和直接暴露培养。 （A）直接接触和直接接触培养中直接接触和间接接触条件下的细胞。（B）利用成像指南拍摄在暴露培养物中远离样品中心不同距离处粘附在孔板上的细胞的照片。 图3B 从 37修改而来。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：BMSCs的代表性荧光图像（A，B）用ZC21合金直接培养24小时后的直接和间接接触条件。（C、D）用HyA水凝胶直接暴露培养。（E）在培养板上暴露24小时后用ZSr41合金培养。比例尺 = 100 μm.A和B从1再现;C和D从33复制;E是从19复制的。缩写：BMSCs =骨髓来源的间充质干细胞;透明质酸 = 透明质酸。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：BMSCs细胞粘附密度的定量结果（A）直接接触和（B）直接接触培养（24 h_DE）和直接培养（24 h_D）后的间接接触条件。此数字转载自 1。缩写：BMSCs =骨髓来源的间充质干细胞;DE = 直接暴露培养;D = 直接培养。请点击此处查看此图的放大版本。
图6：直接暴露培养和直接培养后培养基培养后培养的代表性结果。此数字转载自 1。缩写：DE = 直接接触文化;D = 直接培养。请点击此处查看此图的放大版本。
图7：用BMSC培养3天后，可生物降解金属样品相分析的代表性培养后结果。 （A）ZSr41的X射线衍射光谱。这个数字是从19转载而来的。缩写：BMSCs =骨髓来源的间充质干细胞;XRD = X 射线衍射。请点击此处查看此图的放大版本。
图8：使用BMSC直接培养24小时后样品表面分析的代表性培养后结果，包括表面微观结构，形态和组成。 （A）覆盖MgO包被Mg.的表面元素组成的SEM图像和EDX图，非包被Mg的Mg对照和Glass参考。（B）从EDX分析中量化的表面元素组成（百分比）。比例尺 = 200 μm。转载自 34。缩写：BMSCs =骨髓来源的间充质干细胞;扫描电镜=扫描电子显微镜;EDX = 能量色散 X 射线光谱。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充表1：不同类型材料的降解机理，产物和速率，以及为培养后样品和培养基分析收集的结果。请点击此处下载此表格。
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Discussion
不同的细胞培养方法可用于评估感兴趣的生物材料的 体外 细胞相容性，用于 体内应用的各个方面。本文演示了三 种体外 培养方法，即直接培养，直接暴露培养和暴露培养，以模拟在人体内使用可生物降解植入材料的不同 体内 场景。直接培养方法主要用于评估新接种的细胞直接贴附在植入材料上并围绕植入材料的行为。直接暴露培养方法模拟 体内 场景，其中植入材料与已建立的细胞和组织直接接触。暴露培养方法可用于显示来自植入物材料的降解产物和局部微环境的变化如何影响不直接与植入物材料接触的已建立的细胞和组织。
在直接培养物中，在直接和间接接触条件下评估新接种的细胞。在直接暴露培养物中，可以在直接和间接接触条件下评估已建立的细胞。在暴露培养物中，只能评估间接接触条件下建立的细胞。在直接培养物中直接接触条件下的新接种细胞受材料性质和材料诱导的培养基变化的影响，例如离子浓度和pH值的变化。
上述材料性能可包括表面形貌、亲水性、表面自由能、刚度和组成。直接培养方法中间接接触条件下的新接种细胞以及直接暴露培养和暴露培养方法中所有已建立的细胞主要受培养基中物质诱导的变化的影响。本文介绍的三种不同方法比培养基提取法等常规方法更接近 体内 环境的实际场景。培养基萃取方法仅评估材料降解产物的细胞毒性，不反映样品降解的动态过程。在本文中描述的培养方法中，由于细胞是用植入材料培养的，可生物降解材料和培养基环境的动态变化会影响 原位细胞。
