Summary
该协议描述了一种易于使用的方法，通过跟踪14CO2的体外生产来检查底物氧化。
Abstract
线粒体是三羧酸（TCA）循环和电子传递链（ETC）的机器，其产生三磷酸腺苷（ATP）以维持能量稳态。葡萄糖，脂肪酸和氨基酸是大多数体细胞中促进线粒体呼吸的主要能量底物。有证据表明，不同的细胞类型可能对某些底物有明显的偏好。然而，骨架中各种细胞的底物利用尚未得到详细研究。此外，由于细胞代谢与生理和病理生理学变化相协调，对骨骼细胞底物依赖性的直接评估可能为骨骼疾病的发病机制提供重要的见解。
以下方案基于氧化磷酸化后底物分子释放二氧化碳的原理。通过使用含有放射性标记碳原子（14C）的底物，该方法为细胞培养物中的底物氧化速率提供了一种灵敏且易于使用的测定方法。一项以原代颅骨前成细胞与骨髓来源的巨噬细胞 （BMM） 为临床的案例研究显示，两种细胞类型之间主要底物的利用率不同。
Introduction
真核生物中的氧化磷酸化（OXPHOS）是营养物质在线粒体内部分解的过程，通过消耗氧气以ATP的形式释放化学能。 线粒体内部各种底物通过三羧酸（TCA）循环的分解代谢直接产生很少的ATP分子，而是通过还原电子载体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD +）来储存能量。然后，还原的载流子被位于线粒体内膜上的ETC氧化，以产生穿过膜的质子浓度梯度。质子最终通过ATP合酶沿着梯度流回线粒体基质中，产生ATP。OXPHOS是从能量基材生产ATP的最有效手段，通常在有氧环境中是优选的。以前，有氧糖酵解 - 在存在氧气的情况下从葡萄糖中产生乳酸盐 - 被认为是病理生理学的，通常是癌细胞的标志。越来越多的人发现，一些正常细胞类型使用有氧糖酵解的原因尚未完全破译。
代谢灵活性是细胞或生物体适应不断变化的能量需求和可用燃料来源的能力。例如，骨骼肌的能量需求主要由稳定状态下的OXPHOS满足，但在高强度运动中通过厌氧糖酵解满足1。随着运动持续时间的增加，葡萄糖和脂肪酸氧化对整体能量产生的贡献更大2.然而，基板的使用不仅取决于可用性，因为基底在氧化过程中具有拮抗性竞争。最值得注意的是，脂肪酸氧化已被证明可以抑制骨骼肌对葡萄糖的利用，这种现象称为Randle效应3。随后的研究4，5证明了互惠效应。此外，许多疾病与底物偏好的变化和细胞代谢不灵活性的发展有关。例如，与正常对照组相比，II型糖尿病患者的骨骼肌中的脂肪酸氧化减少6。疾病环境中的代谢变化是一个需要深入研究的主题，因为它们可能有助于发病机制。
骨骼细胞类型中的能量代谢相对较少，但近年来引起了人们的关注7.先前的研究表明，有氧糖酵解是颅变成骨细胞中的主要能量途径，而通过TCA循环的葡萄糖氧化在破骨细胞形成中起作用8，9。其他人已经提供了脂肪酸作为成骨细胞能量来源的证据10。谷氨酰胺分解代谢也被证明支持成骨细胞与祖细胞的分化11，12。然而，对各种骨骼细胞类型的底物利用的全面了解仍然缺乏。此外，细胞分化过程中细胞代谢的变化或对病理信号的反应预计将改变燃料底物的利用率。下面描述的是一种易于使用的方案，用于 在体外测定底物氧化。
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Protocol
放射性物质（RAM）的使用需要事先得到每个机构的指定安全委员会的批准。该协议中使用的RAM已获得宾夕法尼亚大学环境健康与辐射安全（EHRS）的批准。使用动物需要事先获得家庭机构的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。以下研究由费城儿童医院的IACUC批准。
1. 14种C标记底物的储备溶液的制备
- 通过将11gBSA和33.1mL Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）混合，并在室温下轻轻摇动约3小时，直到BSA完全溶解，制成4mM牛血清白蛋白（BSA）储备溶液。使用前在70°C水浴中加热BSA储备溶液。
- 在小瓶中风干50μCi 14C-油酸酯（50μCi / μmol乙醇），盖子关闭在指定的RAM工作罩中8小时。加入312.5μL H2O，然后加入3.5mg（11.5μmol）油酸钠。彻底混合。
- 在水浴中将所得溶液加热至70°C。加入0.9375 mL预热BSA储备溶液，得到10mM热油酸酯储备溶液（含有14 C-油酸酯与未标记油酸酯的 1：11.5比例）。等分库存溶液并将其储存在-20°C以备长期使用。
- 解冻后直接使用 14C-葡萄糖和 14C-谷氨酰胺。
2. 含有 14种C标记底物的培养基的制备
注意：为确保介质中能量基板的可靠浓度，定制介质必须与使用前不久添加的新鲜基板一起使用。在这里，使用不含葡萄糖，丙酮酸，谷氨酰胺，酚红或碳酸氢钠的定制最小必需培养基（MEMα）。然而，应为每种细胞类型确定最佳培养基。
- 在1升纯水中重建8.67克培养基粉末。加入2.2g碳酸氢钠以达到7.4的pH值，并使用0.22μm真空过滤溶液。
- 加入新鲜成分以获得终浓度为5.5 mM葡萄糖，2 mM谷氨酰胺，1 mM丙酮酸盐和10%胎牛血清（FBS）的完整培养基（cMEMα）。进一步补充 cMEMα 与 100 mM 左旋肉碱和 10 μM HEPES 以促进脂肪酸氧化.
