Forberedelse og karakterisering af grafenbaseret 3D biohybrid hydrogel bioink til perifer neuroengineering

Summary

I dette manuskript demonstrerer vi fremstillingen af en biohybrid hydrogel bioink indeholdende grafen til brug i perifert vævsteknik. Ved hjælp af dette 3D-biohybridmateriale udføres stamcellernes neurale differentieringsprotokol. Dette kan være et vigtigt skridt i at bringe lignende biomaterialer til klinikken.

Abstract

Perifere neuropatier kan forekomme som følge af aksonal skade og lejlighedsvis på grund af demyeliniserende sygdomme. Perifere nerveskader er et globalt problem, der forekommer hos 1,5% -5% af akutte patienter og kan føre til betydelige tab af arbejdspladser. I dag er vævsteknologibaserede tilgange, der består af stilladser, passende cellelinjer og biosignaler, blevet mere anvendelige med udviklingen af tredimensionelle (3D) bioprintteknologier. Kombinationen af forskellige hydrogelbiomaterialer med stamceller, exosomer eller biosignalmolekyler undersøges ofte for at overvinde de eksisterende problemer i perifer nerveregenerering. Følgelig har produktionen af injicerbare systemer, såsom hydrogeler eller implanterbare rørstrukturer dannet ved forskellige bioprintmetoder, fået betydning inden for perifer neuroteknik. Under normale forhold er stamceller kroppens regenerative celler, og deres antal og funktioner falder ikke med tiden for at beskytte deres befolkninger; Disse er ikke specialiserede celler, men kan differentiere ved passende stimulering som reaktion på skade. Stamcellesystemet er under påvirkning af dets mikromiljø, kaldet stamcelleniche. Ved perifere nerveskader, især i neurotmesis, kan dette mikromiljø ikke reddes fuldt ud, selv efter kirurgisk binding af afskårne nerveender sammen. Den sammensatte biomaterialer og kombinerede cellulære terapier tilgang øger funktionaliteten og anvendeligheden af materialer med hensyn til forskellige egenskaber såsom bionedbrydelighed, biokompatibilitet og bearbejdelighed. Derfor har denne undersøgelse til formål at demonstrere forberedelsen og anvendelsen af grafenbaseret biohybrid hydrogelmønster og at undersøge differentieringseffektiviteten af stamceller i nerveceller, som kan være en effektiv løsning i nerveregenerering.

Introduction

Nervesystemet, som er den mekanisme, der bygger bro over organismens og miljøets indre struktur, er opdelt i to dele: det centrale og perifere nervesystem. Perifere nerveskader er et globalt problem, der udgør 1,5% -5% af de patienter, der præsenterer for akutafdelingen og udvikler sig på grund af forskellige traumer, hvilket fører til betydeligt tab af job ^1,2,3.

I dag er cellulære tilgange til perifer neuroteknik af stor interesse. Stamceller kommer først blandt de celler, der anvendes i disse tilgange. Under normale forhold er stamceller kroppens regenerative celler, og deres antal og funktioner falder ikke med tiden for at beskytte deres befolkninger; Disse celler er specialiserede, men kan differentiere sig ved passende stimulering som reaktion på skade ^4,5. Ifølge stamcellehypotesen er stamcellesystemet under påvirkning af dets mikromiljø, kaldet stamcelleniche. Konservering og differentiering af stamceller er umulig uden tilstedeværelsen af deres mikromiljø⁶, som kan rekonstitueres via vævsteknik ved hjælp af celler og stilladser⁷. Vævsteknik er et tværfagligt felt, der omfatter både tekniske og biologiske principper. Vævsteknik giver værktøjer til oprettelse af kunstigt væv, der kan erstatte levende væv og kan bruges til regenerering af disse væv ved at fjerne det beskadigede væv og tilvejebringe funktionelle væv⁸. Vævsstilladser, en af de tre hjørnesten i vævsteknik, fremstilles ved hjælp af forskellige metoder fra naturlige og syntetiske materialer⁹. Tredimensionel (3D) udskrivning er en ny additiv fremstillingsteknologi, der i vid udstrækning bruges til at erstatte eller genoprette defekte væv via sin enkle, men alsidige produktion af komplekse former ved hjælp af forskellige metoder. Bioprinting er en additiv fremstillingsmetode, der muliggør sameksistens mellem celler og biomaterialer, kaldet bioinks¹⁰. I betragtning af interaktionen mellem nerveceller med hinanden er undersøgelser skiftet til ledende biomaterialekandidater såsom grafen. Grafennanoplader, der har egenskaber som fleksibel elektronik, superkondensatorer, batterier, optik, elektrokemiske sensorer og energilagring, er et foretrukket biomateriale inden for vævsteknik¹¹. Grafen er blevet anvendt i undersøgelser, hvor spredning og regenerering af beskadigede væv og organer blev udført^12,13.

