إعداد وتوصيف الحبر الحيوي الهجين الحيوي 3D القائم على الجرافين للهندسة العصبية الطرفية
Summary
في هذه المخطوطة ، نوضح تحضير حبر حيوي هيدروجيل حيوي يحتوي على الجرافين للاستخدام في هندسة الأنسجة المحيطية. باستخدام هذه المادة biohybrid 3D ، يتم تنفيذ بروتوكول التمايز العصبي للخلايا الجذعية. يمكن أن تكون هذه خطوة مهمة في جلب مواد حيوية مماثلة إلى العيادة.
Abstract
يمكن أن تحدث اعتلالات الأعصاب الطرفية نتيجة لتلف المحور العصبي ، وأحيانا بسبب أمراض إزالة الميالين. تلف الأعصاب الطرفية هو مشكلة عالمية تحدث في 1.5٪ -5٪ من مرضى الطوارئ وقد تؤدي إلى فقدان كبير للوظائف. اليوم ، أصبحت الأساليب القائمة على هندسة الأنسجة ، والتي تتكون من السقالات وخطوط الخلايا المناسبة والإشارات الحيوية ، أكثر قابلية للتطبيق مع تطوير تقنيات الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (3D). كثيرا ما تتم دراسة مزيج من المواد الحيوية الهيدروجيل المختلفة مع الخلايا الجذعية أو الإكسوسومات أو جزيئات الإشارات الحيوية للتغلب على المشاكل الحالية في تجديد الأعصاب الطرفية. وبناء على ذلك ، اكتسب إنتاج الأنظمة القابلة للحقن ، مثل الهلاميات المائية ، أو هياكل القنوات القابلة للزرع التي شكلتها طرق الطباعة الحيوية المختلفة أهمية في الهندسة العصبية الطرفية. في ظل الظروف العادية ، الخلايا الجذعية هي الخلايا المتجددة للجسم ، ولا يتناقص عددها ووظائفها بمرور الوقت لحماية سكانها. هذه ليست خلايا متخصصة ولكن يمكن أن تتمايز عند التحفيز المناسب استجابة للإصابة. يقع نظام الخلايا الجذعية تحت تأثير بيئته المكروية ، والتي تسمى مكانة الخلايا الجذعية. في إصابات الأعصاب الطرفية ، وخاصة في المزيج العصبي ، لا يمكن إنقاذ هذه البيئة الدقيقة بالكامل حتى بعد ربط النهايات العصبية المقطوعة جراحيا معا. تزيد المواد الحيوية المركبة ونهج العلاجات الخلوية المدمجة من وظائف المواد وقابليتها للتطبيق من حيث الخصائص المختلفة مثل التحلل البيولوجي والتوافق الحيوي وقابلية المعالجة. وفقا لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى إظهار إعداد واستخدام نمط هيدروجيل حيوي هجين قائم على الجرافين وفحص كفاءة تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا عصبية ، والتي يمكن أن تكون حلا فعالا في تجديد الأعصاب.
Introduction
ينقسم الجهاز العصبي ، وهو الآلية التي تربط البنية الداخلية للكائن الحي والبيئة ، إلى قسمين: الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. تلف الأعصاب الطرفية هو مشكلة عالمية تشكل 1.5٪ -5٪ من المرضى الذين يحضرون إلى قسم الطوارئ ويتطورون بسبب الصدمات المختلفة ، مما يؤدي إلى فقدان كبير للوظيفة1،2،3.
اليوم ، الأساليب الخلوية للهندسة العصبية الطرفية ذات أهمية كبيرة. تأتي الخلايا الجذعية أولا بين الخلايا المستخدمة في هذه الأساليب. في ظل الظروف العادية ، الخلايا الجذعية هي الخلايا المتجددة للجسم ، ولا يتناقص عددها ووظائفها بمرور الوقت لحماية سكانها. هذه الخلايا متخصصة ولكن يمكن أن تتمايز عند التحفيز المناسب استجابة للإصابة 4,5. وفقا لفرضية الخلايا الجذعية ، فإن نظام الخلايا الجذعية يقع تحت تأثير بيئته المكروية ، والتي تسمى مكانة الخلايا الجذعية. إن الحفاظ على الخلايا الجذعية وتمييزها أمر مستحيل دون وجود بيئتها المكروية6 ، والتي يمكن إعادة تشكيلها عن طريق هندسة الأنسجة باستخدام الخلايا والسقالات7. هندسة الأنسجة هي مجال متعدد التخصصات يشمل مبادئ الهندسة والبيولوجيا. توفر هندسة الأنسجة أدوات لإنشاء الأنسجة الاصطناعية التي يمكن أن تحل محل الأنسجة الحية ويمكن استخدامها في تجديد هذه الأنسجة عن طريق إزالة الأنسجة التالفة وتوفير الأنسجة الوظيفية8. يتم إنتاج سقالات الأنسجة ، وهي واحدة من الركائز الأساسية الثلاثة لهندسة الأنسجة ، باستخدام طرق مختلفة من المواد الطبيعية والاصطناعية9. الطباعة ثلاثية الأبعاد (3D) هي تقنية تصنيع مضافة ناشئة تستخدم على نطاق واسع لاستبدال أو استعادة الأنسجة المعيبة من خلال إنتاجها البسيط ولكن متعدد الاستخدامات للأشكال المعقدة باستخدام طرق مختلفة. الطباعة الحيوية هي طريقة تصنيع مضافة تتيح التعايش بين الخلايا والمواد الحيوية ، تسمى bioinks10. بالنظر إلى تفاعل الخلايا العصبية مع بعضها البعض ، تحولت الدراسات إلى المواد الحيوية الموصلة المرشحة مثل الجرافين. تعتبر ألواح الجرافين النانوية ، التي لها خصائص مثل الإلكترونيات المرنة ، والمكثفات الفائقة ، والبطاريات ، والبصريات ، وأجهزة الاستشعار الكهروكيميائية ، وتخزين الطاقة ، مادة حيوية مفضلة في مجال هندسة الأنسجة11. تم استخدام الجرافين في الدراسات التي تم فيها إجراء تكاثر وتجديد الأنسجة والأعضاء التالفة12,13.
