Summary
Detta protokoll beskriver en lättanvänd metod för att undersöka substratoxidation genom att spåra 14CO2-produktion in vitro.
Abstract
Mitokondrier är värd för maskineriet för trikarboxylsyracykeln (TCA) och elektrontransportkedjan (ETC), som genererar adenosintrifosfat (ATP) för att upprätthålla energihomeostas. Glukos, fettsyror och aminosyror är de viktigaste energisubstraten som driver mitokondriell andning i de flesta somatiska celler. Bevis visar att olika celltyper kan ha en distinkt preferens för vissa substrat. Substratutnyttjandet av olika celler i skelettet har dock inte studerats i detalj. Dessutom, eftersom cellulär metabolism är anpassad till fysiologiska och patofysiologiska förändringar, kan direkta bedömningar av substratberoende i skelettceller ge viktiga insikter i patogenesen av bensjukdomar.
Följande protokoll är baserat på principen om koldioxidfrisättning från substratmolekyler efter oxidativ fosforylering. Genom att använda substrat som innehåller radioaktivt märkta kolatomer (14C) ger metoden en känslig och lättanvänd analys för hastigheten för substratoxidation i cellodling. En fallstudie med primära kalvariska preosteoblaster kontra benmärgs-härledda makrofager (BMM) visar olika utnyttjande av huvudsubstraten mellan de två celltyperna.
Introduction
Oxidativ fosforylering (OXPHOS) i eukaryoter är den process genom vilken näringsämnen bryts ner inuti mitokondrier för att frigöra kemisk energi i form av ATP genom konsumtion av syre. Katabolism av olika substrat inuti mitokondrier genom trikarboxylsyracykeln (TCA) genererar få ATP-molekyler direkt, utan lagrar snarare energi genom reduktion av elektronbärarna nikotinamidadenindinukleotid (NAD +) och flavindeenindinukleotid (FAD +). De reducerade bärarna oxideras sedan av ETC som ligger på mitokondriernas inre membran för att generera en protonkoncentrationsgradient över membranet. Protonerna strömmar så småningom ner i sin gradient tillbaka till mitokondriell matris genom ATP-syntas för att producera ATP. OXPHOS är det mest effektiva sättet att producera ATP från energisubstrat och föredras i allmänhet i aeroba miljöer. Tidigare ansågs aerob glykolysproduktion av laktat från glukos medan syre är närvarande vara patofysiologisk, ofta ett kännetecken för cancerceller. Mer och mer upptäcks att vissa normala celltyper använder aerob glykolys av skäl som ännu inte har dechiffrerats helt.
Metabolisk flexibilitet är förmågan för celler eller organismer att anpassa sig till förändrade energibehov och tillgängliga bränslekällor. Till exempel tillgodoses den energiska efterfrågan på skelettmuskeln huvudsakligen av OXPHOS vid steady state men genom anaerob glykolys under högintensiv träning1. När träningstiden ökar bidrar glukos- och fettsyraoxidation mer till den totala energiproduktionen2. Användningen av substrat är emellertid inte enbart beroende av tillgänglighet, eftersom substrat antagonistiskt konkurrerar under oxidation. Framför allt har fettsyraoxidation visat sig hämma glukosutnyttjandet av skelettmuskeln i ett fenomen som kallas Randle-effekten3. En ömsesidig effekt visades genom efterföljande studier 4,5. Dessutom är många sjukdomar förknippade med en förändring i substratpreferens och utvecklingen av metabolisk inflexibilitet i celler. Till exempel reduceras fettsyraoxidationen i skelettmuskeln hos patienter med typ II-diabetes jämfört med normala kontrollpersoner6. De metaboliska förändringarna i sjukdomsinställningar är föremål för intensiv undersökning eftersom de kan bidra till patogenes.
Energimetabolismen i skelettcellstyper är relativt understuderad men har fått uppmärksamhet de senaste åren7. Tidigare arbete har visat att aerob glykolys är den dominerande energivägen i kalvariska osteoblaster, medan glukosoxidation genom TCA-cykeln spelar en roll vid osteoklastbildning 8,9. Andra har gett bevis för fettsyror som en energikälla för osteoblaster10. Glutaminkatabolism har också visat sig stödja osteoblastdifferentiering från förfäderna11,12. En övergripande förståelse för substratutnyttjande av olika skelettcelltyper saknas emellertid fortfarande. Dessutom förväntas förändringar i cellulär metabolism under celldifferentiering eller som svar på patologiska signaler förändra bränslesubstratutnyttjandet. Nedan beskrivs ett lättanvänt protokoll för analys av substratoxidation in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av radioaktiva ämnen (RAM) kräver förhandsgodkännande av en utsedd säkerhetskommitté vid varje institution. RAM-minnen som används i detta protokoll har godkänts av Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) vid University of Pennsylvania. Användningen av djur kräver förhandsgodkännande av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid heminstitutionen. Följande studie godkändes av IACUC vid The Children's Hospital of Philadelphia.
