Preparazione e caratterizzazione di bioink idrogel bioibrido 3D a base di grafene per la neuroingegneria periferica
Summary
In questo manoscritto, dimostriamo la preparazione di un bioink idrogel bioibrido contenente grafene per l’uso nell’ingegneria dei tessuti periferici. Utilizzando questo materiale bioibrido 3D, viene eseguito il protocollo di differenziazione neurale delle cellule staminali. Questo può essere un passo importante per portare biomateriali simili alla clinica.
Abstract
Le neuropatie periferiche possono verificarsi a causa di danni assonali e, occasionalmente, a causa di malattie demielinizzanti. Il danno ai nervi periferici è un problema globale che si verifica nell’1,5% -5% dei pazienti di emergenza e può portare a significative perdite di posti di lavoro. Oggi, gli approcci basati sull’ingegneria tissutale, costituiti da scafffold, linee cellulari appropriate e biosegnali, sono diventati più applicabili con lo sviluppo di tecnologie di bioprinting tridimensionale (3D). La combinazione di vari biomateriali idrogel con cellule staminali, esosomi o molecole di bio-segnalazione è spesso studiata per superare i problemi esistenti nella rigenerazione dei nervi periferici. Di conseguenza, la produzione di sistemi iniettabili, come idrogel, o strutture di condotti impiantabili formate da vari metodi di bioprinting ha acquisito importanza nella neuroingegneria periferica. In condizioni normali, le cellule staminali sono le cellule rigenerative del corpo e il loro numero e le loro funzioni non diminuiscono con il tempo per proteggere le loro popolazioni; Queste non sono cellule specializzate, ma possono differenziarsi su stimolazione appropriata in risposta a lesioni. Il sistema delle cellule staminali è sotto l’influenza del suo microambiente, chiamato nicchia delle cellule staminali. Nelle lesioni dei nervi periferici, specialmente nella neurotmesi, questo microambiente non può essere completamente salvato anche dopo aver legato chirurgicamente le terminazioni nervose recise insieme. L’approccio dei biomateriali compositi e delle terapie cellulari combinate aumenta la funzionalità e l’applicabilità dei materiali in termini di varie proprietà come biodegradabilità, biocompatibilità e processabilità. Di conseguenza, questo studio mira a dimostrare la preparazione e l’uso di pattern idrogel bioibridi a base di grafene e ad esaminare l’efficienza di differenziazione delle cellule staminali in cellule nervose, che può essere una soluzione efficace nella rigenerazione nervosa.
Introduction
Il sistema nervoso, che è il meccanismo che collega la struttura interna dell’organismo e l’ambiente, è diviso in due parti: il sistema nervoso centrale e periferico. Il danno ai nervi periferici è un problema globale che costituisce l’1,5%-5% dei pazienti che si presentano al pronto soccorso e si sviluppa a causa di vari traumi, portando a una significativa perdita del lavoro 1,2,3.
Oggi, gli approcci cellulari alla neuroingegneria periferica sono di grande interesse. Le cellule staminali sono al primo posto tra le cellule utilizzate in questi approcci. In condizioni normali, le cellule staminali sono le cellule rigenerative del corpo e il loro numero e le loro funzioni non diminuiscono con il tempo per proteggere le loro popolazioni; Queste cellule sono specializzate ma possono differenziarsi su stimolazione appropriata in risposta alla lesione 4,5. Secondo l’ipotesi delle cellule staminali, il sistema delle cellule staminali è sotto l’influenza del suo microambiente, chiamato nicchia delle cellule staminali. La conservazione e la differenziazione delle cellule staminali sono impossibili senza la presenza del loro microambiente6, che può essere ricostituito attraverso l’ingegneria tissutale utilizzando cellule e scaffold7. L’ingegneria tissutale è un campo multidisciplinare che include sia principi di ingegneria che di biologia. L’ingegneria tissutale fornisce strumenti per la creazione di tessuti artificiali che possono sostituire i tessuti viventi e possono essere utilizzati nella rigenerazione di questi tessuti rimuovendo i tessuti danneggiati e fornendo tessuti funzionali8. Gli scaffold tissutali, uno dei tre capisaldi dell’ingegneria tissutale, sono prodotti utilizzando metodi diversi da materiali naturali e sintetici9. La stampa tridimensionale (3D) è una tecnologia di produzione additiva emergente ampiamente utilizzata per sostituire o ripristinare i tessuti difettosi attraverso la sua produzione semplice ma versatile di forme complesse utilizzando vari metodi. Il bioprinting è un metodo di produzione additiva che consente la coesistenza di cellule e biomateriali, chiamato bioinks10. Considerando l’interazione delle cellule nervose tra loro, gli studi si sono spostati su candidati biomateriali conduttivi come il grafene. Le nanopiastre di grafene, che hanno proprietà quali elettronica flessibile, supercondensatori, batterie, ottica, sensori elettrochimici e accumulo di energia, sono un biomateriale preferito nel campo dell’ingegneria tissutale11. Il grafene è stato utilizzato in studi in cui sono state eseguite la proliferazione e la rigenerazione di tessuti e organi danneggiati12,13.
L’ingegneria tissutale è costituita da tre elementi costitutivi di base: impalcatura, cellule e molecole di biosegnale. Ci sono carenze negli studi sul danno ai nervi periferici in termini di fornitura completa di queste tre strutture. Sono stati riscontrati vari problemi nei biomateriali prodotti e utilizzati negli studi, come ad esempio contenenti solo cellule staminali o molecole di biosegnale, la mancanza di una molecola bioattiva che consenta la differenziazione delle cellule staminali, la mancanza di biocompatibilità del biomateriale utilizzato e il basso effetto sulla proliferazione delle cellule nella nicchia tissutale, e, quindi, la conduzione nervosa non è pienamente realizzata 2,13,14,15,16. Ciò richiede l’ottimizzazione della rigenerazione nervosa, riducendo l’atrofia muscolare 17,18 e creando il necessario homing19 con fattori di crescita contro tali problemi. A questo punto, la caratterizzazione e l’analisi della neuro-attività di un prototipo di biomateriale chirurgico, da trasferire in clinica, sono molto importanti.
Di conseguenza, questo studio sui metodi studia il pattern dell’idrogel bioink con nanopiastre di grafene formate da un bioprinter 3D e la sua efficacia sulla differenziazione neurogena delle cellule staminali che contiene. Inoltre, vengono studiati gli effetti del grafene sulla formazione e differenziazione della neurosfera.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vantaggi dei trattamenti applicati con scaffold 3D ingegnerizzati rispetto ai metodi 2D convenzionali stanno diventando sempre più evidenti ogni giorno. Le cellule staminali utilizzate da sole in queste terapie o insieme a scaffold prodotti da vari biomateriali con bassa biocompatibilità e biodegradabilità sono solitamente inadeguate nella rigenerazione dei nervi periferici. Le cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton (WJ-MSCs) sembrano essere una linea cellulare candidata adatta, soprattutto considerand…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il grafene utilizzato in questo studio è stato sviluppato presso l’Università di Kirklareli, Dipartimento di Ingegneria Meccanica. È stato donato dal Dr. Karabeyoğlu. Il test di tossicità del grafene è stato finanziato dal progetto intitolato “Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks” (Domanda n.: 1139B411802273) completato nell’ambito del TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program. L’altra parte dello studio è stata supportata dal fondo di ricerca fornito da Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Le cellule staminali mesenchimali con GFP utilizzate nella fase di imaging time-lapse sono state donate da Virostem Biotechnology. Gli autori ringraziano Darıcı LAB e il team YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB per le discussioni produttive.
Materials
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
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