Vævsteknik består af tre grundlæggende byggesten: stillads, celler og biosignalmolekyler. Der er mangler i undersøgelserne af perifere nerveskader med hensyn til at tilvejebringe disse tre strukturer fuldstændigt. Der er opstået forskellige problemer i de biomaterialer, der produceres og anvendes i undersøgelserne, såsom dem, der kun indeholder stamceller eller biosignalmolekyler, manglen på et bioaktivt molekyle, der muliggør stamcelledifferentiering, manglen på biokompatibilitet af det anvendte biomateriale og den lave effekt på spredning af celler i vævsnichen, og dermed nerveledning ikke fuldt ud realiseret 2,13,14,15,16. Dette kræver optimering af nerveregenerering, reduktion af muskelatrofi ^17,18 og skabelse af nødvendig homing¹⁹ med vækstfaktorer mod sådanne problemer. På dette tidspunkt er karakteriseringen og analysen af neuroaktiviteten af en kirurgisk biomateriale prototype, der skal overføres til klinikken, meget vigtig.

Derfor undersøger denne metodeundersøgelse bioinkhydrogelmønsteret med grafennanoplader dannet af en 3D-bioprinter og dens effektivitet på den neurogene differentiering af stamcellerne, den indeholder. Også virkningerne af grafen på neurosfæredannelse og differentiering undersøges.

Protocol

1. Dyrkning af Whartons gelé mesenkymale stamceller Tag Whartons gelé mesenkymale stamceller (WJ-MSC’er, fra ATCC) ud af en -80 ° C fryser. Dyrkning af WJ-MSC’er i DMEM-F12-medium indeholdende 10% føtalt kalveserum (FBS), 1% Pen-Strep og 1% L-glutamin i et sterilt laminært flow ved stuetemperatur, som beskrevet i Yurie et al.20. Kryopræserver nogle af cellerne ved 1 x 106 celler/ml med frysemedium indeholdende 35 % FBS, 55 % DMEMF-12 og 10 % di…

Representative Results

Grafentoksicitet og 2D-billeddannelseStatistisk analyse af de opnåede MTT-resultater blev udført med en envejs ANOVA med Tukeys test i statistisk analysesoftware, og den opnåede graf er vist i figur 2. Grafenprocenten sammenlignet med kontrol viste kun et signifikant fald for grafenkoncentrationen på 0,001% (**p 0,05). Derfor blev den optimale grafenkoncentration bestemt til at v…

Discussion

Fordelene ved behandlinger anvendt med konstruerede 3D-stilladser i forhold til konventionelle 2D-metoder bliver mere og mere mærkbare hver dag. Stamceller, der anvendes alene i disse terapier eller sammen med stilladser fremstillet af forskellige biomaterialer med lav biokompatibilitet og bionedbrydelighed, er normalt utilstrækkelige til perifer nerveregenerering. Whartons gelé mesenkymale stamceller (WJ-MSC’er) synes at være en passende kandidatcellelinje, især i betragtning af optimeringen af protokollerne til er…

Materials

Centrifugal	Hitachi		Used in cell culture and biomaterial step
0.1N CaCl2	HD Bioink		Used for crosslinker
0.22 µm membrane filter	Aιsιmo		Used for sterilization
0.45 µm syringe filter	Aιsιmo		Used for sterilization
1.5mL conic tube	Eppendorfa		Used for bioink drop
15mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
3D Bioprinting	Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey)		Bioprinting Step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit	Santa Cruz Biotechnology	J1514	Seconder antibody, used for dye
Anti mouse IgG-SC2781-goat	Santa Cruz Biotechnology	C3109	Seconder antibody, used for dye
Au coating device EM ACE600	Leica		for gold plating of biomaterial section before SEM imaging
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Cell Cultre Cabine	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM	Quanta	FEG 450	for SEM
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80°C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	We were used to store cells and the resulting exosomes
Gelatine-Alginate bioink powder	HD Bioink		Used for produced bioink step
GFP labelled-WJ-MSCs	Virostem		Used for imaging to cell-bioink interaction
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2)	Grafen Chemical Industries Co.		Used for production 3D-G bioink
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin)	Cell Signalling and Santa Cruz		Used for dye
JASCO 6600	Tetra		for FTIR
MTT Assay	Sigma		Viability testing
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Thoma slide	Isolab		Used for counting the cell
Time-Lapse Imaging System	Zeiss Axio.Observer.Z1		Imaging
Tripsin-EDTA	Multicell		The flask was used to remove the cells covering the surface.
Vorteks	Biobase		For produced bioink step
WJ-MSCs	ATCC		Used for the cell culture process