말초 신경 공학을 위한 그래핀 기반 3D 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 준비 및 특성화
Summary
이 원고에서 우리는 말초 조직 공학에 사용하기 위해 그래핀을 함유하는 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 제조를 시연합니다. 이 3D 바이오 하이브리드 재료를 사용하여 줄기 세포의 신경 분화 프로토콜이 수행됩니다. 이것은 유사한 생체 재료를 클리닉에 가져 오는 중요한 단계가 될 수 있습니다.
Abstract
말초 신경 병증은 축삭 손상의 결과로 발생할 수 있으며 때로는 탈수 초성 질환으로 인해 발생할 수 있습니다. 말초 신경 손상은 응급 환자의 1.5%-5%에서 발생하는 세계적인 문제이며 상당한 실직으로 이어질 수 있습니다. 오늘날 스캐폴드, 적절한 세포주 및 생체 신호로 구성된 조직 공학 기반 접근 방식은 3차원(3D) 바이오프린팅 기술의 발전으로 더욱 적용 가능해졌습니다. 다양한 하이드로겔 생체 재료와 줄기 세포, 엑소좀 또는 생체 신호 분자의 조합은 말초 신경 재생의 기존 문제를 극복하기 위해 자주 연구되고 있습니다. 따라서, 하이드로겔과 같은 주사 가능한 시스템, 또는 다양한 바이오프린팅 방법에 의해 형성된 이식형 도관 구조의 생산은 말초 신경 공학에서 중요성을 얻고 있다. 정상적인 조건에서 줄기 세포는 신체의 재생 세포이며 개체군을 보호하기 위해 시간이 지남에 따라 수와 기능이 감소하지 않습니다. 이들은 특수 세포는 아니지만 부상에 대한 반응으로 적절한 자극으로 분화 할 수 있습니다. 줄기 세포 시스템은 줄기 세포 틈새 시장이라고 불리는 미세 환경의 영향을 받고 있습니다. 말초 신경 손상, 특히 신경망증에서 이 미세 환경은 절단된 신경 말단을 외과적으로 결합한 후에도 완전히 구출될 수 없습니다. 복합 생체 재료 및 결합 된 세포 치료 접근법은 생분해 성, 생체 적합성 및 가공성과 같은 다양한 특성 측면에서 재료의 기능성과 적용 가능성을 높입니다. 이에 본 연구는 그래핀 기반 바이오하이브리드 하이드로겔 패터닝의 제조 및 용도를 입증하고, 신경 재생에 효과적인 해결책이 될 수 있는 줄기세포의 신경세포로의 분화 효율을 알아보는 것을 목적으로 한다.
Introduction
유기체와 환경의 내부 구조를 연결하는 메커니즘 인 신경계는 중추 신경계와 말초 신경계의 두 부분으로 나뉩니다. 말초 신경 손상은 응급실에 내원하는 환자의 1.5%-5%를 차지하는 세계적인 문제이며 다양한 외상으로 인해 발생하여 상당한 실직을 초래합니다 1,2,3.
