Beredning och karakterisering av grafenbaserat 3D-biohybridhydrogelbiobläck för perifer neuroengineering
Summary
I detta manuskript demonstrerar vi beredningen av ett biohybridhydrogelbiobläck innehållande grafen för användning inom perifer vävnadsteknik. Med hjälp av detta 3D-biohybridmaterial utförs stamcellernas neurala differentieringsprotokoll. Detta kan vara ett viktigt steg för att få liknande biomaterial till kliniken.
Abstract
Perifer neuropatier kan uppstå som ett resultat av axonal skada, och ibland på grund av demyeliniserande sjukdomar. Perifer nervskada är ett globalt problem som uppstår hos 1,5% -5% av akutpatienterna och kan leda till betydande förluster av arbetstillfällen. Idag har vävnadsteknikbaserade tillvägagångssätt, bestående av byggnadsställningar, lämpliga cellinjer och biosignaler, blivit mer tillämpliga med utvecklingen av tredimensionell (3D) bioprintningsteknik. Kombinationen av olika hydrogelbiomaterial med stamceller, exosomer eller biosignalmolekyler studeras ofta för att övervinna de befintliga problemen vid perifer nervregenerering. Följaktligen har produktionen av injicerbara system, såsom hydrogeler eller implanterbara ledningsstrukturer bildade av olika bioprintingmetoder fått betydelse i perifer neuroteknik. Under normala förhållanden är stamceller kroppens regenerativa celler, och deras antal och funktioner minskar inte med tiden för att skydda sina populationer. Dessa är inte specialiserade celler men kan differentieras vid lämplig stimulering som svar på skada. Stamcellssystemet påverkas av sin mikromiljö, kallad stamcellsnischen. Vid perifera nervskador, särskilt vid neurotmesis, kan denna mikromiljö inte räddas helt även efter att kirurgiskt ha bundit ihop avskurna nervändar. De sammansatta biomaterialen och kombinerade cellulära terapier ökar funktionaliteten och tillämpligheten av material när det gäller olika egenskaper såsom biologisk nedbrytbarhet, biokompatibilitet och bearbetbarhet. Följaktligen syftar denna studie till att demonstrera beredning och användning av grafenbaserad biohybridhydrogelmönstring och att undersöka differentieringseffektiviteten hos stamceller i nervceller, vilket kan vara en effektiv lösning vid nervregenerering.
Introduction
Nervsystemet, som är den mekanism som överbryggar organismens och miljöns inre struktur, är uppdelad i två delar: centrala och perifera nervsystemet. Perifer nervskada är ett globalt problem som utgör 1,5% -5% av patienterna som kommer till akutavdelningen och utvecklas på grund av olika traumor, vilket leder till betydande arbetsförlust 1,2,3.
Idag är cellulära tillvägagångssätt för perifer neuroteknik av stort intresse. Stamceller kommer först bland de celler som används i dessa metoder. Under normala förhållanden är stamceller kroppens regenerativa celler, och deras antal och funktioner minskar inte med tiden för att skydda sina populationer. Dessa celler är specialiserade men kan differentieras vid lämplig stimulering som svar på skada 4,5. Enligt stamcellshypotesen påverkas stamcellssystemet av sin mikromiljö, kallad stamcellsnischen. Bevarande och differentiering av stamceller är omöjligt utan närvaro av deras mikromiljö6, som kan rekonstitueras via vävnadsteknik med hjälp av celler och byggnadsställningar7. Vävnadsteknik är ett tvärvetenskapligt område som omfattar både tekniska och biologiska principer. Vävnadsteknik tillhandahåller verktyg för att skapa konstgjorda vävnader som kan ersätta levande vävnader och kan användas vid regenerering av dessa vävnader genom att avlägsna skadade vävnader och tillhandahålla funktionella vävnader8. Vävnadsställningar, en av vävnadsteknikens tre hörnstenar, tillverkas med olika metoder från naturliga och syntetiska material9. Tredimensionell (3D) utskrift är en framväxande additiv tillverkningsteknik som ofta används för att ersätta eller återställa defekta vävnader via sin enkla men mångsidiga produktion av komplexa former med olika metoder. Bioprinting är en additiv tillverkningsmetod som möjliggör samexistens av celler och biomaterial, så kallade biobläck10. Med tanke på nervcellernas interaktion med varandra har studier skiftat till ledande biomaterialkandidater som grafen. Grafennanoplattor, som har egenskaper som flexibel elektronik, superkondensatorer, batterier, optik, elektrokemiska sensorer och energilagring, är ett föredraget biomaterial inom vävnadsteknik11. Grafen har använts i studier där spridning och regenerering av skadade vävnader och organ utfördes12,13.
Vävnadsteknik består av tre grundläggande byggstenar: byggnadsställningar, celler och biosignalmolekyler. Det finns brister i studierna om perifera nervskador när det gäller att tillhandahålla dessa tre strukturer helt. Olika problem har uppstått i de biomaterial som produceras och används i studierna, såsom att de endast innehåller stamceller eller biosignalmolekyler, bristen på en bioaktiv molekyl som möjliggör stamcellsdifferentiering, bristen på biokompatibilitet hos det biomaterial som används och den låga effekten på spridningen av celler i vävnadsnischen, och därmed nervledning inte realiseras fullt ut 2,13,14,15,16. Detta kräver optimering av nervregenerering, minskning av muskelatrofi 17,18 och skapande av nödvändig homing19 med tillväxtfaktorer mot sådana problem. Vid denna tidpunkt är karakterisering och analys av neuroaktiviteten hos en kirurgisk biomaterialprototyp, som ska överföras till kliniken, mycket viktig.
Följaktligen undersöker denna metodstudie biobläckhydrogelmönstringen med grafennanoplattor bildade av en 3D-bioprinter och dess effektivitet på den neurogena differentieringen av stamcellerna den innehåller. Dessutom undersöks effekterna av grafen på neurosfärbildning och differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fördelarna med behandlingar som tillämpas med konstruerade 3D-ställningar jämfört med konventionella 2D-metoder blir mer och mer märkbara varje dag. Stamceller som används ensamma i dessa terapier eller tillsammans med byggnadsställningar framställda av olika biomaterial med låg biokompatibilitet och biologisk nedbrytbarhet är vanligtvis otillräckliga vid perifer nervregenerering. Whartons jelly mesenkymala stamceller (WJ-MSC) verkar vara en lämplig kandidatcellinje, särskilt med tanke på optimeringen av p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grafen som används i denna studie har utvecklats vid Kirklareli University, Institutionen för maskinteknik. Det donerades av Dr. Karabeyoğlu. Grafentoxicitetstestet finansierades av projektet med titeln “Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks” (Application No: 1139B411802273) som slutfördes inom ramen för TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program. Den andra delen av studien stöddes av forskningsfonden från Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Mesenkymala stamceller med GFP som används i time-lapse-avbildningsstadiet donerades av Virostem Biotechnology. Författarna tackar Darıcı LAB och YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB-teamet för produktiva diskussioner.
Materials
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
- Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, (2019).
- Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
- Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195 (2021).
- Allahverdiyev, A. . Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , (2018).
- Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
- Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
- Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman’s Medical Cell Biology, Fourth Edition. , 361-380 (2021).
- Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
- Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
- Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743 (2021).
- Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
- Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
- Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
- Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
- Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
- Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
- Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
- Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
- Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448 (2017).
- Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
- Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
- Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
- Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
- Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658 (2019).
- Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
- Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789 (2013).
- Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , (2020).
- Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
- Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
- Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
- Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
