יצירת מפרק ברך על שבב למידול מחלות מפרקים ובדיקת תרופות
Summary
אנו מספקים שיטות מפורטות ליצירת ארבעה סוגים של רקמות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים, המשמשים לשחזור הסחוס, העצם, כרית השומן והסינוביום במפרק הברך האנושי. ארבע רקמות אלה משולבות בביוריאקטור מותאם אישית ומחוברות באמצעות מיקרופלואידיקה, ובכך יוצרות מפרק ברך על שבב.
Abstract
השכיחות הגבוהה של מחלות מפרקים מתישות כמו דלקת מפרקים ניוונית (OA) מהווה נטל סוציו-אקונומי גבוה. נכון לעכשיו, התרופות הזמינות המכוונות להפרעות מפרקים הן בעיקר פליאטיביות. הצורך הבלתי מסופק בתרופות OA יעילות משנות מחלה (DMOADs) נגרם בעיקר על ידי היעדר מודלים מתאימים לחקר מנגנוני המחלה ובדיקת DMOADs פוטנציאליים. במאמר זה נתאר את הקמתה של מערכת מיקרופיזיולוגית סינוביאלית זעירה המחקה מפרקים (miniJoint) הכוללת רכיבי רקמה שומניים, סיביים ואוסטאוכונדרליים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים אנושיים (MSCs). כדי להשיג את המיקרו-רקמות התלת-ממדיות (3D), MSCs היו עטופים בג’לטין מתקרילט הניתן להצלבה לפני או אחרי התמיינות זו. מבני הרקמה עמוסי התאים שולבו אז בביוריאקטור שהודפס בתלת-ממד, ויצרו את המיני-ג’וינט. זרמים נפרדים של מדיה אוסטאוגנית, פיברוגנית ואדיפוגנית הוכנסו כדי לשמור על פנוטיפים של רקמות בהתאמה. זרם משותף נפוץ חודר דרך רקמות הסחוס, הסינוביאליות והשומן כדי לאפשר הצלבת רקמות. דפוס זרימה זה מאפשר השראת הפרעות באחד או יותר ממרכיבי הרקמה למחקרים מכניסטיים. יתר על כן, ניתן לבדוק DMOAD פוטנציאלי באמצעות “מתן מערכתי” דרך כל הזרמים הבינוניים או “מתן תוך מפרקי” על ידי הוספת התרופות רק לזרימה המדמה “נוזל סינוביאלי” משותף. לפיכך, המיני-ג’וינט יכול לשמש כפלטפורמה רב-תכליתית במבחנה ללימוד יעיל של מנגנוני מחלה ובדיקת תרופות ברפואה מותאמת אישית.
Introduction
מחלות מפרקים כמו דלקת מפרקים ניוונית (OA) שכיחות מאוד ומתישות ומייצגות גורם מוביל לנכות ברחבי העולם1. ההערכה היא כי בארה”ב לבדה, OA משפיע על 27 מיליון חולים ומופיע אצל 12.1% מהמבוגרים בגילאי 60 ומעלהשנתיים. למרבה הצער, רוב התרופות המשמשות כיום לניהול מחלות מפרקים הן פליאטיביות, ואין תרופות OA יעילות משנות מחלה (DMOADs) זמינות3. צורך רפואי זה נובע בעיקר מהיעדר מודל יעיל לחקר מנגנוני המחלה ופיתוח DMOADs פוטנציאליים. תרבית התאים הדו-ממדית (2D) הקונבנציונלית אינה משקפת את האופי התלת-ממדי של רקמות המפרקים, ותרבית צמחי הרקמה מעוכבת לעתים קרובות על ידי מוות תאי משמעותי ובדרך כלל אינה מצליחה לשכפל את חיבורי הרקמה הדינמיים4. בנוסף, הבדלים גנטיים ואנטומיים מפחיתים באופן משמעותי את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים של בעלי חיים4.
איברים על שבבים (OoCs), או מערכות מיקרופיזיולוגיות, הם תחום מחקר מבטיח בממשק של הנדסה, ביולוגיה ורפואה. פלטפורמות in vitro אלה הן יחידות פונקציונליות מינימליות המשכפלות תכונות בריאותיות או פתולוגיות מוגדרות של עמיתיהן in vivo 5. יתר על כן, מערכות ממוזערות אלה יכולות לארח תאים ומטריצות מגוונות ולדמות את האינטראקציות הביופיזיקליות והביוכימיות בין רקמות שונות. לכן, מערכת מיקרופיזיולוגית שיכולה לשחזר נאמנה את המפרק הסינוביאלי המקומי מבטיחה להציע פלטפורמה יעילה למידול מחלות מפרקים ופיתוח DMOADs פוטנציאליים.
תאי גזע מזנכימליים אנושיים (MSCs) יכולים להיות מבודדים מרקמות רבות בכל הגוף ולהתמיין לשושלות אוסטאוגניות, כונדרוגניות ואדיפוגניות6. MSCs שימשו בהצלחה להנדסה של רקמות שונות, כולל עצם, סחוס ורקמת שומן6, ולכן הם מייצגים מקור תאים מבטיח להנדסת רכיבי הרקמה של מפרק הברך. לאחרונה פיתחנו מערכת מיקרופיזיולוגית מיניאטורית המחקה מפרקים, בשם miniJoint, הכוללת רקמות עצם, סחוס, סיבי ושומןשמקורן ב-MSC 7. בפרט, העיצוב החדשני מאפשר הצלבת רקמות באמצעות זרימה או חלחול מיקרופלואידים (איור 1). כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים לייצור רכיבי השבב, הנדסת רכיבי הרקמה, תרבית הרקמות המהונדסות בשבב ואיסוף הרקמות לאנליזות במורד הזרם.
איור 1: סכמה של שבב miniJoint המראה את הסידור של רכיבי הרקמה השונים והזרימות הבינוניות. OC = רקמה אוסטאוכונדרלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מערכת מפרק על שבב של מפרק הברך, שבה עצמות, סחוס, רקמת שומן ורקמות דמויות סינוביום נוצרים מתאי MSC ומתורבתים יחד בתוך ביוריאקטור מותאם אישית. מערכת מרובת רכיבים זו, שמקורה בתאים אנושיים עם תכונות plug-and-play מייצגת כלי חדש לחקר הפתוגנזה של מחלות מפרקים ופיתוח ת…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בעיקר על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (UG3/UH3TR002136, UG3/UH3TR003090). בנוסף, אנו מודים לד”ר פול מנר (אוניברסיטת וושינגטון) על מתן דגימות הרקמה האנושית ולד”ר ג’יאן טאן על עזרתם בבידוד MSCs ויצירת מאגר התאים.
Materials
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
- Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
- Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
- Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
- He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biologie. 9 (8), 194 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
- Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).
- Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).
- Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
- Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
- He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).
- Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).
- Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).
