Summary

末梢神経工学のためのグラフェンベースの3Dバイオハイブリッドヒドロゲルバイオインクの調製と特性評価

Published: May 16, 2022
doi:

Summary

この原稿では、末梢組織工学で使用するためのグラフェンを含むバイオハイブリッドヒドロゲルバイオインクの調製を示します。この3Dバイオハイブリッド材料を用いて、幹細胞の神経分化プロトコールを行う。これは、同様の生体材料を診療所に持ち込む上で重要なステップになる可能性があります。

Abstract

末梢神経障害は、軸索損傷の結果として、そして時には脱髄疾患のために起こり得る。末梢神経損傷は、救急患者の1.5%〜5%に発生する世界的な問題であり、重大な失業につながる可能性があります。今日、足場、適切な細胞株、およびバイオシグナルで構成される組織工学ベースのアプローチは、3次元(3D)バイオプリンティング技術の開発により適用可能になっています。末梢神経再生における既存の問題を克服するために、幹細胞、エクソソーム、またはバイオシグナル伝達分子と様々なヒドロゲル生体材料との組み合わせが頻繁に研究されています。したがって、ヒドロゲルなどの注射可能なシステム、または様々なバイオプリンティング法によって形成された埋め込み可能な導管構造の製造は、末梢神経工学において重要性を増している。通常の条件下では、幹細胞は体の再生細胞であり、それらの数と機能はそれらの集団を保護するために時間とともに減少しません。これらは特殊な細胞ではありませんが、損傷に応じて適切な刺激を受けると分化することができます。幹細胞システムは、幹細胞ニッチと呼ばれる微小環境の影響下にあります。末梢神経損傷、特に神経緊張症では、切断された神経終末を外科的に結合した後でも、この微小環境を完全に救助することはできません。複合生体材料と複合細胞療法のアプローチは、生分解性、生体適合性、加工性などのさまざまな特性の観点から、材料の機能と適用性を向上させます。そこで、本研究では、グラフェンベースのバイオハイブリッドハイドロゲルパターニングの調製と使用を実証し、神経再生に有効なソリューションとなる幹細胞の神経細胞への分化効率を調べることを目的としています。

Introduction

生物の内部構造と環境を橋渡しするメカニズムである神経系は、中枢神経系と末梢神経系の2つの部分に分けられます。末梢神経損傷は、救急科に来院し、さまざまな外傷のために発症する患者の1.5%〜5%を構成する世界的な問題であり、重大な失業につながります1,2,3

今日、末梢神経工学への細胞アプローチは非常に興味深いものです。幹細胞は、これらのアプローチで使用される細胞の中で最初に来ます。通常の条件下では、幹細胞は体の再生細胞であり、それらの数と機能はそれらの集団を保護するために時間とともに減少しません。これらの細胞は特殊化されていますが、損傷に応答して適切な刺激を受けると分化することができます4,5。幹細胞仮説によれば、幹細胞システムは幹細胞ニッチと呼ばれる微小環境の影響下にあります。幹細胞の保存と分化は、細胞と足場7を使用した組織工学によって再構成できる微小環境6の存在なしには不可能です。組織工学は、工学と生物学の両方の原則を含む学際的な分野です。組織工学は、生体組織を置き換えることができ、損傷した組織を除去し、機能的な組織を提供することによってこれらの組織の再生に使用できる人工組織を作成するためのツールを提供する8。組織工学の3つの基礎の1つである組織足場は、天然および合成材料とは異なる方法を使用して製造されます9。3次元(3D)印刷は、さまざまな方法を使用して複雑な形状をシンプルかつ用途の広い製造することにより、欠陥のある組織を交換または修復するために広く使用されている新しい積層造形技術です。バイオプリンティングは、バイオインク10と呼ばれる細胞と生体材料の共存を可能にする積層造形方法です。神経細胞同士の相互作用を考慮すると、研究はグラフェンなどの導電性生体材料候補に移行しています。フレキシブルエレクトロニクス、スーパーキャパシタ、電池、光学、電気化学センサー、エネルギー貯蔵などの特性を有する単層カーボンナノプレートは、組織工学の分野で好ましい生体材料である11。グラフェンは、損傷した組織や臓器の増殖と再生が行われた研究で使用されています12,13

組織工学は、足場、細胞、生体信号分子という3つの基本的な構成要素で構成されています。末梢神経損傷に関する研究には、これら3つの構造を完全に提供するという点で欠陥があります。幹細胞または生体シグナル分子のみを含む生体材料、幹細胞の分化を可能にする生理活性分子の欠如、使用される生体材料の生体適合性の欠如、および組織ニッチにおける細胞の増殖への影響の低さなど、研究で製造および使用される生体材料にはさまざまな問題がありました。 したがって、神経伝導は完全には実現されていません2,13,14,15,16。これには、神経再生の最適化、筋萎縮の減少17,18、およびそのような問題に対する成長因子を備えた必要なホーミング19の作成が必要です。この時点で、診療所に移される外科用生体材料プロトタイプの神経活動の特性評価と分析は非常に重要です。

