Preparación y caracterización de biotinta de hidrogel biohíbrida 3D basada en grafeno para neuroingeniería periférica

Summary

En este manuscrito, demostramos la preparación de una biotinta de hidrogel biohíbrida que contiene grafeno para su uso en ingeniería de tejidos periféricos. Utilizando este material biohíbrido 3D, se realiza el protocolo de diferenciación neural de las células madre. Este puede ser un paso importante para traer biomateriales similares a la clínica.

Abstract

Las neuropatías periféricas pueden ocurrir como resultado del daño axonal, y ocasionalmente debido a enfermedades desmielinizantes. El daño a los nervios periféricos es un problema global que ocurre en el 1.5% -5% de los pacientes de emergencia y puede conducir a pérdidas significativas de empleos. Hoy en día, los enfoques basados en la ingeniería de tejidos, que consisten en andamios, líneas celulares apropiadas y bioseñales, se han vuelto más aplicables con el desarrollo de tecnologías de bioimpresión tridimensional (3D). La combinación de varios biomateriales de hidrogel con células madre, exosomas o moléculas de bioseñalización se estudia con frecuencia para superar los problemas existentes en la regeneración de nervios periféricos. En consecuencia, la producción de sistemas inyectables, como hidrogeles, o estructuras de conductos implantables formados por diversos métodos de bioimpresión ha ganado importancia en la neuroingeniería periférica. En condiciones normales, las células madre son las células regenerativas del cuerpo, y su número y funciones no disminuyen con el tiempo para proteger a sus poblaciones; Estas no son células especializadas, pero pueden diferenciarse con la estimulación adecuada en respuesta a una lesión. El sistema de células madre está bajo la influencia de su microambiente, llamado nicho de células madre. En las lesiones de los nervios periféricos, especialmente en la neurotmesis, este microambiente no se puede rescatar por completo incluso después de unir quirúrgicamente las terminaciones nerviosas cortadas. El enfoque de biomateriales compuestos y terapias celulares combinadas aumenta la funcionalidad y aplicabilidad de los materiales en términos de diversas propiedades, como la biodegradabilidad, la biocompatibilidad y la procesabilidad. En consecuencia, este estudio tiene como objetivo demostrar la preparación y el uso de patrones de hidrogel biohíbridos basados en grafeno y examinar la eficiencia de diferenciación de las células madre en células nerviosas, que pueden ser una solución efectiva en la regeneración nerviosa.

Introduction

El sistema nervioso, que es el mecanismo que une la estructura interna del organismo y el medio ambiente, se divide en dos partes: el sistema nervioso central y periférico. El daño a los nervios periféricos es un problema global que constituye el 1,5%-5% de los pacientes que acuden al servicio de urgencias y se desarrolla debido a diversos traumatismos, lo que lleva a una pérdida significativa del empleo ^1,2,3.

Hoy en día, los enfoques celulares de la neuroingeniería periférica son de gran interés. Las células madre ocupan el primer lugar entre las células utilizadas en estos enfoques. En condiciones normales, las células madre son las células regenerativas del cuerpo, y su número y funciones no disminuyen con el tiempo para proteger a sus poblaciones; Estas células son especializadas, pero pueden diferenciarse con la estimulación adecuada en respuesta a la lesión ^4,5. Según la hipótesis de las células madre, el sistema de células madre está bajo la influencia de su microambiente, llamado nicho de células madre. La preservación y diferenciación de las células madre es imposible sin la presencia de su microambiente⁶, que puede ser reconstituido a través de la ingeniería tisular utilizando células y andamios⁷. La ingeniería de tejidos es un campo multidisciplinario que incluye principios de ingeniería y biología. La ingeniería de tejidos proporciona herramientas para la creación de tejidos artificiales que pueden reemplazar los tejidos vivos y pueden ser utilizados en la regeneración de estos tejidos mediante la eliminación de los tejidos dañados y la provisión de tejidos funcionales⁸. Los andamios de tejidos, una de las tres piedras angulares de la ingeniería de tejidos, se producen utilizando métodos diferentes de materiales naturales y sintéticos⁹. La impresión tridimensional (3D) es una tecnología emergente de fabricación aditiva que se utiliza ampliamente para reemplazar o restaurar tejidos defectuosos a través de su producción simple pero versátil de formas complejas utilizando varios métodos. La bioimpresión es un método de fabricación aditiva que permite la coexistencia de células y biomateriales, llamados biotintas¹⁰. Teniendo en cuenta la interacción de las células nerviosas entre sí, los estudios se han desplazado a candidatos a biomateriales conductores como el grafeno. Las nanoplacas de grafeno, que tienen propiedades tales como electrónica flexible, supercondensadores, baterías, óptica, sensores electroquímicos y almacenamiento de energía, son un biomaterial preferido en el campo de la ingeniería de tejidos¹¹. El grafeno ha sido utilizado en estudios donde se realizó la proliferación y regeneración de tejidos y órganos dañados^12,13.

