הכנה ואפיון של ביו-דיו הידרוג'ל ביו-היברידי תלת-ממדי מבוסס גרפן לנוירו-הנדסה היקפית
Summary
בכתב יד זה, אנו מדגימים את ההכנה של ביודיו הידרוג’ל ביו-היברידי המכיל גרפן לשימוש בהנדסת רקמות היקפיות. באמצעות חומר ביו-היברידי תלת-ממדי זה, מבוצע פרוטוקול ההתמיינות העצבית של תאי גזע. זה יכול להיות צעד חשוב בהבאת ביו-חומרים דומים למרפאה.
Abstract
נוירופתיות היקפיות יכולות להתרחש כתוצאה מנזק אקסונלי, ולעיתים עקב מחלות דה-מיאלינטינג. נזק עצבי היקפי הוא בעיה גלובלית המתרחשת אצל 1.5%-5% ממטופלי החירום ועלולה להוביל לאובדן משמעותי של מקומות עבודה. כיום, גישות מבוססות הנדסת רקמות, המורכבות מפיגומים, קווי תאים מתאימים ואותות ביולוגיים, הפכו ישימות יותר עם פיתוח טכנולוגיות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית (תלת-ממדית). השילוב של ביו-חומרים שונים של הידרוג’ל עם תאי גזע, אקסוזומים או מולקולות איתות ביולוגי נחקר לעתים קרובות כדי להתגבר על הבעיות הקיימות בהתחדשות עצבית היקפית. בהתאם לכך, הייצור של מערכות הזרקה, כגון הידרוג’לים, או מבני צינור מושתלים שנוצרו בשיטות הדפסה ביולוגית שונות זכה לחשיבות בנוירו-הנדסה היקפית. בתנאים רגילים, תאי גזע הם התאים המחדשים של הגוף, ומספרם ותפקודם אינם פוחתים עם הזמן כדי להגן על אוכלוסיותיהם; אלה אינם תאים מתמחים אך יכולים להתמיין עם גירוי מתאים בתגובה לפציעה. מערכת תאי הגזע נמצאת תחת השפעת המיקרו-סביבה שלה, הנקראת נישת תאי גזע. בפגיעות עצביות היקפיות, במיוחד בנוירוטמזיס, לא ניתן להציל את המיקרו-סביבה הזו במלואה גם לאחר קשירת קצות עצבים קטועים יחד בניתוח. גישת הביו-חומרים המרוכבים והטיפולים התאיים המשולבים מגבירה את הפונקציונליות והישימות של חומרים במונחים של תכונות שונות כגון מתכלה, תאימות ביולוגית ויכולת עיבוד. בהתאם לכך, מחקר זה נועד להדגים הכנה ושימוש בתבניות הידרוג’ל ביו-היברידיות מבוססות גרפן ולבחון את יעילות ההתמיינות של תאי גזע לתאי עצב, אשר יכולה להוות פתרון יעיל בהתחדשות עצבית.
Introduction
מערכת העצבים, שהיא המנגנון המגשר בין המבנה הפנימי של האורגניזם והסביבה, מחולקת לשני חלקים: מערכת העצבים המרכזית וההיקפית. פגיעה עצבית היקפית היא בעיה גלובלית המהווה 1.5%-5% מהמטופלים המגיעים למחלקה לרפואה דחופה ומתפתחת עקב טראומות שונות, המובילות לאובדן עבודה משמעותי 1,2,3.
כיום, גישות תאיות לנוירו-הנדסה היקפית מעוררות עניין רב. תאי גזע נמצאים במקום הראשון בין התאים המשמשים בגישות אלה. בתנאים רגילים, תאי גזע הם התאים המחדשים של הגוף, ומספרם ותפקודם אינם פוחתים עם הזמן כדי להגן על אוכלוסיותיהם; תאים אלה מתמחים אך יכולים להתמיין עם גירוי מתאים בתגובה לפציעה 4,5. על פי השערת תאי הגזע, מערכת תאי הגזע נמצאת תחת השפעת המיקרו-סביבה שלה, הנקראת נישת תאי הגזע. שימור והתמיינות של תאי גזע אינם אפשריים ללא נוכחות של מיקרו-סביבה6 שלהם, אשר ניתן לבנות מחדש באמצעות הנדסת רקמות באמצעות תאים ופיגומים7. הנדסת רקמות היא תחום רב תחומי הכולל עקרונות הנדסיים וביולוגיים כאחד. הנדסת רקמות מספקת כלים ליצירת רקמות מלאכותיות שיכולות להחליף רקמות חיות וניתן להשתמש בהן בהתחדשות רקמות אלה על ידי הסרת הרקמות הפגועות ומתן רקמות תפקודיות8. פיגומי רקמות, אחת משלוש אבני היסוד של הנדסת רקמות, מיוצרים בשיטות שונות מחומרים טבעיים וסינתטיים9. הדפסה תלת מימדית (3D) היא טכנולוגיית ייצור תוספים מתפתחת הנמצאת בשימוש נרחב להחלפה או שחזור של רקמות פגומות באמצעות הייצור הפשוט אך הרב-תכליתי של צורות מורכבות בשיטות שונות. הדפסה ביולוגית היא שיטת ייצור תוספתית המאפשרת דו-קיום של תאים וביו-חומרים, הנקראת ביו-דיו10. בהתחשב באינטראקציה של תאי עצב זה עם זה, מחקרים עברו למועמדים ביו-חומריים מוליכים כגון גרפן. ננו-לוחות גרפן, בעלי תכונות כגון אלקטרוניקה גמישה, קבלי-על, סוללות, אופטיקה, חיישנים אלקטרוכימיים ואגירת אנרגיה, הם חומר ביולוגי מועדף בתחום הנדסת רקמות11. גרפן שימש במחקרים שבהם התפשטות והתחדשות של רקמות ואיברים פגומים בוצעו12,13.
