Fremstilling og karakterisering av grafenbasert 3D biohybrid hydrogelbioblekk for perifer nevroteknologi

Summary

I dette manuskriptet demonstrerer vi fremstillingen av et biohybrid hydrogelbioblekk som inneholder grafen til bruk i perifer vevsteknikk. Ved hjelp av dette 3D biohybridmaterialet utføres den nevrale differensieringsprotokollen for stamceller. Dette kan være et viktig skritt i å bringe lignende biomaterialer til klinikken.

Abstract

Perifere nevropatier kan oppstå som følge av aksonal skade, og noen ganger på grunn av demyeliniserende sykdommer. Perifer nerveskade er et globalt problem som oppstår hos 1,5% -5% av akuttpasienter og kan føre til betydelig tap av jobb. I dag har vevsteknikkbaserte tilnærminger, bestående av stillas, passende cellelinjer og biosignaler, blitt mer anvendelige med utviklingen av tredimensjonale (3D) bioprintingsteknologier. Kombinasjonen av forskjellige hydrogelbiomaterialer med stamceller, eksosomer eller biosignalmolekyler studeres ofte for å overvinne de eksisterende problemene i perifer nerveregenerering. Følgelig har produksjonen av injiserbare systemer, for eksempel hydrogeler, eller implanterbare ledningsstrukturer dannet ved ulike bioprintingsmetoder, fått betydning i perifer nevroteknikk. Under normale forhold er stamceller kroppens regenerative celler, og deres antall og funksjoner reduseres ikke med tiden for å beskytte deres populasjoner; Disse er ikke spesialiserte celler, men kan differensiere ved passende stimulering som respons på skade. Stamcellesystemet er under påvirkning av sitt mikromiljø, kalt stamcellenisjen. I perifere nerveskader, spesielt i neurotmesis, kan dette mikromiljøet ikke reddes fullt ut selv etter kirurgisk binding av avskårne nerveender sammen. Den sammensatte biomaterial- og kombinerte cellulære terapitilnærmingen øker funksjonaliteten og anvendeligheten til materialer når det gjelder forskjellige egenskaper som biologisk nedbrytbarhet, biokompatibilitet og bearbeidbarhet. Følgelig har denne studien som mål å demonstrere fremstilling og bruk av grafenbasert biohybrid hydrogelmønster og å undersøke differensieringseffektiviteten av stamceller i nerveceller, noe som kan være en effektiv løsning i nerveregenerering.

Introduction

Nervesystemet, som er mekanismen som broer den indre strukturen til organismen og miljøet, er delt inn i to deler: det sentrale og perifere nervesystemet. Perifer nerveskade er et globalt problem som utgjør 1,5% -5% av pasientene som kommer til beredskapsavdelingen og utvikler seg på grunn av ulike traumer, noe som fører til betydelig jobbtap ^1,2,3.

I dag er cellulære tilnærminger til perifer nevroteknikk av stor interesse. Stamceller kommer først blant cellene som brukes i disse tilnærmingene. Under normale forhold er stamceller kroppens regenerative celler, og deres antall og funksjoner reduseres ikke med tiden for å beskytte deres populasjoner; Disse cellene er spesialiserte, men kan differensiere ved passende stimulering som respons på skade ^4,5. Ifølge stamcellehypotesen er stamcellesystemet under påvirkning av sitt mikromiljø, kalt stamcellenisjen. Bevaring og differensiering av stamceller er umulig uten tilstedeværelse av deres mikromiljø⁶, som kan rekonstitueres via vevsteknikk ved hjelp av celler og stillaser⁷. Tissue engineering er et tverrfaglig felt som inkluderer både engineering og biologi prinsipper. Tissue engineering gir verktøy for å lage kunstige vev som kan erstatte levende vev og kan brukes i regenerering av disse vevene ved å fjerne det skadede vevet og gi funksjonelle vev⁸. Vevsstillas, en av de tre hjørnesteinene i vevsteknikk, produseres ved hjelp av forskjellige metoder fra naturlige og syntetiske materialer⁹. Tredimensjonal (3D) utskrift er en fremvoksende additiv produksjonsteknologi som er mye brukt til å erstatte eller gjenopprette defekte vev via sin enkle, men allsidige produksjon av komplekse former ved hjelp av ulike metoder. Bioprinting er en additiv produksjonsmetode som muliggjør sameksistens av celler og biomaterialer, kalt bioblekk¹⁰. Tatt i betraktning samspillet mellom nerveceller med hverandre, har studier skiftet til ledende biomaterialkandidater som grafen. Grafen nanoplater, som har egenskaper som fleksibel elektronikk, superkondensatorer, batterier, optikk, elektrokjemiske sensorer og energilagring, er et foretrukket biomateriale innen vevsteknikk¹¹. Grafen har blitt brukt i studier hvor spredning og regenerering av skadede vev og organer ble utført^12,13.