تتكون هندسة الأنسجة من ثلاث لبنات أساسية: السقالة والخلايا وجزيئات الإشارات الحيوية. هناك أوجه قصور في الدراسات حول تلف الأعصاب الطرفية من حيث توفير هذه الهياكل الثلاثة بالكامل. تمت مواجهة مشاكل مختلفة في المواد الحيوية المنتجة والمستخدمة في الدراسات ، مثل احتوائها على الخلايا الجذعية أو جزيئات الإشارات الحيوية فقط ، وعدم وجود جزيء نشط بيولوجيا يمكن من تمايز الخلايا الجذعية ، وعدم التوافق الحيوي للمادة الحيوية المستخدمة ، والتأثير المنخفض على تكاثر الخلايا في مكانة الأنسجة ، وبالتالي ، لا يتم تحقيق التوصيل العصبي بالكامل2،13،14،15،16. وهذا يتطلب تحسين تجديد الأعصاب ، والحد من ضمور العضلات17،18 ، وخلق صاروخ موجهضروري 19 مع عوامل النمو ضد مثل هذه المشاكل. في هذه المرحلة ، يعد توصيف وتحليل النشاط العصبي لنموذج أولي للمادة الحيوية الجراحية ، ليتم نقله إلى العيادة ، أمرا مهما للغاية.
وفقا لذلك ، تبحث دراسة الطرق هذه في نمط هيدروجيل الحبر الحيوي باستخدام ألواح الجرافين النانوية التي شكلتها طابعة حيوية 3D وفعاليتها على التمايز العصبي للخلايا الجذعية التي تحتوي عليها. أيضا ، يتم التحقيق في آثار الجرافين على تشكيل الغلاف العصبي والتمايز.
Protocol
Representative Results
Discussion
أصبحت مزايا العلاجات المطبقة مع سقالات 3D الهندسية على طرق 2D التقليدية أكثر وضوحا كل يوم. عادة ما تكون الخلايا الجذعية المستخدمة بمفردها في هذه العلاجات أو جنبا إلى جنب مع السقالات المنتجة من مواد حيوية مختلفة ذات توافق حيوي منخفض وقابلية للتحلل البيولوجي غير كافية في تجديد الأعصاب الطرفي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تطوير الجرافين المستخدم في هذه الدراسة في جامعة كيركلاريلي ، قسم الهندسة الميكانيكية. تم التبرع بها من قبل الدكتور كارابي أوغلو. تم تمويل اختبار سمية الجرافين من قبل مشروع بعنوان “طباعة وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة على طابعات حيوية ثلاثية الأبعاد مع أحبار حيوية مخدرة بالجرافين” (رقم الطلب: 1139B411802273) تم إكماله في نطاق برنامج دعم أطروحة البكالوريوس TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Description. تم دعم الجزء الآخر من الدراسة من خلال صندوق الأبحاث المقدم من مشاريع البحث العلمي بجامعة يلدز التقنية (TSA-2021-4713). تم التبرع بالخلايا الجذعية الوسيطة مع GFP المستخدمة في مرحلة التصوير بفاصل زمني بواسطة Virostem Biotechnology. يشكر المؤلفون فريق Darıcı LAB و YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB على المناقشات المثمرة.
Materials
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
- Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, (2019).
- Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
- Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195 (2021).
- Allahverdiyev, A. . Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , (2018).
- Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
- Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
- Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman’s Medical Cell Biology, Fourth Edition. , 361-380 (2021).
- Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
- Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
- Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).
- Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
- Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
- Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
- Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
- Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
- Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
- Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
- Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
- Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).
- Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
- Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
- Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
- Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
- Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658 (2019).
- Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
- Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).
- Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , (2020).
- Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
- Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
- Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
- Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