הנדסת רקמות מורכבת משלוש אבני בניין בסיסיות: פיגומים, תאים ומולקולות אות ביולוגי. ישנם ליקויים במחקרים על נזק עצבי היקפי במונחים של מתן שלושת המבנים הללו לחלוטין. בעיות שונות נתקלו בביו-חומרים המיוצרים ומשמשים במחקרים, כגון הם מכילים רק תאי גזע או מולקולות אות ביולוגי, היעדר מולקולה ביו-אקטיבית שתאפשר התמיינות תאי גזע, חוסר תאימות ביולוגית של החומר הביולוגי בו נעשה שימוש, וההשפעה הנמוכה על התפשטות התאים בנישת הרקמות, ולכן, הולכה עצבית לא ממומשת במלואה 2,13,14,15,16. זה דורש אופטימיזציה של התחדשות עצבית, הפחתת ניוון שרירים17,18, ויצירת ביותהכרחי 19 עם גורמי גדילה נגד בעיות כאלה. בשלב זה, האפיון והניתוח של הפעילות העצבית של אב טיפוס ביו-חומרי כירורגי, שיועבר למרפאה, חשובים מאוד.
בהתאם לכך, מחקר שיטות זה חוקר את דפוס ביו-דיו הידרוג’ל עם ננו-לוחות גרפן שנוצרו על ידי מדפסת ביולוגית תלת-ממדית ואת יעילותה על התמיינות נוירוגנית של תאי הגזע שהיא מכילה. כמו כן, ההשפעות של גרפן על היווצרות נוירוספרה והבחנה נחקרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרונות של טיפולים המיושמים עם פיגומים תלת ממדיים מהונדסים על פני שיטות דו-ממדיות קונבנציונליות הופכים בולטים יותר ויותר מדי יום. תאי גזע המשמשים לבדם בטיפולים אלה או יחד עם פיגומים המיוצרים מביו-חומרים שונים בעלי תאימות ביולוגית נמוכה ומתכלות אינם מספיקים בדרך כלל בהתחדשות עצבית היקפ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הגרפן ששימש במחקר זה פותח באוניברסיטת קירקלרלי, המחלקה להנדסת מכונות. הוא נתרם על ידי ד”ר Karabeyoğlu. בדיקת רעילות הגרפן מומנה על ידי הפרויקט שכותרתו “הדפסה והתמיינות של תאי גזע מזנכימליים במדפסות ביולוגיות תלת-ממדיות עם ביו-דיו מסומם גרפן” (מספר יישום: 1139B411802273) שהושלם במסגרת תוכנית התמיכה בתזה לתואר ראשון TÜBİTAK 2209-B-Industry. החלק השני של המחקר נתמך על ידי קרן המחקר שסופקה על ידי Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). תאי גזע מזנכימליים עם GFP המשמשים בשלב ההדמיה בהילוך מהיר נתרמו על ידי Virostem Biotechnology. המחברים מודים ל-Darıcı LAB ולצוות YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB על דיונים פרודוקטיביים.
Materials
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
- Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, (2019).
- Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
- Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195 (2021).
- Allahverdiyev, A. . Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , (2018).
- Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
- Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
- Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman’s Medical Cell Biology, Fourth Edition. , 361-380 (2021).
- Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
- Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
- Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).
- Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
- Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
- Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
- Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
- Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
- Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
- Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
- Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
- Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).
- Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
- Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
- Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
- Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
- Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658 (2019).
- Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
- Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).
- Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , (2020).
- Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
- Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
- Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
- Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