1. Beredning av stamlösningar för 14C-märkta substrat
- Gör 4 mM bovint serumalbumin (BSA) stamlösning genom att blanda 11 g BSA och 33,1 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) och skaka den försiktigt vid rumstemperatur i ~ 3 timmar tills BSA är helt upplöst. Värm BSA-stamlösningen i ett 70 °C vattenbad före användning.
- Lufttorka 50 μCi 14C-oleat (50 μCi/μmol i etanol) i flaskan med locket av i 8 timmar i en utsedd RAM-arbetshuv. Tillsätt 312,5 μLH2Ooch sedan 3,5 mg (11,5 μmol) natriumoleat. Blanda noggrant.
- Värm den resulterande lösningen till 70 ° C i ett vattenbad. Tillsätt 0,9375 ml av den förvärmda BSA-stamlösningen för att ge 10 mM varm oleatsallösning (innehållande ett förhållande på 1:11,5 mellan 14C-oleat och omärkt oleat). Alicitera stamlösningen och förvara den vid -20 °C för långvarig användning.
- Använd 14C-glukos och 14C-glutamin direkt efter upptining.
2. Beredning av medium innehållande 14C-märkta substrat
OBS: För att säkerställa tillförlitliga koncentrationer av energisubstrat i mediet måste skräddarsydda medier användas med färska substrat tillsatta strax före användning. Här används ett skräddarsytt Minimum Essential Medium (MEMα) utan glukos, pyruvat, glutamin, fenolrött eller natriumbikarbonat. Ett optimalt medium bör emellertid bestämmas för varje celltyp.
- Rekonstituera 8,67 g av mediumpulvret i 1 liter renat vatten. Tillsätt 2,2 g natriumbikarbonat för att uppnå ett pH på 7,4 och filtrera lösningen med 0,22 μm vakuumfiltrering.
- Tillsätt färska ingredienser för att erhålla det kompletta mediet (cMEMα) med slutliga koncentrationer av 5,5 mM glukos, 2 mM glutamin, 1 mM pyruvat och 10% fetalt bovint serum (FBS). Ytterligare komplettera cMEMα med 100 mM L-karnitin och 10 μM HEPES för att underlätta fettsyraoxidation.
- Omedelbart före användning, tillsätt 14C-märkta substrat till nyberedd cMEMα för att göra heta medier. För att göra oleatet varmt medium, tillsätt 10 mM varm oleatsallösning till cMEMα för en slutlig koncentration av 100 μM oleat (1:100 utspädning, slutlig radioaktivitet 0,4 μCi/ml).
OBS: Det 10 mM heta oleatlagret som innehåller ett förhållande på 1:11,5 varmt:kallt oleat (se steg 1.3) används för att uppnå en fysiologisk nivå på 100 μM totalt oleat i mediet samtidigt som mängden radioaktivt material minimeras. - Gör 10 mM omärkt oleatbuljong genom att tillsätta 24,36 mg natriumoleat till 2 mlH2Oi ett vattenbad vid 70 °C i ~20 min tills det är helt upplöst innan du snabbt blandas med 6 ml av 4 mM BSA-stamlösningen som är förvärmd till 70 °C. Överför till ett 37 ° C vattenbad i 1 timme och filtrera genom ett 0,22 μm filter. Alikvot och förvara vid -20 °C för långvarig användning.
- För att göra glukos hett medium, tillsätt 14C-glukos till en slutlig koncentration av 1,333 μM (1:4,125 utspädning, slutlig radioaktivitet 0,4 μCi / ml). För att göra glutamin varmt medium, tillsätt 14C-glutamin till den slutliga koncentrationen av 2 μM (1: 1000 utspädning, slutlig radioaktivitet 0,4 μCi / ml).
- Komplettera det heta mediet glukos och glutamin med en 10 mM stamlösning av omärkt oleat från steg 2.4 för att uppnå den slutliga koncentrationen av 100 μM oleat, samma som i det oleat heta mediet.