오늘날 말초 신경 공학에 대한 세포 접근법은 큰 관심을 끌고 있습니다. 줄기 세포는 이러한 접근법에 사용되는 세포 중 가장 먼저 나옵니다. 정상적인 조건에서 줄기 세포는 신체의 재생 세포이며 개체군을 보호하기 위해 시간이 지남에 따라 수와 기능이 감소하지 않습니다. 이 세포들은 특수화되어 있지만, 손상에 대한 반응으로 적절한 자극에 의해 분화할 수 있다 4,5. 줄기 세포 가설에 따르면, 줄기 세포 시스템은 줄기 세포 틈새 (stem cell niche)라고 불리는 미세 환경의 영향을받습니다. 줄기세포의 보존과 분화는 세포와 스캐폴드7를 이용한 조직공학을 통해 재구성될 수 있는 미세환경6의 존재 없이는 불가능하다. 조직 공학은 공학과 생물학 원리를 모두 포함하는 다학문 분야입니다. 조직공학은 생체 조직을 대체할 수 있는 인공 조직을 만들 수 있는 도구를 제공하며, 손상된 조직을 제거하고 기능성 조직을 제공함으로써 이러한 조직의 재생에 사용될 수 있다8. 조직 공학의 세 가지 초석 중 하나인 조직 스캐폴드는 천연 및 합성 재료와 다른 방법을 사용하여 생산된다9. 3차원(3D) 프린팅은 다양한 방법을 사용하여 복잡한 모양을 간단하지만 다재다능하게 생산하여 결함 조직을 대체하거나 복원하는 데 널리 사용되는 새로운 적층 제조 기술입니다. 바이오프린팅은 세포와 생체 재료의 공존을 가능하게 하는 적층 제조 방법으로, 바이오잉크(bioinks)라고 불린다 10. 신경 세포가 서로 상호 작용하는 것을 고려하여 연구는 그래핀과 같은 전도성 생체 재료 후보로 이동했습니다. 플렉시블 일렉트로닉스, 슈퍼 커패시터, 배터리, 광학, 전기화학 센서 및 에너지 저장과 같은 특성을 갖는 그래핀 나노플레이트는 조직 공학 분야에서 선호되는 생체 재료이다11. 그래핀은 손상된 조직과 장기의 증식과 재생이 수행된 연구에 사용되어 왔다12,13.
조직 공학은 스캐폴드, 세포 및 생체 신호 분자의 세 가지 기본 구성 요소로 구성됩니다. 말초 신경 손상에 대한 연구는이 세 가지 구조를 완전히 제공한다는 점에서 결함이 있습니다. 줄기 세포 또는 생체 신호 분자만을 포함하는 생체 재료, 줄기 세포 분화를 가능하게하는 생리 활성 분자의 부족, 사용 된 생체 재료의 생체 적합성 부족, 조직 틈새 세포의 증식에 대한 낮은 영향, 따라서 신경 전도가 완전히 실현되지 않습니다 2,13,14,15,16. 이를 위해서는 신경 재생의 최적화, 근육 위축(17,18)의 감소, 그리고 이러한 문제에 대한 성장 인자를 가진 필요한 귀환(19)을 생성해야 한다. 이 시점에서, 임상으로 이송 될 외과 생체 재료 프로토 타입의 신경 활성의 특성화 및 분석은 매우 중요합니다.
따라서이 방법 연구는 3D 바이오 프린터로 형성된 그래 핀 나노 플레이트를 사용한 바이오 잉크 하이드로 겔 패터닝과 그것이 포함하는 줄기 세포의 신경성 분화에 미치는 영향을 조사합니다. 또한, 그래핀이 신경구 형성 및 분화에 미치는 영향을 조사합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기존의 2D 방법에 비해 엔지니어링된 3D 스캐폴드로 적용된 처리의 이점은 날이 갈수록 두드러지고 있습니다. 이러한 치료법에 단독으로 사용되거나 생체 적합성 및 생분해성이 낮은 다양한 생체 재료로 생성된 스캐폴드와 함께 사용되는 줄기 세포는 일반적으로 말초 신경 재생에 부적절합니다. 와튼젤리 중간엽 줄기세포(WJ-MSCs)는 특히 획득 프로토콜의 최적화, 증식 능력 및 분화 능력을 고려할 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구에 사용된 그래핀은 커클라렐리대학교 기계공학과에서 개발되었다. Karabeyoğlu 박사가 기증했습니다. 그래핀 독성 시험은 TÜBİTAK 2209-B-산업 지향 학부 논문 지원 프로그램의 범위 내에서 완료된 “그래핀 도핑된 바이오잉크를 사용한 3D 바이오프린터에서 중간엽 줄기 세포의 인쇄 및 분화”(출원번호: 1139B411802273)라는 제목의 프로젝트에서 자금을 지원받았습니다. 연구의 다른 부분은 Yildiz Technical University Scientific Research Projects(TSA-2021-4713)에서 제공한 연구 기금의 지원을 받았습니다. 타임랩스 이미징 단계에서 사용된 GFP가 있는 중간엽 줄기 세포는 Virostem Biotechnology에서 기증했습니다. 저자는 생산적인 토론을 해준 Darıcı LAB과 YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB 팀에 감사드립니다.
Materials
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
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