Préparation et caractérisation de bio-encre d’hydrogel biohybride 3D à base de graphène pour la neuro-ingénierie périphérique
Summary
Dans ce manuscrit, nous démontrons la préparation d’une bioencre d’hydrogel biohybride contenant du graphène pour une utilisation dans l’ingénierie tissulaire périphérique. À l’aide de ce matériau biohybride 3D, le protocole de différenciation neuronale des cellules souches est effectué. Cela peut être une étape importante dans l’introduction de biomatériaux similaires à la clinique.
Abstract
Les neuropathies périphériques peuvent survenir à la suite de lésions axonales et parfois en raison de maladies démyélinisantes. Les lésions nerveuses périphériques sont un problème mondial qui survient chez 1,5 à 5 % des patients aux urgences et peut entraîner des pertes d’emplois importantes. Aujourd’hui, les approches basées sur l’ingénierie tissulaire, composées d’échafaudages, de lignées cellulaires appropriées et de biosignaux, sont devenues plus applicables avec le développement de technologies de bio-impression tridimensionnelle (3D). La combinaison de divers biomatériaux hydrogels avec des cellules souches, des exosomes ou des molécules de biosignalisation est fréquemment étudiée pour surmonter les problèmes existants dans la régénération des nerfs périphériques. En conséquence, la production de systèmes injectables, tels que les hydrogels, ou de structures de conduits implantables formées par diverses méthodes de bio-impression a pris de l’importance dans la neuro-ingénierie périphérique. Dans des conditions normales, les cellules souches sont les cellules régénératrices du corps, et leur nombre et leurs fonctions ne diminuent pas avec le temps pour protéger leurs populations; Ce ne sont pas des cellules spécialisées, mais elles peuvent se différencier par une stimulation appropriée en réponse à une blessure. Le système de cellules souches est sous l’influence de son microenvironnement, appelé niche des cellules souches. Dans les lésions nerveuses périphériques, en particulier dans la névrotémèse, ce microenvironnement ne peut pas être complètement sauvé même après avoir lié chirurgicalement les terminaisons nerveuses sectionnées ensemble. L’approche des biomatériaux composites et des thérapies cellulaires combinées augmente la fonctionnalité et l’applicabilité des matériaux en termes de propriétés diverses telles que la biodégradabilité, la biocompatibilité et la processabilité. En conséquence, cette étude vise à démontrer la préparation et l’utilisation de motifs d’hydrogel biohybrides à base de graphène et à examiner l’efficacité de différenciation des cellules souches en cellules nerveuses, ce qui peut être une solution efficace dans la régénération nerveuse.
Introduction
Le système nerveux, qui est le mécanisme qui relie la structure interne de l’organisme et de l’environnement, est divisé en deux parties: le système nerveux central et périphérique. Les lésions nerveuses périphériques sont un problème global qui représente 1,5% à 5% des patients qui se présentent à l’urgence et se développent en raison de divers traumatismes, entraînant des pertes d’emploi importantes 1,2,3.
Aujourd’hui, les approches cellulaires de la neuro-ingénierie périphérique sont d’un grand intérêt. Les cellules souches viennent en premier parmi les cellules utilisées dans ces approches. Dans des conditions normales, les cellules souches sont les cellules régénératrices du corps, et leur nombre et leurs fonctions ne diminuent pas avec le temps pour protéger leurs populations; Ces cellules sont spécialisées mais peuvent se différencier sur une stimulation appropriée en réponse à une blessure 4,5. Selon l’hypothèse des cellules souches, le système de cellules souches est sous l’influence de son microenvironnement, appelé niche des cellules souches. La conservation et la différenciation des cellules souches sont impossibles sans la présence de leur microenvironnement6, qui peut être reconstitué par ingénierie tissulaire à l’aide de cellules et d’échafaudages7. Le génie tissulaire est un domaine multidisciplinaire qui comprend à la fois des principes d’ingénierie et de biologie. L’ingénierie tissulaire fournit des outils pour la création de tissus artificiels qui peuvent remplacer les tissus vivants et peuvent être utilisés dans la régénération de ces tissus en enlevant les tissus endommagés et en fournissant des tissus fonctionnels8. Les échafaudages tissulaires, l’une des trois pierres angulaires de l’ingénierie tissulaire, sont produits à l’aide de méthodes différentes à partir de matériaux naturels et synthétiques9. L’impression tridimensionnelle (3D) est une technologie émergente de fabrication additive largement utilisée pour remplacer ou restaurer les tissus défectueux grâce à sa production simple mais polyvalente de formes complexes à l’aide de diverses méthodes. La bio-impression est une méthode de fabrication additive qui permet la coexistence de cellules et de biomatériaux, appelée bioencres10. Compte tenu de l’interaction des cellules nerveuses entre elles, les études se sont orientées vers des biomatériaux candidats conducteurs tels que le graphène. Les nanoplaques de graphène, qui ont des propriétés telles que l’électronique flexible, les supercondensateurs, les batteries, l’optique, les capteurs électrochimiques et le stockage d’énergie, sont un biomatériau privilégié dans le domaine de l’ingénierie tissulaire11. Le graphène a été utilisé dans des études où la prolifération et la régénération de tissus et d’organes endommagés ont été effectuées12,13.