- 使用前立即将 14种C标记的底物加入新鲜制备的cMEMα中以制作热介质。要使油酸酯热培养基，将10mM热油酸酯储备溶液加入cMEMα中，最终浓度为100μM油酸酯（1：100稀释，最终放射性0.4μCi / mL）。
注意：含有1：11.5比例的10 mM热油酸酯储备（见步骤1.3）用于在介质中达到100μM总油酸酯的生理水平，同时最大限度地减少放射性物质的量。 - 通过在70°C的水浴中加入24.36mg油酸钠至2mL H2O中，直到完全溶解，然后与6mL预热至70°C的4mM BSA储备溶液快速混合，使10mM未标记的油酸盐储备液制成10mM未标记的油酸盐储备液。 转移到37°C水浴中1小时，并通过0.22μm过滤器过滤。等分试样并储存在-20°C下长期使用。
- 要使葡萄糖热培养基，将 14C-葡萄糖加入到终浓度为1.333μM（1：4，125稀释，最终放射性0.4μCi / mL）中。要使谷氨酰胺热培养基，加入 14C-谷氨酰胺至2μM的最终浓度（1：1，000稀释，最终放射性0.4μCi / mL）。
- 用步骤2.4中未标记的油酸盐的10mM储备溶液补充葡萄糖和谷氨酰胺热培养基，以达到100μM油酸盐的最终浓度，与油酸酯热培养基中的浓度相同。
3. 细胞的制备
注意：这里使用颅变前成骨细胞和骨髓巨噬细胞作为示例。用户应根据适当的方案准备他们选择的细胞类型。优化胶原酶II的浓度，以便在中试实验中用于消化，因为酶活性可能因不同批次而异。
- 颅内前成骨细胞的分离和培养
- 通过斩首处死产后第3-5天（P3-5）幼崽，并将其转移到含有青霉素 - 链霉素（P / S）的冰冷DPBS中。
- 通过去除皮肤和软组织来暴露颅骨。通过在DPBS中从后到前切除周围组织来收集中间区域（图1A）。用镊子轻轻划伤颅骨的内表面和外表面，以帮助在随后的消化时释放细胞。
- 在DPBS中制备2mg / mL和4mg / mL的DPBS中II型胶原酶溶液，并用新鲜的0.22μm过滤器过滤每种溶液。首先用2mg / mL胶原酶溶液消化清洁的牙腠15分钟，然后丢弃消化溶液。将清洁的样品在4mg / mL胶原酶溶液中消化3次，每次15分钟，池化并保存消化溶液。
- 通过70μm细胞过滤器过滤消化溶液，并将滤液以300× g 离心5分钟。将细胞沉淀重悬于含有10%FBS和P / S的cMEMα（参见步骤2.2）中。
- 计数并接种细胞在4×10个4 个细胞/ cm2在10 cm板中。将细胞在37°C培养箱中用5%CO2 培养3天。
- 用0.25%胰蛋白酶- EDTA在37°C下解离细胞。在7.5×105 / cm 2下，用含有10%FBS和P / S的cMEMα在24孔细胞培养板中计数并接种细胞。在测定之前，每个底物的每个细胞类型至少接种4个孔，每种细胞类型至少接种三个额外的孔，用于细胞计数。
- 在底物氧化测定之前，在37°C下培养细胞过夜。
- 小骨钢的分离和培养
注意：BMM的培养需要巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），其可以作为重组蛋白在商业上购买。来自CMG14-12细胞系的条件培养基被设计用于表达M-CSF是这里使用的经济型替代品13。- 去除肌肉和结缔组织后，从8周龄的小鼠身上收集股骨和胫骨。用锋利的剪刀切开骨头的两端并丢弃。
- 将骨髓从一个股骨和一个胫骨冲洗到10厘米的培养皿中，注射器装有23 G针头，其中含有15毫升cMEMα和10%FBS，P / S和10%CMG14-12条件培养基（BMM培养基）。在37°C培养箱中用5%CO2培养细胞。
- 3天后，丢弃培养基并用DPBS冲洗。在37°C下用0.25%胰蛋白酶-EDTA解离附着的细胞5分钟。离心并将细胞沉淀重悬于BMM培养基中。
- 以与3.1.6中描述的相同的方式，以7.5×105 / cm2在24 孔细胞培养板中计数并接种细胞。在开始测定之前，在37°C下在BMM培养基中培养过夜。
