관절 질환 모델링 및 약물 테스트를 위한 무릎 관절 칩 생성
Summary
우리는 인간 무릎 관절의 연골, 뼈, 지방 패드 및 활막을 재현하는 데 사용되는 인간 중간엽 줄기 세포에서 4가지 유형의 조직을 생성하는 자세한 방법을 제공합니다. 이 4 개의 조직은 맞춤형 생물 반응기에 통합되고 미세 유체를 통해 연결되어 무릎 관절 온 칩을 생성합니다.
Abstract
골관절염(OA)과 같은 쇠약하게 만드는 관절 질환의 높은 유병률은 높은 사회경제적 부담을 줍니다. 현재 관절 질환을 표적으로 하는 사용 가능한 약물은 대부분 완화제입니다. 효과적인 질병 수정 OA 약물(DMOAD)에 대한 충족되지 않은 요구는 주로 질병 메커니즘을 연구하고 잠재적인 DMOAD를 테스트하기 위한 적절한 모델의 부재로 인해 발생했습니다. 여기에서 우리는 인간 중간엽 줄기 세포(MSC)에서 유래된 지방, 섬유 및 골연골 조직 구성 요소를 포함하는 소형 활액 관절 모방 미세생리학적 시스템(miniJoint)의 확립을 설명합니다. 3차원(3D) 미세조직을 얻기 위해, 중간엽 줄기세포를 분화 전 또는 분화 후에 광가교결합성 메타크릴레이트화 젤라틴에 캡슐화하였다. 그런 다음 세포가 함유된 조직 구조를 3D 프린팅된 바이오리액터에 통합하여 miniJoint를 형성했습니다. 각각의 조직 표현형을 유지하기 위해 골형성, 섬유형성 및 지방형성 매체의 분리된 흐름을 도입했습니다. 일반적으로 공유되는 흐름은 연골, 활막 및 지방 조직을 통해 관류되어 조직 누화를 가능하게 했습니다. 이 흐름 패턴은 기계론적 연구를 위한 하나 이상의 조직 구성 요소에서 섭동의 유도를 허용합니다. 또한, 잠재적인 DMOAD는 모든 배지 스트림을 통한 “전신 투여” 또는 공유된 “활액” 시뮬레이션 흐름에만 약물을 추가하여 “관절 내 투여”를 통해 테스트할 수 있습니다. 따라서 miniJoint는 질병 메커니즘을 효율적으로 연구하고 개인화된 의학에서 약물을 테스트하기 위한 다목적 체외 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.
Introduction
골관절염(OA)과 같은 관절 질환은 매우 만연하고 쇠약하게 하며 전 세계적으로 장애의 주요 원인입니다1. 미국에서만 OA는 2,700만 명의 환자에게 영향을 미치며 60세 이상 성인의 12.1%에서 발생하는것으로 추정됩니다. 안타깝게도 현재 관절 질환 관리에 사용되는 대부분의 약물은 완화 약물이며 효과적인 질병 수정 OA 약물(DMOAD)은 사용할 수 없습니다3. 이러한 충족되지 않은 의학적 요구는 주로 질병 메커니즘을 연구하고 잠재적인 DMOAD를 개발하기 위한 효과적인 모델의 부재에서 비롯됩니다. 종래의 2차원(2D) 세포 배양은 관절 조직의 3차원 특성을 반영하지 않으며, 조직 외식편의 배양은 종종 상당한 세포 사멸에 의해 방해를 받으며, 일반적으로 동적 조직 상호 연결을 복제하지 못한다4. 또한, 유전적 및 해부학적 차이는 동물모델의 생리학적 관련성을 현저히 감소시킨다4.
OoC(Organs-on-Chip) 또는 미세생리학적 시스템은 공학, 생물학 및 의학의 인터페이스에서 유망한 연구 분야입니다. 이러한 in vitro 플랫폼은 생체 내 대응물의 정의된 건강한 또는 병리학적 특징을 복제하는 최소 기능 단위이다5. 또한 이러한 소형화된 시스템은 다양한 세포와 매트릭스를 호스팅하고 서로 다른 조직 간의 생물물리학적 및 생화학적 상호작용을 시뮬레이션할 수 있습니다. 따라서 천연 활막 관절을 충실하게 요약할 수 있는 미세생리학적 시스템은 관절 질환을 모델링하고 잠재적인 DMOAD를 개발하기 위한 효과적인 플랫폼을 제공할 것을 약속합니다.
인간 중간엽 줄기세포(MSC)는 몸 전체의 많은 조직에서 분리되어 골형성, 연골형성, 지방형성 계통으로 분화될 수 있다6. 중간엽 줄기세포는 뼈, 연골 및 지방 조직을 포함한 다양한 조직을 조작하는 데 성공적으로 사용되어 왔다6, 따라서 무릎 관절의 조직 구성 요소를 조작하기 위한 유망한 세포 공급원을 나타낸다. 우리는 최근에 중간엽 줄기세포(MSC) 유래 뼈, 연골, 섬유, 지방조직으로 구성된 miniJoint라는 이름의 소형 관절 모방 미세생리학적 시스템을 개발했다7. 특히, 새로운 디자인은 미세유체 흐름 또는 투과에 의한 조직 누화를 가능하게 합니다(그림 1). 여기에서 우리는 칩 구성 요소의 제조, 조직 구성 요소의 엔지니어링, 칩에서 엔지니어링된 조직의 배양 및 다운스트림 분석을 위한 조직 수집을 위한 프로토콜을 제시합니다.
그림 1: 다양한 조직 구성 요소 및 배지 흐름의 배열을 보여주는 miniJoint 칩의 개략도. OC = 골 연골 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 뼈, 연골, 지방 조직 및 활막과 같은 조직이 중간엽 줄기세포에서 형성되고 맞춤형 바이오리액터 내에서 공동 배양되는 무릎 관절 칩 시스템을 만들기 위한 프로토콜을 제시합니다. 플러그 앤 플레이 기능을 갖춘 이 다중 성분 인간 세포 유래 시스템은 관절 질환의 발병기전을 연구하고 약물을 개발하기 위한 새로운 도구입니다.
서로 다른 조직이 특정 배양 배…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 주로 국립 보건원(UG3/UH3TR002136, UG3/UH3TR003090)의 자금 지원을 받았습니다. 또한 인체 조직 샘플을 제공한 Paul Manner(워싱턴 대학교) 박사와 중간엽 줄기세포를 분리하고 세포 풀을 만드는 데 도움을 준 Jian Tan 박사에게 감사드립니다.
Materials
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
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