Voorbereiding en karakterisering van op grafeen gebaseerde 3D biohybride hydrogel bioink voor perifere neuro-engineering

Summary

In dit manuscript demonstreren we de bereiding van een biohybride hydrogel bioink met grafeen voor gebruik in perifere tissue engineering. Met behulp van dit 3D-biohybride materiaal wordt het neurale differentiatieprotocol van stamcellen uitgevoerd. Dit kan een belangrijke stap zijn om vergelijkbare biomaterialen naar de kliniek te brengen.

Abstract

Perifere neuropathieën kunnen optreden als gevolg van axonale schade en soms als gevolg van demyeliniserende ziekten. Perifere zenuwbeschadiging is een wereldwijd probleem dat voorkomt bij 1,5% -5% van de spoedeisende hulppatiënten en kan leiden tot aanzienlijk banenverlies. Tegenwoordig zijn op tissue engineering gebaseerde benaderingen, bestaande uit steigers, geschikte cellijnen en biosignalen, meer toepasbaar geworden met de ontwikkeling van driedimensionale (3D) bioprinttechnologieën. De combinatie van verschillende hydrogel-biomaterialen met stamcellen, exosomen of bio-signalerende moleculen wordt vaak bestudeerd om de bestaande problemen bij perifere zenuwregeneratie te overwinnen. Dienovereenkomstig heeft de productie van injecteerbare systemen, zoals hydrogels, of implanteerbare buisstructuren gevormd door verschillende bioprintmethoden aan belang gewonnen in perifere neuro-engineering. Onder normale omstandigheden zijn stamcellen de regeneratieve cellen van het lichaam en hun aantal en functies nemen niet af met de tijd om hun populaties te beschermen; Dit zijn geen gespecialiseerde cellen, maar kunnen differentiëren bij passende stimulatie als reactie op letsel. Het stamcelsysteem staat onder invloed van zijn micro-omgeving, de stamcelniche genaamd. Bij perifere zenuwletsels, vooral bij neurotmese, kan deze micro-omgeving niet volledig worden gered, zelfs niet na het chirurgisch samenbinden van doorgesneden zenuwuiteinden. De benadering van samengestelde biomaterialen en gecombineerde cellulaire therapieën verhoogt de functionaliteit en toepasbaarheid van materialen in termen van verschillende eigenschappen zoals biologische afbreekbaarheid, biocompatibiliteit en verwerkbaarheid. Dienovereenkomstig heeft deze studie tot doel de bereiding en het gebruik van op grafeen gebaseerde biohybride hydrogelpatronen aan te tonen en de differentiatie-efficiëntie van stamcellen in zenuwcellen te onderzoeken, wat een effectieve oplossing kan zijn bij zenuwregeneratie.

Introduction

Het zenuwstelsel, het mechanisme dat de interne structuur van het organisme en de omgeving overbrugt, is verdeeld in twee delen: het centrale en perifere zenuwstelsel. Perifere zenuwbeschadiging is een wereldwijd probleem dat 1,5% -5% van de patiënten vormt die zich op de afdeling spoedeisende hulp presenteren en zich ontwikkelt als gevolg van verschillende trauma’s, wat leidt tot aanzienlijk baanverlies ^1,2,3.

Tegenwoordig zijn cellulaire benaderingen van perifere neuro-engineering van groot belang. Stamcellen komen op de eerste plaats onder de cellen die in deze benaderingen worden gebruikt. Onder normale omstandigheden zijn stamcellen de regeneratieve cellen van het lichaam en hun aantal en functies nemen niet af met de tijd om hun populaties te beschermen; Deze cellen zijn gespecialiseerd, maar kunnen differentiëren bij passende stimulatie als reactie op letsel ^4,5. Volgens de stamcelhypothese staat het stamcelsysteem onder invloed van zijn micro-omgeving, de stamcelniche genaamd. Het behoud en de differentiatie van stamcellen zijn onmogelijk zonder de aanwezigheid van hun micro-omgeving⁶, die kan worden gereconstitueerd via tissue engineering met behulp van cellen en steigers⁷. Tissue engineering is een multidisciplinair veld dat zowel technische als biologische principes omvat. Tissue engineering biedt hulpmiddelen voor het creëren van kunstmatige weefsels die levende weefsels kunnen vervangen en kan worden gebruikt bij de regeneratie van deze weefsels door de beschadigde weefsels te verwijderen en functionele weefsels te leveren⁸. Weefselsteigers, een van de drie hoekstenen van tissue engineering, worden geproduceerd met behulp van verschillende methoden van natuurlijke en synthetische materialen⁹. Driedimensionaal (3D) printen is een opkomende additieve productietechnologie die veel wordt gebruikt om defecte weefsels te vervangen of te herstellen via de eenvoudige maar veelzijdige productie van complexe vormen met behulp van verschillende methoden. Bioprinting is een additieve productiemethode die het naast elkaar bestaan van cellen en biomaterialen mogelijk maakt, genaamd bioinks¹⁰. Gezien de interactie van zenuwcellen met elkaar, zijn studies verschoven naar geleidende biomateriaalkandidaten zoals grafeen. Grafeen nanoplaten, die eigenschappen hebben zoals flexibele elektronica, supercondensatoren, batterijen, optica, elektrochemische sensoren en energieopslag, zijn een geprefereerd biomateriaal op het gebied van tissue engineering¹¹. Grafeen is gebruikt in studies waar de proliferatie en regeneratie van beschadigde weefsels en organen werden uitgevoerd^12,13.