4. 使用CO2 阱进行底物氧化测定
注意：应为每种细胞类型确定适当的接种密度，以便在测定开始之前达到80-90%汇合。请注意，细胞密度会影响细胞的代谢状态。
- 用DPBS洗涤额外孔中的细胞两次。用0.25%胰蛋白酶-EDTA解离细胞，并将重悬于DPBS中的20μL细胞与20μL吖啶橙/碘化丙啶（AO / PI）即用型商用染料溶液混合。使用自动细胞计数器确定活细胞的数量，并记录该数量以进行最终计算。
- 用DPBS洗涤测定孔中的细胞两次。向RAM指定的组织培养罩中的每个测定孔中加入500μL热培养基。用parafilm密封板，并将细胞在RAM指定的培养箱中在37°C下孵育4小时。
- 在孵育期间，将滤纸切成略大于1.5ml微量离心管盖内面积的圆形块，并将纸紧紧地插入盖中（图1B）。向每个管中加入200μL1M高氯酸，向盖子内的滤纸中加入20μL氢氧化钠。
- 孵育细胞后，将400μL培养基从每个孔转移到制备的试管中并立即关闭盖子。将管子在室温下留在管架中1小时。
- 在孵育期间，为每个管子设置一个闪烁小瓶，并用4 mL闪烁液填充。将每张滤纸转移到闪烁小瓶中，并在室温下孵育30分钟。
- 在组织培养罩，水浴（用于 14C-油酸酯制备），冰箱，培养箱，水槽，地面和任何其他工作区域进行擦拭测试，以产生潜在的RAM污染。将纸擦拭布放入含有闪烁液的闪烁小瓶中。
- 用闪烁计数器测量闪烁小瓶中的 14C放射性。记录读数结果。如有必要，请根据辐射安全指南对工作环境进行净化。
5. 数据分析
注意：假设每个底物完全氧化以释放CO2，则可以根据捕获的CO2 放射性计算基底氧化速率。
- 对于不同的基材，使用等式（1）和表1中给出的X，Y和Z值计算基板氧化速率。
底物氧化速率（μmol/cell/h） =
（1）- 计算每个反应孔的每分钟总崩解量 （DPM）。对于 X，使用用于 CO2 的 0.4 mL 反应介质的 DPM 值（闪烁计数器读数），从总反应介质的 0.5 mL 中捕获出来。因此，每个反应孔的总DPM为X×1.25。
- 将总 DPM 除以系数 2，220，000 以转换为 μCi。
- 将μCi中的放射性转换为 14个C标记分子的数量。将μCi值除以每个标记底物的比活性（Y）。使用以下Y值（表1）： 14C-葡萄糖：300mCi / mmol; 13C-谷氨酰胺： 200 毫微克/毫摩尔; 13油酸甲酯：50毫微克/毫摩尔。
- 通过将氧化的 14个C标记分子与热总稀释因子（Z）相乘来计算氧化分子的氧化分子总数。使用以下Z值（表1）：葡萄糖：4，125;谷氨酰胺： 1，000;油酸酯：12.5。
- 将得到的产物除以细胞数（cell#）和4（反应时间为4小时）以确定每个细胞的底物氧化速率。使用测定开始时在平行孔中测定的细胞#。
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Representative Results
在本例中，CO2 捕获法用于比较原代颅骨前成细胞的底物氧化与 BBM，后者通常分别用于 体外 成骨细胞或破骨细胞分化。在cMEMα中传代和培养过夜后，它们通常达到汇合的80-90%，并表现出其特征形态。颅内前成骨细胞明显大于BMM（图2）。按照步骤4.1至4.7对每种细胞类型进行葡萄糖，谷氨酰胺和油酸盐的氧化测定。使用等式（1）分析结果。
结果表明，在颅内胎前成形体中，每种底物的氧化速率显着高于BMM，可能表明OXPHOS在前成骨细胞中产生更大的能量（图3）。以前使用海马技术的研究表明，OXPHOS占前成骨细胞中ATP产量的约60%，但在成熟成骨细胞中显着减少，其中有氧糖酵解占能量的约80%9。目前的结果表明，所有三种主要底物都有助于前成骨细胞中的OXPHOS。然而，需要进一步研究以确定成熟成骨细胞中一种或所有底物的利用率是否降低。