Vevsteknikk består av tre grunnleggende byggesteiner: stillas, celler og biosignalmolekyler. Det er mangler i studiene på perifer nerveskade når det gjelder å gi disse tre strukturene helt. Ulike problemer har oppstått i biomaterialene som er produsert og brukt i studiene, for eksempel at de bare inneholder stamceller eller biosignalmolekyler, mangelen på et bioaktivt molekyl som vil muliggjøre stamcelledifferensiering, mangelen på biokompatibilitet av det biomaterialet som brukes, og den lave effekten på spredning av celler i vevnisjen, og dermed nerveledning ikke fullt ut realisert 2,13,14,15,16. Dette krever optimalisering av nerveregenerering, reduksjon av muskelatrofi 17,18^, og skape nødvendig homing¹⁹ med vekstfaktorer mot slike problemer. På dette tidspunktet er karakterisering og analyse av nevroaktiviteten til en kirurgisk biomaterialprototype, som skal overføres til klinikken, svært viktig.

Følgelig undersøker denne metodestudien bioblekkhydrogelmønsteret med grafennanoplater dannet av en 3D-bioprinter og dens effektivitet på den neurogene differensieringen av stamcellene den inneholder. Også effekten av grafen på nevrosfæredannelse og differensiering undersøkes.

Protocol

1. Dyrking av Whartons gelé mesenkymale stamceller Ta Whartons gelé mesenkymale stamceller (WJ-MSCs, fra ATCC) ut av en -80 ° C fryser. Kultur WJ-MSC i DMEM-F12 medium inneholdende 10% føtal kalv serum (FBS), 1% Pen-Strep, og 1% L-glutamin i en steril laminær strømning ved romtemperatur, som beskrevet i Yurie et al.20. Kryokonreservere noen av cellene ved 1 x 106 celler/ml med frysemedium inneholdende 35% FBS, 55% DMEMF-12 og 10% dimetylsulfoks…

Representative Results

Grafen toksisitet og 2D-bildebehandlingStatistisk analyse av de oppnådde MTT-resultatene ble utført med en enveis ANOVA med Tukeys test i statistisk analyseprogramvare, og grafen som er oppnådd er vist i figur 2. Grafenprosenten sammenlignet med kontrollen viste en signifikant reduksjon bare for 0,001% grafenkonsentrasjonen (**p 0,05). Derfor ble den optimale grafenkonsen…

Discussion

Fordelene med behandlinger påført med konstruerte 3D-stillaser i forhold til konvensjonelle 2D-metoder blir mer og mer merkbare hver dag. Stamceller som brukes alene i disse terapiene eller sammen med stillaser produsert fra forskjellige biomaterialer med lav biokompatibilitet og biologisk nedbrytbarhet, er vanligvis utilstrekkelige i perifer nerveregenerering. Whartons gelé mesenkymale stamceller (WJ-MSCs) ser ut til å være en egnet kandidatcellelinje, spesielt med tanke på optimalisering av protokollene for oppkj…

Materials

Centrifugal	Hitachi		Used in cell culture and biomaterial step
0.1N CaCl2	HD Bioink		Used for crosslinker
0.22 µm membrane filter	Aιsιmo		Used for sterilization
0.45 µm syringe filter	Aιsιmo		Used for sterilization
1.5mL conic tube	Eppendorfa		Used for bioink drop
15mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
3D Bioprinting	Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey)		Bioprinting Step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit	Santa Cruz Biotechnology	J1514	Seconder antibody, used for dye
Anti mouse IgG-SC2781-goat	Santa Cruz Biotechnology	C3109	Seconder antibody, used for dye
Au coating device EM ACE600	Leica		for gold plating of biomaterial section before SEM imaging
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Cell Cultre Cabine	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM	Quanta	FEG 450	for SEM
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80°C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	We were used to store cells and the resulting exosomes
Gelatine-Alginate bioink powder	HD Bioink		Used for produced bioink step
GFP labelled-WJ-MSCs	Virostem		Used for imaging to cell-bioink interaction
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2)	Grafen Chemical Industries Co.		Used for production 3D-G bioink
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin)	Cell Signalling and Santa Cruz		Used for dye
JASCO 6600	Tetra		for FTIR
MTT Assay	Sigma		Viability testing
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Thoma slide	Isolab		Used for counting the cell
Time-Lapse Imaging System	Zeiss Axio.Observer.Z1		Imaging
Tripsin-EDTA	Multicell		The flask was used to remove the cells covering the surface.
Vorteks	Biobase		For produced bioink step
WJ-MSCs	ATCC		Used for the cell culture process