Получение и характеристика 3D-биогибридных гидрогелевых биочернил на основе графена для периферической нейроинженерии
Summary
В этой рукописи мы демонстрируем получение биогибридных гидрогелевых биочернил, содержащих графен, для использования в инженерии периферических тканей. С помощью этого 3D-биогибридного материала выполняется протокол нейронной дифференцировки стволовых клеток. Это может стать важным шагом в привлечении подобных биоматериалов в клинику.
Abstract
Периферические невропатии могут возникать в результате повреждения аксонов, а иногда и из-за демиелинизирующих заболеваний. Повреждение периферических нервов является глобальной проблемой, которая возникает у 1,5-5% пациентов неотложной помощи и может привести к значительным потерям работы. Сегодня подходы, основанные на тканевой инженерии, состоящие из каркасов, соответствующих клеточных линий и биосигналов, стали более применимыми с развитием технологий трехмерной (3D) биопечати. Комбинация различных гидрогелевых биоматериалов со стволовыми клетками, экзосомами или биосигнальными молекулами часто изучается для преодоления существующих проблем в регенерации периферических нервов. Соответственно, производство инъекционных систем, таких как гидрогели, или имплантируемых кондуитных структур, образованных различными методами биопечати, приобрело важное значение в периферической нейроинженерии. В нормальных условиях стволовые клетки являются регенеративными клетками организма, и их количество и функции не уменьшаются со временем, чтобы защитить их популяции; Они не являются специализированными клетками, но могут дифференцироваться при соответствующей стимуляции в ответ на травму. Система стволовых клеток находится под влиянием своего микроокружения, называемого нишей стволовых клеток. При повреждениях периферических нервов, особенно при невротмезисе, это микроокружение не может быть полностью спасено даже после хирургического связывания разорванных нервных окончаний вместе. Композитные биоматериалы и комбинированная клеточная терапия повышают функциональность и применимость материалов с точки зрения различных свойств, таких как биоразлагаемость, биосовместимость и технологичность. Соответственно, это исследование направлено на демонстрацию приготовления и использования биогибридного гидрогеля на основе графена и изучение эффективности дифференцировки стволовых клеток в нервные клетки, что может быть эффективным решением в регенерации нервов.
Introduction
Нервная система, которая является механизмом, соединяющим внутреннюю структуру организма и окружающей среды, делится на две части: центральную и периферическую нервные системы. Повреждение периферических нервов является глобальной проблемой, которая составляет 1,5-5% пациентов, поступающих в отделение неотложной помощи, и развивается из-за различных травм, что приводит к значительной потере работы 1,2,3.
Сегодня клеточные подходы к периферической нейроинженерии представляют большой интерес. Стволовые клетки занимают первое место среди клеток, используемых в этих подходах. В нормальных условиях стволовые клетки являются регенеративными клетками организма, и их количество и функции не уменьшаются со временем, чтобы защитить их популяции; Эти клетки являются специализированными, но могут дифференцироваться при соответствующей стимуляции в ответ на повреждение 4,5. Согласно гипотезе стволовых клеток, система стволовых клеток находится под влиянием своего микроокружения, называемого нишей стволовых клеток. Сохранение и дифференцировка стволовых клеток невозможны без присутствия их микроокружения6, которое может быть восстановлено с помощью тканевой инженерии с использованием клеток и скаффолдов7. Тканевая инженерия — это междисциплинарная область, которая включает в себя как инженерные, так и биологические принципы. Тканевая инженерия предоставляет инструменты для создания искусственных тканей, которые могут заменить живые ткани и могут быть использованы для регенерации этих тканей путем удаления поврежденных тканей и обеспечения функциональных тканей8. Тканевые каркасы, один из трех краеугольных камней тканевой инженерии, производятся с использованием различных методов из натуральных и синтетических материалов9. Трехмерная (3D) печать — это новая технология аддитивного производства, которая широко используется для замены или восстановления дефектных тканей с помощью простого, но универсального производства сложных форм с использованием различных методов. Биопечать — это метод аддитивного производства, который обеспечивает сосуществование клеток и биоматериалов, называемых биочернилами10. Рассматривая взаимодействие нервных клеток друг с другом, исследования перешли к проводящим биоматериалам-кандидатам, таким как графен. Графеновые нанопластины, обладающие такими свойствами, как гибкая электроника, суперконденсаторы, батареи, оптика, электрохимические датчики и накопители энергии, являются предпочтительным биоматериалом в области тканевой инженерии11. Графен использовался в исследованиях, где проводилась пролиферация и регенерация поврежденных тканей и органов12,13.
Тканевая инженерия состоит из трех основных строительных блоков: каркаса, клеток и молекул биосигнала. Существуют недостатки в исследованиях повреждения периферических нервов с точки зрения полного обеспечения этих трех структур. В биоматериалах, производимых и используемых в исследованиях, были обнаружены различные проблемы, такие как те, которые содержат только стволовые клетки или биосигнальные молекулы, отсутствие биологически активной молекулы, которая позволила бы дифференцировать стволовые клетки, отсутствие биосовместимости используемого биоматериала и низкое влияние на пролиферацию клеток в тканевой нише, и, таким образом, нервная проводимость не полностью реализована 2,13,14,15,16. Это требует оптимизации регенерации нервов, уменьшения мышечной атрофии 17,18 и создания необходимого самонаведения19 с факторами роста против таких проблем. На этом этапе очень важны характеристика и анализ нейроактивности прототипа хирургического биоматериала, который должен быть передан в клинику.
Соответственно, в этом исследовании исследуется паттерн биочернил гидрогеля с графеновыми нанопластинами, сформированными 3D-биопринтером, и его эффективность в отношении нейрогенной дифференцировки стволовых клеток, которые он содержит. Также исследуется влияние графена на формирование и дифференцировку нейросферы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Преимущества лечения, применяемого с помощью инженерных 3D-каркасов, по сравнению с традиционными 2D-методами становятся все более заметными с каждым днем. Стволовые клетки, используемые отдельно в этих методах лечения или вместе со скаффолдами, полученными из различных биоматериалов с…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Графен, используемый в этом исследовании, был разработан в Университете Киркларели, на факультете машиностроения. Он был подарен доктором Карабейоглу. Испытание на токсичность графена финансировалось в рамках проекта под названием «Печать и дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток на 3D-биопринтерах с помощью биочернил, легированных графеном» (No заявки: 1139B411802273), завершенного в рамках программы поддержки дипломных работ TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented для студентов. Другая часть исследования была поддержана исследовательским фондом, предоставленным научно-исследовательскими проектами Технического университета Йылдыз (TSA-2021-4713). Мезенхимальные стволовые клетки с GFP, используемые на этапе покадровой визуализации, были безвозмездно предоставлены компанией Virostem Biotechnology. Авторы благодарят Darıcı LAB и команду YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB за продуктивные обсуждения.
Materials
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
- Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, (2019).
- Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
- Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195 (2021).
- Allahverdiyev, A. . Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , (2018).
- Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
- Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
- Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman’s Medical Cell Biology, Fourth Edition. , 361-380 (2021).
- Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
- Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
- Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).
- Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
- Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
- Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
- Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
- Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
- Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
- Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
- Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
- Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).
- Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
- Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
- Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
- Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
- Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658 (2019).
- Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
- Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).
- Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , (2020).
- Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
- Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
- Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
- Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