Tissue engineering bestaat uit drie basisbouwstenen: steigers, cellen en biosignaalmoleculen. Er zijn tekortkomingen in de studies naar perifere zenuwbeschadiging in termen van het volledig verstrekken van deze drie structuren. Er zijn verschillende problemen ondervonden bij de biomaterialen die in de studies worden geproduceerd en gebruikt, zoals het feit dat ze alleen stamcellen of biosignaalmoleculen bevatten, het ontbreken van een bioactief molecuul dat stamceldifferentiatie mogelijk maakt, het gebrek aan biocompatibiliteit van het gebruikte biomateriaal en het lage effect op de proliferatie van cellen in de weefselniche, en dus wordt zenuwgeleiding niet volledig gerealiseerd 2,13,14,15,16. Dit vereist de optimalisatie van zenuwregeneratie, het verminderen van spieratrofie ^17,18 en het creëren van noodzakelijke homing¹⁹ met groeifactoren tegen dergelijke problemen. Op dit punt zijn de karakterisering en analyse van de neuro-activiteit van een chirurgisch biomateriaalprototype, dat naar de kliniek moet worden overgebracht, erg belangrijk.

Dienovereenkomstig onderzoekt deze methodestudie de bioink hydrogel-patronen met grafeennanoplaten gevormd door een 3D-bioprinter en de effectiviteit ervan op de neurogene differentiatie van de stamcellen die het bevat. Ook worden de effecten van grafeen op neurosfeervorming en differentiatie onderzocht.

Protocol

1. Kweken van Wharton’s gelei mesenchymale stamcellen Neem de gelei mesenchymale stamcellen van de Wharton (WJ-MSCs, van ATCC) uit een vriezer van −80 °C. Kweek WJ-MSC’s in DMEM-F12 medium met 10% foetaal kalfsserum (FBS), 1% Pen-Strep en 1% L-glutamine in een steriele laminaire stroom bij kamertemperatuur, zoals beschreven in Yurie et al.20. Cryopreserveer sommige cellen bij 1 x 106 cellen / ml met vriesmedium dat 35% FBS, 55% DMEMF-12 en 10% dim…

Representative Results

Grafeentoxiciteit en 2D-beeldvormingStatistische analyse van de verkregen MTT-resultaten werd uitgevoerd met een eenrichtings-ANOVA met Tukey’s test in statistische analysesoftware, en de verkregen grafiek is weergegeven in figuur 2. Het grafeenpercentage in vergelijking met de controle vertoonde alleen een significante daling voor de grafeenconcentratie van 0,001% (**p 0,05). D…

Discussion

De voordelen van behandelingen toegepast met technische 3D-steigers ten opzichte van conventionele 2D-methoden worden elke dag meer en meer merkbaar. Stamcellen die alleen in deze therapieën worden gebruikt of samen met steigers geproduceerd uit verschillende biomaterialen met een lage biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid zijn meestal ontoereikend bij perifere zenuwregeneratie. Wharton’s jelly mesenchymale stamcellen (WJ-MSCs) lijken een geschikte kandidaat-cellijn te zijn, vooral gezien de optimalisatie va…

Materials

Centrifugal	Hitachi		Used in cell culture and biomaterial step
0.1N CaCl2	HD Bioink		Used for crosslinker
0.22 µm membrane filter	Aιsιmo		Used for sterilization
0.45 µm syringe filter	Aιsιmo		Used for sterilization
1.5mL conic tube	Eppendorfa		Used for bioink drop
15mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
3D Bioprinting	Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey)		Bioprinting Step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit	Santa Cruz Biotechnology	J1514	Seconder antibody, used for dye
Anti mouse IgG-SC2781-goat	Santa Cruz Biotechnology	C3109	Seconder antibody, used for dye
Au coating device EM ACE600	Leica		for gold plating of biomaterial section before SEM imaging
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Cell Cultre Cabine	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM	Quanta	FEG 450	for SEM
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80°C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	We were used to store cells and the resulting exosomes
Gelatine-Alginate bioink powder	HD Bioink		Used for produced bioink step
GFP labelled-WJ-MSCs	Virostem		Used for imaging to cell-bioink interaction
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2)	Grafen Chemical Industries Co.		Used for production 3D-G bioink
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin)	Cell Signalling and Santa Cruz		Used for dye
JASCO 6600	Tetra		for FTIR
MTT Assay	Sigma		Viability testing
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Thoma slide	Isolab		Used for counting the cell
Time-Lapse Imaging System	Zeiss Axio.Observer.Z1		Imaging
Tripsin-EDTA	Multicell		The flask was used to remove the cells covering the surface.
Vorteks	Biobase		For produced bioink step
WJ-MSCs	ATCC		Used for the cell culture process