La ingeniería de tejidos consta de tres bloques de construcción básicos: andamio, células y moléculas de bioseñal. Existen deficiencias en los estudios sobre el daño a los nervios periféricos en términos de proporcionar estas tres estructuras por completo. Se han encontrado varios problemas en los biomateriales producidos y utilizados en los estudios, como que contienen solo células madre o moléculas de bioseñal, la falta de una molécula bioactiva que permita la diferenciación de células madre, la falta de biocompatibilidad del biomaterial utilizado y el bajo efecto sobre la proliferación de células en el nicho tisular. y, por lo tanto, la conducción nerviosa no se realiza completamente 2,13,14,15,16. Esto requiere la optimización de la regeneración nerviosa, reduciendo la atrofia muscular^17,18, y creando el homing necesario ¹⁹ con factores de crecimiento contra tales problemas. En este punto, la caracterización y el análisis de la neuroactividad de un prototipo de biomaterial quirúrgico, para ser transferido a la clínica, son muy importantes.

En consecuencia, este estudio de métodos investiga el patrón de hidrogel de biotinta con nanoplacas de grafeno formadas por una bioimpresora 3D y su efectividad en la diferenciación neurogénica de las células madre que contiene. Además, se investigan los efectos del grafeno en la formación y diferenciación de la neuroesfera.

Protocol

1. Cultivo de células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton Tome las células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton (WJ-MSC, de ATCC) de un congelador de -80 °C. Cultivo de WJ-MSCs en medio DMEM-F12 que contiene 10% de suero fetal de ternera (FBS), 1% de Pen-Strep y 1% de L-glutamina en un flujo laminar estéril a temperatura ambiente, como se describe en Yurie et al.20. Criopreservar algunas de las células a 1 x 106 células/ml con medi…

Representative Results

Toxicidad del grafeno e imágenes 2DEl análisis estadístico de los resultados MTT obtenidos se realizó con un ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey en software de análisis estadístico, y el gráfico obtenido se muestra en la Figura 2. El porcentaje de grafeno en comparación con el control mostró una disminución significativa solo para la concentración de grafeno al 0,001% (**p < 0,01). No hubo diferencias significativas entre los otros grupos y el control …

Discussion

Las ventajas de los tratamientos aplicados con andamios 3D diseñados sobre los métodos 2D convencionales son cada vez más notables cada día. Las células madre utilizadas solas en estas terapias o junto con andamios producidos a partir de diversos biomateriales con baja biocompatibilidad y biodegradabilidad suelen ser inadecuadas en la regeneración de los nervios periféricos. Las células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton (WJ-MSCs) parecen ser una línea celular candidata adecuada, especialmente consideran…

Materials

Centrifugal	Hitachi		Used in cell culture and biomaterial step
0.1N CaCl2	HD Bioink		Used for crosslinker
0.22 µm membrane filter	Aιsιmo		Used for sterilization
0.45 µm syringe filter	Aιsιmo		Used for sterilization
1.5mL conic tube	Eppendorfa		Used for bioink drop
15mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
3D Bioprinting	Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey)		Bioprinting Step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit	Santa Cruz Biotechnology	J1514	Seconder antibody, used for dye
Anti mouse IgG-SC2781-goat	Santa Cruz Biotechnology	C3109	Seconder antibody, used for dye
Au coating device EM ACE600	Leica		for gold plating of biomaterial section before SEM imaging
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Cell Cultre Cabine	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM	Quanta	FEG 450	for SEM
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80°C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	We were used to store cells and the resulting exosomes
Gelatine-Alginate bioink powder	HD Bioink		Used for produced bioink step
GFP labelled-WJ-MSCs	Virostem		Used for imaging to cell-bioink interaction
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2)	Grafen Chemical Industries Co.		Used for production 3D-G bioink
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin)	Cell Signalling and Santa Cruz		Used for dye
JASCO 6600	Tetra		for FTIR
MTT Assay	Sigma		Viability testing
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Thoma slide	Isolab		Used for counting the cell
Time-Lapse Imaging System	Zeiss Axio.Observer.Z1		Imaging
Tripsin-EDTA	Multicell		The flask was used to remove the cells covering the surface.
Vorteks	Biobase		For produced bioink step
WJ-MSCs	ATCC		Used for the cell culture process