3. Beredning av celler
OBS: Calvariala preosteoblaster och benmärgsmakrofager används som exempel här. Användare bör förbereda sin celltyp enligt lämpliga protokoll. Optimera koncentrationen av kollagenas II som ska användas för matsmältning i pilotexperiment eftersom den enzymatiska aktiviteten kan variera mellan olika partier.
- Isolering och odling av kalvariska preosteoblaster
- Offra valpar efter dag 3-5 (P3-5) genom halshuggning och överför dem till iskall DPBS innehållande Penicillin-Streptomycin (P/S).
- Exponera calvaria genom att ta bort huden och mjukvävnaden. Samla mittregionen genom att skära bort de omgivande vävnaderna från rygg till framsida i DPBS (Figur 1A). Skrapa de inre och yttre ytorna på calvaria försiktigt med pincett för att hjälpa till att frigöra cellerna vid efterföljande matsmältning.
- Förbered en 2 mg/ml och en 4 mg/ml lösning av kollagenas typ II i DPBS och filtrera varje lösning med ett nytt 0,22 μm filter. Smält den rengjorda kalvarian först med 2 mg / ml kollagenaslösning i 15 minuter och kassera matsmältningslösningen. Smält de rengjorda proverna i 4 mg / ml kollagenaslösning 3 gånger i 15 minuter varje gång, poola och spara matsmältningslösningen.
- Filtrera matsmältningslösningen genom 70 μm cellsilar och centrifugera filtratet vid 300 × g i 5 min. Återsuspendera cellpelleten i cMEMα (se steg 2.2) innehållande 10 % FBS och P/S.
- Räkna och frö cellerna vid 4 × 104 celler /cm2 i 10 cm plattor. Odla cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 3 dagar.
- Dissociera cellerna vid 37 ° C med 0,25% trypsin-EDTA. Räkna och frö cellerna i 24-brunns cellodlingsplattor med cMEMα innehållande 10% FBS och P/S vid 7,5 × 105/cm2. Frö minst 4 brunnar per celltyp per substrat och minst tre extra brunnar för varje celltyp för cellräkning före analysen.
- Odla cellerna vid 37 °C över natten före substratoxidationsanalyserna.
- Isolering och kultur av BMM
OBS: Odling av BMM kräver makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF), som kan köpas kommersiellt som ett rekombinant protein. Konditionerat medium från cellinjen CMG14-12 konstruerad för att uttrycka M-CSF är ett ekonomiskt alternativ som används här13.- Samla lårben och tibias från 8 veckor gamla möss efter att ha tagit bort muskeln och bindväven. Klipp och kassera båda ändarna av benen med vass sax.
- Spola ut benmärgen från ett lårben och ett skenben i en 10 cm petriskål med en spruta försedd med en 23 G nål innehållande 15 ml cMEMα med 10% FBS, P/S och 10% CMG14-12 konditionerat medium (BMM medium). Odla cellerna i petriskålen i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Efter 3 dagar, kassera odlingsmediet och skölj med DPBS. Dissociera de bifogade cellerna vid 37 ° C med 0,25% trypsin-EDTA i 5 minuter. Centrifugera och återsuspendera cellpelleten i BMM-mediet.
- Räkna och frö cellerna i 24-brunns cellodlingsplattor vid 7,5 × 105/cm2 på samma sätt som beskrivs i 3.1.6. Odling vid 37 °C över natten i BMM-mediet innan analyserna påbörjas.
4. Substratoxidationsanalys medCO2-fälla
OBS: En lämplig sådddensitet bör bestämmas för varje celltyp för att uppnå 80-90% sammanflöde innan analysen påbörjas. Observera att celldensiteten kan påverka cellernas metaboliska tillstånd.
- Tvätta cellerna i de extra brunnarna två gånger med DPBS. Dissociera cellerna med 0,25% trypsin-EDTA och blandade 20 μL-celler som återanvänds i DPBS med 20 μL akridinapelsin / propidiumjodid (AO / PI) färdig att använda kommersiell färglösning. Bestäm antalet levande celler med en automatiserad cellräknare och registrera numret för slutliga beräkningar.
- Tvätta cellerna i analysbrunnarna två gånger med DPBS. Tillsätt 500 μL varmt medium till varje analysbrunn i den RAM-utsedda vävnadsodlingshuven. Försegla plattorna med parafilm och inkubera cellerna i en RAM-utsedd inkubator vid 37 ° C i 4 timmar.