したがって、この方法研究では、3Dバイオプリンターによって形成されたグラフェンナノプレートによるバイオインクヒドロゲルパターニングと、それに含まれる幹細胞の神経原性分化に対するその有効性を調査します。また、ニューロスフェアの形成と分化に対するグラフェンの影響も調査されています。

Protocol

1. ウォートンゼリー間葉系幹細胞の培養 ウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJ-MSC、ATCC製)を-80°Cの冷凍庫から取り出します。Yurie et al.20に記載されているように、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペンストレプト、および1%L-グルタミンを含むDMEM-F12培地でWJ-MSCを室温の滅菌層流で培養します。 一部の細胞を、35S、55%DMEMF-12、および10%ジメチルスルホキシド(DMSO…

Representative Results

グラフェン毒性と2Dイメージング得られたMTT結果の統計解析を統計解析ソフトでテューキー検定による一元配置分散分析で行い、得られたグラフを 図2に示す。対照と比較したグラフェン百分率は、0.001%グラフェン濃度(**p 0.05)。したがって、MTT試験結果およびステッチ?…

Discussion

従来の2D手法に対するエンジニアリングされた3D足場で適用される処理の利点は、日々ますます顕著になっています。これらの治療法で単独で、または生体適合性と生分解性の低いさまざまな生体材料から製造された足場と一緒に使用される幹細胞は、通常、末梢神経の再生には不十分です。ウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJ-MSC)は、特に取得のためのプロトコルの最適化、それらの増殖能力?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究で使用されたグラフェンは、カークラレリ大学の機械工学科で開発されました。カラベヨオール博士から寄贈されました。グラフェン毒性試験は、TÜBİTAK 2209-B産業指向学部論文支援プログラムの範囲内で完了した「グラフェンドープバイオインクを使用した3Dバイオプリンター上での間葉系幹細胞の印刷と分化」(出願番号:1139B411802273)というタイトルのプロジェクトによって資金提供されました。研究の他の部分は、ユルドゥズ工科大学科学研究プロジェクト(TSA-2021-4713)によって提供された研究資金によってサポートされました。タイムラプスイメージング段階で使用したGFPを有する間葉系幹細胞は、バイロステムバイオテクノロジーから寄贈されました。著者らは、生産的な議論をしてくれたDarıcıLABとYTU細胞培養および組織工学LABチームに感謝します。

Materials


Centrifugal
Hitachi Used in cell culture and biomaterial step
0.1N CaCl2 HD Bioink Used for crosslinker
0.22 µm membrane filter Aιsιmo Used for sterilization
0.45 µm syringe filter Aιsιmo Used for sterilization
1.5mL conic tube Eppendorfa Used for bioink drop
15mL Falcon tube Nest Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks Nest Used for cell culture
3D Bioprinting Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) Bioprinting Step
50 mL Falcon tube Nest Used in cell culture step
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) Merck Millipore Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks Nest Used for cell culture
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit Santa Cruz Biotechnology J1514 Seconder antibody, used for dye
Anti mouse IgG-SC2781-goat Santa Cruz Biotechnology C3109 Seconder antibody, used for dye
Au coating device EM ACE600 Leica for gold plating of biomaterial section before SEM imaging
Autoclave NUVE-OT 90L Used for the sterilization process.
Autoclave NUVE-OT 90L Used for the sterilization process.
Cell Cultre Cabine Hera Safe KS Used for the cell culture process
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 Sigma RNBJ7249 Used as cell culture medium
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM Quanta FEG 450 for SEM
Fetal Bovine Serum-FBS Capricorn FBS-16A It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80°C Panasonic MDF-U5386S-PE We were used to store cells and the resulting exosomes
Gelatine-Alginate bioink powder HD Bioink Used for produced bioink step
GFP labelled-WJ-MSCs Virostem Used for imaging to cell-bioink interaction
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) Grafen Chemical Industries Co. Used for production 3D-G bioink
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) Cell Signalling and Santa Cruz Used for dye
JASCO 6600 Tetra for FTIR
MTT Assay Sigma Viability testing
Penicilin/Streptomycin Solution Capricorn PB-S It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Thoma slide Isolab Used for counting the cell
Time-Lapse Imaging System Zeiss Axio.Observer.Z1 Imaging
Tripsin-EDTA Multicell The flask was used to remove the cells covering the surface.
Vorteks Biobase For produced bioink step
WJ-MSCs ATCC Used for the cell culture process

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Citer Cet Article
Zorba Yildiz, A. P., Darici, H., Yavuz, B., Abamor, E. S., Ozdemir, C., Yasin, M. E., Bagirova, M., Allahverdiyev, A., Karaoz, E. Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering. J. Vis. Exp. (183), e63622, doi:10.3791/63622 (2022).

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