虽然没有 体外 研究可以完全取代 体内 研究， 但体外 研究是互补的，可以以低成本和有效的方式提供有价值的数据。 体内 研究通常包括模型中的所有多个变量，而 体外 细胞培养可以研究单个因子对细胞 - 材料相互作用的影响。本文介绍的方法可以模拟相关 体内 研究的不同场景。我们可以在不同变量之间建立联系，为 体内 研究提供补充。 体内 模型通常只包括动物类型的相同组织。然而， 体外 研究可以在一种培养物中包括不同的细胞类型，这可以研究不同变量对细胞 - 物质相互作用的综合影响。此外，在 体内模型中 研究动态环境变化对细胞-物质相互作用的影响相对困难。本文中描述的方法可以研究动态变化（例如培养基中的离子浓度）对细胞行为的影响38。
本文中介绍的方法适用于了解所有类型材料（包括聚合物，金属，陶瓷，复合材料和纳米颗粒）的 体外 细胞相容性，并根据预期应用确定它们与不同细胞，细菌或真菌的相互作用。例如，Xu等人通过直接暴露培养方法评估了HyA基水凝胶与BMSC的 体外 细胞相容性33。在直接和间接接触条件下分析了细胞粘附密度和细胞形态。HyA基水凝胶复合材料的细胞毒性可能与细胞培养实验过程中交联的HyA水凝胶释放的Fe3 + 和H + 离子的浓度有关。Tian等人使用暴露培养方法用四种不同的Mg合金培养人尿路上皮细胞（HUCs）24小时和48小时，并使用直接暴露培养方法培养MgO 和Mg（OH）2的不溶性降解产物24小时，以研究含锌（Zn）和锶（Sr）的Mg合金的细胞相容性和降解行为，用于潜在的输尿管支架应用39.在这项研究中，在24小时和48小时暴露培养中，发现含有4重量%锌和0.5重量%Sr的ZSr41_B与所有其他Mg-4Zn-xSr合金中的HUCs具有更好的细胞相容性。结果还显示，当氧化镁（MgO）和氢氧化镁（Mg（OH）2）的浓度在直接暴露培养24 h后超过1.0 mg / mL时，孔板上没有发现可见的贴壁细胞。因此，Tian等人得出结论，降低Mg合金的降解速率对于控制未来临床转化的可能副作用是必要的。Wetteland等人通过将羟基磷灰石（nHA）和nMgO纳米颗粒分散在可生物降解的PLGA聚合物40中，创造了一种基于聚合物的纳米复合材料。采用直接培养方法，用不同样品培养BMSC，研究了该纳米复合材料。结果表明，改善纳米颗粒在聚合物中的分散性可以提高BMSC对nHA /PLGA的附着力，但会降低nMgO/PLGA上的细胞活力。基于 体外 细胞研究的结果，Wetteland等人报告了为不同生物医学应用设计最佳陶瓷/聚合物纳米复合材料的宝贵见解。
细胞形态和细胞数量可以使用用于定量图像分析的软件（如ImageJ）在荧光图像中观察和量化。我们可以通过量化不同样品组的细胞粘附密度，细胞长宽比和细胞扩散区域来研究不同材料对细胞粘附和形态的影响。来自空白对照组的细胞的形态，其中只有细胞在培养基中培养，可以作为参考标准，而不受样品材料的任何影响。我们可以通过比较样品组的细胞粘附密度和细胞形态学与空白对照组的细胞粘附密度和细胞形态来确定样品材料是否会 影响体外的 细胞粘附和形态。细胞扩散区域揭示了细胞粘附在样品表面的偏好，显示了细胞如何与样品材料相互作用。在本文中，我们将DAPI染色的反应时间缩短到小于供应商推荐的最佳时间，因为可生物降解的样品（如纯镁）在水溶液中迅速降解。如果染色过程花费太长时间并且样品的水暴露时间太长，则粘附在可生物降解材料上的细胞的形态可能会发生变化。此外，对于贴附于可生物降解材料的细胞，应及时拍摄细胞图像，以减少由于样品降解而导致的细胞粘附和形态的任何可能变化。
除了收集细胞结果外，培养基后和样品分析也很重要，因为它们将为分析植入材料的降解机制，产物和速率提供有价值的数据。例如，可生物降解的聚合物如PLGA可能在细胞培养过程中产生酸性降解副产物，例如单体或低聚羟基羧酸32，这可能会影响细胞的生长和增殖。相反，可生物降解的金属，如镁及其合金，在降解过程中会产生氢氧根离子和氢气31，这会显著增加局部pH值，严重的碱度可能对局部细胞功能产生不利影响。各种可生物降解的陶瓷也可以增加培养基的pH值41。一般来说，细胞需要培养基中的特定pH值范围才能正常工作，并且已知体液中pH值的增加或降低对生命有害42。测量培养后培养基的pH值对于了解可生物降解样品材料在细胞培养中可能造成的任何潜在危害很有价值。因此，有必要测量培养后培养基的pH值，以了解这些可生物降解材料如何影响细胞的潜在机制。