- Skär filterpapper i cirkulära bitar som är något större än området inuti locket på 1,5 ml mikrocentrifugrör under inkubationen och sätt in papperet tätt i locket (Figur 1B). Tillsätt 200 μL 1 M perklorsyra till varje rör och 20 μL natriumhydroxid till filterpapperet monterat inuti locket.
- Efter inkubation av cellerna, överför 400 μL odlingsmedium från varje brunn till de beredda rören och stäng locken omedelbart. Lämna rören i ett rörställ vid rumstemperatur i 1 timme.
- Under inkubation, sätt upp en scintillationsflaska för varje rör och fyll den med 4 ml scintillationsvätska. Överför varje bit filterpapper till en scintillationsflaska och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Utför torkningstester på vävnadsodlingshuven, vattenbadet (används för 14C-oleatberedning), kylskåp, inkubator, diskbänk, mark och något annat arbetsområde för potentiell RAM-förorening. Lägg pappersservetterna i scintillationsflaskor som innehåller scintillationsvätska.
- Mät 14C radioaktivitet i scintillationsflaskorna med en scintillationsräknare. Spela in läsresultaten. Dekontaminera arbetsmiljön vid behov enligt strålsäkerhetsanvisningarna.
5. Analys av data
OBS: Förutsatt att varje substrat oxideras fullständigt för att frigöra CO2, kan substratoxidationshastigheten beräknas från den fångade CO2-radioaktiviteten .
- Beräkna substratets oxidationshastighet med hjälp av Eq (1) och X-, Y- och Z-värdena som anges i tabell 1 för olika substrat.
Substratoxidationshastighet (μmol/cell/h) =
(1)- Beräkna de totala sönderfallen per min (DPM) för varje reaktionsbrunn. För X, använd DPM-värdet (scintillationsräknaravläsning) från 0,4 ml av reaktionsmediet som används förCO2-fångst av 0,5 ml av det totala reaktionsmediet. Därför är den totala DPM från varje reaktionsbrunn X × 1,25.
- Dela den totala DPM med en faktor på 2 220 000 för att konvertera till μCi.
- Konvertera radioaktiviteten i μCi till antalet 14C-märkta molekyler. Dela μCi-värdet med den specifika aktiviteten (Y) för varje märkt substrat. Använd följande Y-värden (tabell 1): 14C-glukos: 300 mCi/mmol; 14 C-glutamin: 200 mCi/mmol; 14 C-oleat: 50 mCi/mmol.
- Beräkna det totala antalet oxiderade molekyler från de oxiderade 14C-märkta molekylerna genom att multiplicera den senare med den heta till totala utspädningsfaktorn (Z). Använd följande Z-värden (tabell 1): Glukos: 4 125; glutamin: 1 000; oleat: 12,5.
- Dela den resulterande produkten med cellnummer (cell #) och 4 (för reaktionstiden på 4 timmar) för att bestämma substratoxidationshastigheten per cell. Använd cellen# bestämd i parallellbrunnarna i början av analysen.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta exempel användsCO2-fångstmetoden för att jämföra substratoxidation med primära kalvariska preosteoblaster jämfört med BMM, som ofta används för in vitro osteoblast respektive osteoklastdifferentiering. Efter att de primära cellerna har passages och odlats i cMEMα över natten når de vanligtvis 80-90% av sammanflödet och uppvisar sin karakteristiska morfologi. De kalvariska preosteoblasterna är märkbart större än BBMM (figur 2). Varje celltyp utsätts för oxidationsanalyser för glukos, glutamin och oleat genom att följa stegen 4.1 till 4.7. Resultaten analyseras med hjälp av Eq (1).
Resultaten visar att oxidationshastigheten för varje substrat är signifikant högre i kalvariska preosteoblaster än BMM, vilket sannolikt indikerar större energiproduktion av OXPHOS i preosteoblasterna (Figur 3). Tidigare studier med Seahorse-teknik har visat att OXPHOS står för ~60% av ATP-produktionen i preosteoblaster men markant minskar i mogna osteoblaster, där aerob glykolys står för ~80% av energin9. De aktuella resultaten visar att alla tre huvudsubstraten bidrar till OXFOS i preosteoblaster. Ytterligare undersökning är emellertid nödvändig för att avgöra om utnyttjandet av ett eller alla substrat reduceras i de mogna osteoblasterna.
