Preparação e caracterização de biotinta de hidrogel biohíbrido 3D à base de grafeno para neuroengenharia periférica

Summary

Neste manuscrito, demonstramos a preparação de uma biotinta hidrogel biohíbrida contendo grafeno para uso em engenharia de tecidos periféricos. Utilizando este material biohíbrido 3D, é realizado o protocolo de diferenciação neural de células-tronco. Este pode ser um passo importante para trazer biomateriais semelhantes para a clínica.

Abstract

Neuropatias periféricas podem ocorrer como resultado de dano axonal e, ocasionalmente, devido a doenças desmielinizantes. A lesão dos nervos periféricos é um problema global que ocorre em 1,5%-5% dos pacientes de emergência e pode levar a perdas significativas de empregos. Hoje, as abordagens baseadas em engenharia de tecidos, consistindo em arcabouços, linhagens celulares apropriadas e biossinais, tornaram-se mais aplicáveis com o desenvolvimento de tecnologias de bioimpressão tridimensional (3D). A combinação de vários biomateriais de hidrogel com células-tronco, exossomos ou moléculas de biosinalização é frequentemente estudada para superar os problemas existentes na regeneração de nervos periféricos. Nesse sentido, a produção de sistemas injetáveis, como hidrogéis, ou estruturas de condutos implantáveis formadas por diversos métodos de bioimpressão tem ganhado importância na neuroengenharia periférica. Em condições normais, as células-tronco são as células regenerativas do corpo, e seu número e funções não diminuem com o tempo para proteger suas populações; Estas não são células especializadas, mas podem se diferenciar mediante estimulação apropriada em resposta à lesão. O sistema de células-tronco está sob a influência de seu microambiente, chamado de nicho de células-tronco. Nas lesões nervosas periféricas, especialmente na neurotmese, esse microambiente não pode ser totalmente resgatado mesmo após a ligação cirúrgica das terminações nervosas cortadas. A abordagem de biomateriais compósitos e terapias celulares combinadas aumenta a funcionalidade e aplicabilidade dos materiais em termos de várias propriedades, como biodegradabilidade, biocompatibilidade e processabilidade. Nesse sentido, este estudo tem como objetivo demonstrar a preparação e o uso de padrões de hidrogel biohíbrido à base de grafeno e examinar a eficiência da diferenciação de células-tronco em células nervosas, o que pode ser uma solução eficaz na regeneração nervosa.

Introduction

O sistema nervoso, que é o mecanismo que faz a ponte entre a estrutura interna do organismo e o ambiente, é dividido em duas partes: o sistema nervoso central e o periférico. A lesão dos nervos periféricos é um problema global que constitui 1,5%-5% dos pacientes que chegam ao pronto-socorro e se desenvolve devido a vários traumas, levando à perda significativa do emprego ^1,2,3.

Atualmente, as abordagens celulares da neuroengenharia periférica são de grande interesse. As células-tronco vêm em primeiro lugar entre as células usadas nessas abordagens. Em condições normais, as células-tronco são as células regenerativas do corpo, e seu número e funções não diminuem com o tempo para proteger suas populações; Essas células são especializadas, mas podem se diferenciar mediante estimulação apropriada em resposta à^lesão4,5. De acordo com a hipótese das células-tronco, o sistema de células-tronco está sob a influência de seu microambiente, chamado nicho de células-tronco. A preservação e diferenciação das células-tronco são impossíveis sem a presença de seu^{microambiente6}, que pode ser reconstituído via engenharia tecidual utilizando células e scaffolds⁷. A engenharia de tecidos é um campo multidisciplinar que inclui princípios de engenharia e biologia. A engenharia tecidual fornece ferramentas para a criação de tecidos artificiais que podem substituir tecidos vivos e podem ser usados na regeneração desses tecidos, removendo os tecidos danificados e fornecendo tecidos funcionais⁸. Os arcabouços teciduais, um dos três pilares da engenharia de tecidos, são produzidos por diferentes métodos a partir de materiais naturais e sintéticos⁹. A impressão tridimensional (3D) é uma tecnologia emergente de manufatura aditiva que é amplamente utilizada para substituir ou restaurar tecidos defeituosos através de sua produção simples, mas versátil, de formas complexas usando vários métodos. A bioimpressão é um método de manufatura aditiva que possibilita a coexistência de células e biomateriais, denominados biotintas¹⁰. Considerando a interação das células nervosas entre si, os estudos mudaram para candidatos a biomateriais condutores, como o grafeno. As nanoplacas de grafeno, que possuem propriedades como eletrônica flexível, supercapacitores, baterias, óptica, sensores eletroquímicos e armazenamento de energia, são um biomaterial preferido no campo da engenharia de tecidos¹¹. O grafeno tem sido utilizado em estudos onde foi realizada a proliferação e regeneração de tecidos e órgãos lesados^12,13.