图 1：CO2 捕获测定和颅骨解剖的示意图。 （A）收获由橙色虚线三角形表示的颅骨的中间区域用于细胞分离。（B） 1.5 mL 微量离心管用于 CO2 捕集（步骤 1）。将滤纸（用于说明目的的蓝纸）切割以适合管帽（步骤2）。在关闭盖子之前，将200μL1M高氯酸加入每个管中细胞培养物中的400μL热培养基中，并将20μLNaOH加入滤纸（步骤3）（步骤4）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：BMM和颅骨前成细胞的典型形态（A，B）低放大倍率下的代表性图像。（C、 D）更高放大倍率的代表性图像。比例尺 = 400 μm （A， B）， 100 μm （C， D）。缩写：BMM =骨髓来源的巨噬细胞;preOBs = 前成骨细胞。请点击此处查看此图的大图。
图3：颅内胎前成形体和BMM中的底物氧化速率。 （A）葡萄糖。（B）谷氨酰胺。（C） 油酸酯。计算假设每个底物分子完全氧化。缩写：BMM =骨髓来源的巨噬细胞;preOB = 前成骨细胞。 请点击此处查看此图的大图。
| 酶作用物 | 放射性 （X） | 比活度 （Y），毫微西/毫摩尔 | 稀释因子 （Z） |
| 葡萄糖 | 断续器1 | 300 | 4,125 |
| 谷氨酰胺 | 断续器2 | 200 | 1,000 |
| 油酸盐 | 断续器3 | 50 | 12.5 |
表1：数据分析中使用的参数。
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Discussion
该协议提供了一种易于使用的方法来确定主要能量基板的氧化速率。它是其他方案的更简单的替代方案，这些方案使用包含中央孔并盖有橡胶塞14，15，16的烧瓶。尽管这里的示例研究是用细胞培养进行的，但该方法可以很容易地适用于含有完整线粒体的组织外植体或组织匀浆，如前所述17。
该方案中要考虑的一些关键步骤涉及试剂的制备和用于 14CO2 捕获的管的设置。确保油酸酯与BSA的适当结合对于防止游离脂肪酸（FFA）损害细胞膜并允许细胞有效摄取以进行代谢至关重要。将BSA溶液孵育足够长的时间以完全溶解，只要在70°C下与BSA一起孵育即可导致不可逆凝固。
由于L-谷氨酰胺等底物的半衰期短，因此必须为每个实验装置制造新鲜的cMEMα。最后，滤纸应足够大，以牢固地装在盖子中，以避免错误的读数。滤纸意外落入反应液中将导致DPM值异常高，在进一步分析中应省略。可以设置四到五个复制井，以防潜在的污染。如果最终的DPM值太低，例如小于100，则增加放射性底物的量或孵育时间可能会有所帮助。
使用油酸酯作为脂肪酸氧化的替代底物有一些注意事项。油酸酯是最丰富的单不饱和长链脂肪酸，占循环和组织中所有脂肪酸的32%。然而，其它长链脂肪酸，如棕榈酸酯（28%）和亚油酸酯（14%），也是体内的主要底物18，19。因此，当其他物质也存在时，单独补充油酸酯的细胞培养基可能无法准确反映脂肪酸的氧化速率。在进行测定时，可以通过在培养基中加入其他脂肪酸来改善这种问题。
应该注意的是，细胞代谢高度依赖于环境，并且可以表现出很大的可塑性，这取决于基质的可用性和氧张力等因素。因此，在生理条件下评估 体外 结果非常重要。尽管如此，越来越清楚的是，细胞倾向于 在体外保持其代谢特征的至少某些方面，这可能是由于细胞特异性代谢编程和记忆。因此，像这样的简单 体外 方法，为深入了解细胞类型之间的代谢多样性以及疾病条件下潜在的失调提供了一个重要的工具。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH拨款R01 AR060456（FL）的部分支持。我们感谢Michael Robinson博士和Elizabeth Krizman（费城儿童医院）对闪烁计数器的慷慨帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