L’ingénierie tissulaire se compose de trois blocs de construction de base: l’échafaudage, les cellules et les molécules de biosignal. Il y a des lacunes dans les études sur les lésions nerveuses périphériques en termes de fourniture complète de ces trois structures. Divers problèmes ont été rencontrés dans les biomatériaux produits et utilisés dans les études, tels que le fait qu’ils ne contiennent que des cellules souches ou des molécules biosignales, l’absence d’une molécule bioactive permettant la différenciation des cellules souches, le manque de biocompatibilité du biomatériau utilisé et le faible effet sur la prolifération des cellules dans la niche tissulaire, et, par conséquent, la conduction nerveuse n’étant pas pleinement réalisée 2,13,14,15,16. Cela nécessite l’optimisation de la régénération nerveuse, la réduction de l’atrophie musculaire 17,18 et la création de la réponse nécessaire19 avec des facteurs de croissance contre de tels problèmes. À ce stade, la caractérisation et l’analyse de la neuroactivité d’un prototype de biomatériau chirurgical, à transférer à la clinique, sont très importantes.
En conséquence, cette étude de méthodes étudie la structuration d’hydrogel de bio-encre avec des nanoplaques de graphène formées par une bioimprimante 3D et son efficacité sur la différenciation neurogène des cellules souches qu’elle contient. En outre, les effets du graphène sur la formation et la différenciation des neurosphères sont étudiés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les avantages des traitements appliqués avec des échafaudages 3D d’ingénierie par rapport aux méthodes 2D conventionnelles deviennent de plus en plus perceptibles chaque jour. Les cellules souches utilisées seules dans ces thérapies ou avec des échafaudages produits à partir de divers biomatériaux à faible biocompatibilité et biodégradabilité sont généralement inadéquates dans la régénération des nerfs périphériques. Les cellules souches mésenchymateuses de gelée de Wharton (WJ-MSCs) semblent êt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le graphène utilisé dans cette étude a été développé à l’Université Kirklareli, Département de génie mécanique. Il a été donné par le Dr Karabeyoğlu. Le test de toxicité du graphène a été financé par le projet intitulé « Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks » (No de demande: 1139B411802273) réalisé dans le cadre du programme de soutien aux thèses de premier cycle TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support. L’autre partie de l’étude a été financée par le fonds de recherche fourni par Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Les cellules souches mésenchymateuses avec GFP utilisées dans la phase d’imagerie time-lapse ont été données par Virostem Biotechnology. Les auteurs remercient Darıcı LAB et l’équipe YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB pour leurs discussions productives.
Materials
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
- Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, (2019).
- Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
- Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195 (2021).
- Allahverdiyev, A. . Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , (2018).
- Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
- Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
- Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman’s Medical Cell Biology, Fourth Edition. , 361-380 (2021).
- Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
- Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
- Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).
- Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
- Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
- Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
- Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
- Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
- Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
- Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
- Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
- Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).
- Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
- Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
- Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
- Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
- Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658 (2019).
- Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
- Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).
- Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , (2020).
- Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
- Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
- Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
- Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