A engenharia de tecidos consiste em três blocos de construção básicos: arcabouço, células e moléculas de biossíntese. Existem deficiências nos estudos sobre lesão de nervos periféricos em termos de fornecer essas três estruturas completamente. Vários problemas têm sido encontrados nos biomateriais produzidos e utilizados nos estudos, como o de conter apenas células-tronco ou moléculas de biossinais, a falta de uma molécula bioativa que permita a diferenciação com células-tronco, a falta de biocompatibilidade do biomaterial utilizado e o baixo efeito sobre a proliferação de células no nicho tecidual, e, assim, a condução nervosa não sendo totalmente realizada 2,13,14,15,16. Isso requer a otimização da regeneração nervosa, reduzindo a atrofia muscular ^17,18 e criando homing necessário¹⁹ com fatores de crescimento contra tais problemas. Nesse ponto, a caracterização e análise da neuroatividade de um protótipo de biomaterial cirúrgico, a ser transferido para a clínica, são muito importantes.

Nesse sentido, este estudo investiga a padronização de hidrogel de biotinta com nanoplacas de grafeno formadas por uma bioimpressora 3D e sua eficácia na diferenciação neurogênica das células-tronco que contém. Além disso, os efeitos do grafeno na formação e diferenciação da neuroesfera são investigados.

Protocol

1. Cultura de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton Retire as células-tronco mesenquimais gelatinosas da Wharton (WJ-MSCs, da ATCC) de um freezer de -80 °C. Culturas de CTMs-WJ em meio DMEM-F12 contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), 1% de Pen-Strep e 1% de L-glutamina em fluxo laminar estéril à temperatura ambiente, conforme descrito em Yurie et al.20. Criopreservar algumas células a 1 x 106 células/mL com meio de congelamento c…

Representative Results

Toxicidade do grafeno e imagens 2DA análise estatística dos resultados obtidos do MTT foi realizada com ANOVA one-way com teste de Tukey em software de análise estatística, e o gráfico obtido encontra-se na Figura 2. A porcentagem de grafeno em relação ao controle apresentou decréscimo significativo apenas para a concentração de grafeno a 0,001% (**p 0,05). Portanto, a conce…

Discussion

As vantagens dos tratamentos aplicados com andaimes 3D projetados em relação aos métodos 2D convencionais estão se tornando cada vez mais perceptíveis a cada dia. Células-tronco usadas isoladamente nessas terapias ou em conjunto com arcabouços produzidos a partir de vários biomateriais com baixa biocompatibilidade e biodegradabilidade são geralmente inadequadas na regeneração de nervos periféricos. As células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton (CTMs-WJ) parecem ser uma linhagem celular candidata adeq…

Materials

Centrifugal	Hitachi		Used in cell culture and biomaterial step
0.1N CaCl2	HD Bioink		Used for crosslinker
0.22 µm membrane filter	Aιsιmo		Used for sterilization
0.45 µm syringe filter	Aιsιmo		Used for sterilization
1.5mL conic tube	Eppendorfa		Used for bioink drop
15mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
3D Bioprinting	Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey)		Bioprinting Step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit	Santa Cruz Biotechnology	J1514	Seconder antibody, used for dye
Anti mouse IgG-SC2781-goat	Santa Cruz Biotechnology	C3109	Seconder antibody, used for dye
Au coating device EM ACE600	Leica		for gold plating of biomaterial section before SEM imaging
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Cell Cultre Cabine	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM	Quanta	FEG 450	for SEM
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80°C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	We were used to store cells and the resulting exosomes
Gelatine-Alginate bioink powder	HD Bioink		Used for produced bioink step
GFP labelled-WJ-MSCs	Virostem		Used for imaging to cell-bioink interaction
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2)	Grafen Chemical Industries Co.		Used for production 3D-G bioink
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin)	Cell Signalling and Santa Cruz		Used for dye
JASCO 6600	Tetra		for FTIR
MTT Assay	Sigma		Viability testing
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Thoma slide	Isolab		Used for counting the cell
Time-Lapse Imaging System	Zeiss Axio.Observer.Z1		Imaging
Tripsin-EDTA	Multicell		The flask was used to remove the cells covering the surface.
Vorteks	Biobase		For produced bioink step
WJ-MSCs	ATCC		Used for the cell culture process