Figur 1: Diagram förCO2-fångstanalys och calvariadissektion. (A) Den mellersta delen av calvaria, som indikeras av den orange streckade triangeln, skördas för cellsolason. (B) 1,5 ml mikrocentrifugrör används förCO2-fångst (steg 1). Filterpapper (blått papper för illustrationsändamål) skärs för att passa in i rörlock (steg 2). Tillsätt 200 μL 1 M perklorsyra till 400 μL heta medier från cellkulturen i varje rör och 20 μL NaOH till filterpapperet (steg 3) innan du stänger locket (steg 4). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Typisk morfologi hos BMM och calvariala preosteoblaster. (A, B) Representativa bilder vid lägre förstoring. (C, D) Representativa bilder vid högre förstoring. Skalstänger = 400 μm (A, B), 100 μm (C, D). Förkortningar: BMM = benmärgs-härledda makrofager; preOB = preosteoblaster. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Substratoxidationshastigheter i kalvariska preosteoblaster och BBMM. (A) Glukos. B) Glutamin. (C) Oleat. Beräkningarna förutsätter att varje substratmolekyl oxideras fullständigt. Förkortningar: BMM = benmärgs-härledd makrofag; preOB = preosteoblast. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Substrat | Radioaktivitet (X) | Specifik aktivitet (Y), mCi/mmol | Utspädningsfaktor (Z) |
| Glukos | DPM1 | 300 | 4,125 |
| Glutamin | DPM2 | 200 | 1,000 |
| Oleat | DPM3 | 50 | 12.5 |
Tabell 1: Parametrar som används vid dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet ger en lättanvänd metod för att bestämma oxidationshastigheten för stora energisubstrat. Det är ett enklare alternativ till andra protokoll som använder kolvar som innehåller en central brunn och täckta med gummiproppar 14,15,16. Även om exempelstudien här utförs med cellodling kan metoden enkelt anpassas för vävnadsexplanter eller vävnadshomogenater som innehåller intakta mitokondrier, som tidigare beskrivits17.
Några viktiga steg att överväga i detta protokoll involverar framställning av reagenserna och upprättandet av rören för 14CO2-fångst . Att säkerställa lämplig konjugering av oleat till BSA är avgörande för att förhindra att fria fettsyror (FFA) skadar cellmembranen och för att möjliggöra effektivt upptag av cellen för metabolism. Inkubera BSA-lösningen tillräckligt länge för fullständig upplösning, eftersom långa inkubationer med BSA vid 70 ° C leder till irreversibel stelning.
Färsk cMEMα måste göras för varje experimentell installation på grund av de korta halveringstiderna för substrat såsom L-glutamin. Slutligen bör filterpapperet vara tillräckligt stort för att passa säkert i locket för att undvika felaktiga avläsningar. Ett oavsiktligt fall av filterpapperet i reaktionsvätskan kommer att leda till onormalt höga DPM-värden, vilket bör utelämnas från ytterligare analys. Fyra till fem replikerade brunnar kan ställas in vid potentiell förorening. Om de slutliga DPM-värdena är för låga, till exempel mindre än 100, kan det vara till hjälp att öka mängden radioaktivt substrat eller inkubationstiden.
Det finns försiktighetsåtgärder för att använda oleat som surrogatsubstrat för fettsyraoxidation. Oleat är den vanligaste enkelomättade, långkedjiga fettsyran som utgör 32% av alla fettsyror i omlopp och vävnader. Andra långkedjiga fettsyror, såsom palmitat (28%) och linoleat (14%), är emellertid också viktiga substrat in vivo 18,19. Därför kan tillskott av cellodlingsmediet med enbart oleat inte korrekt återspegla oxidationshastigheten för fettsyror när andra arter också är närvarande. När analysen utförs kan denna oro förbättras genom att inkludera de andra fettsyrorna i odlingsmediet.
Det bör noteras att cellmetabolism är mycket kontextberoende och kan uppvisa stor plasticitet beroende på substrattillgänglighet och syrespänning, bland andra faktorer. Det är därför viktigt att utvärdera in vitro-resultat i samband med fysiologiska förhållanden. Ändå är det allt tydligare att celler tenderar att behålla åtminstone vissa aspekter av deras metaboliska egenskaper in vitro, troligen på grund av den cellspecifika metaboliska programmeringen och minnet. Således erbjuder enkla in vitro-metoder , som den här, ett viktigt verktyg för att få insikt i inte bara den metaboliska mångfalden bland celltyper utan också potentiell dysregulering vid sjukdomstillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Arbetet stöddes delvis av NIH-anslaget R01 AR060456 (FL). Vi tackar Dr. Michael Robinson och Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) för deras generösa hjälp med scintillationsdisken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