测量可生物降解材料的培养后培养基中的关键离子浓度非常重要。例如，Cortez Alcaraz等人在使用BMSC34直接培养物研究氧化镁纳米颗粒包被的镁样品时，测量了培养后培养基的Mg2 +和Ca2 +离子浓度。镁离子的浓度表示细胞培养过程中不同样品在体外的降解特性，钙离子的浓度可以提供细胞增殖过程中钙沉积的信息。Xu等人在使用BMSC直接暴露培养物研究HyA水凝胶时测量了培养后培养基的Fe3 +离子浓度。他们利用Fe3 +离子来调节HyA33的交联密度。Fe3 +离子可能会降低培养基的pH值，高浓度的Fe3 +离子可能对细胞有毒。因此，重要的是测量目标离子的浓度，以提高可生物降解材料及其相关降解产物的细胞相容性。
我们可能会收集不同的数据来分析不同材料的细胞- 材料相互作用。例如，如 补充表1所示，Mg合金通过与水反应降解，降解产物可能包括Mg2+ 和OH- 离子，H2 气体和一些其他不溶性降解产物，如Mg（OH）2。XRD，SEM和EDX，可用于确定材料上形成的矿物沉积。我们可以研究培养基中Mg2 + 离子浓度和pH值对细胞行为的影响。此外，我们可以使用这些结果来研究金属降解过程中的气体演变。 体外 研究报告称，H2 气体的临界耐受水平为<0.01 mL/cm2/天，这已被广泛用于筛选镁合金以进行临时植入应用。从本质上讲，气体逸出的量取决于镁合金的降解速率。在另一个例子中，PLGA由于其酯键在水的存在下水解而降解。可以研究乳酸和乙醇酸的降解产物以及培养基中的pH值，以分析细胞 - 材料相互作用。本文中描述的方法包括测量细胞培养基中释放的离子和pH值以及材料的质量变化，这可用于估计材料的降解速率。
不同的材料 通常在体外 和体内表现不同 ， 细胞相容性研究的方法应根据应用环境和材料类型进行选择。对于骨科应用，当相关骨细胞和植入物彼此直接接触时，需要评估它们之间的相互作用。直接培养方法可用于研究新接种的细胞与植入物之间的相互作用。在心血管应用中，由于已建立的细胞将直接或间接地与植入的支架材料接触，因此直接暴露培养和暴露培养方法可用于评估心血管应用中可生物降解金属的细胞相容性。我们认为，本文中描述的 体外 方法是可行的，可以为可生物降解植入物材料的细胞相容性提供初步证据。需要针对具有不同降解机理、产物和速率的不同材料修改培养方法。例如，可以根据不同材料类型的不同降解速率来修改不同材料的培养时间。可以根据材料的不同降解机理和产物收集不同的结果。
综上所述，重要的是在 体外 细胞培养前后对细胞、培养基和样品材料进行定性和定量分析，以了解可生物降解的植入材料及其降解产物对细胞相容性的影响。本文中介绍的三种培养方法可用于研究各种可生物降解材料，包括可生物降解的聚合物，陶瓷和用于医疗植入物和组织工程应用的金属。这些 体外 细胞研究对于筛选可生物降解材料，在产品开发的早期阶段优化可植入设备和支架的设计以及降低对细胞的潜在毒性非常有价值。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢美国国家科学基金会（NSF CBET奖1512764和NSF PIRE 1545852），美国国立卫生研究院（NIH NIDCR 1R03DE028631），加州大学（UC）摄政学院发展奖学金，研究种子资助委员会（Huinan Liu）和UC-Riverside论文研究资助（林佳佳）的财政支持。作者赞赏加州大学河滨分校的高级显微镜和微量分析中央设施（CFAMM）使用SEM / EDS和Perry Cheung博士使用XRD仪器。作者还感谢Thanh Vy Nguyen和Queenie Xu的部分编辑。作者还要感谢Cindy Lee为视频录制旁白。本文中表达的任何意见、发现和结论或建议均为作者的观点，并不一定反映美国国家科学基金会或美国国立卫生研究院的观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
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