Summary
In dit werk wordt een in vitro reconstitutiebenadering gebruikt om de poro-elasticiteit van actomyosinegels onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen. De dynamiek van de actomyosinegel en het ingebedde oplosmiddel worden gekwantificeerd, waardoor de netwerkporo-elasticiteit wordt aangetoond. We bespreken ook de experimentele uitdagingen, veelvoorkomende valkuilen en relevantie voor celcytoskeletmechanica.
Abstract
Cellen kunnen actief hun vorm veranderen en beweeglijk worden, een eigenschap die afhangt van hun vermogen om hun interne structuur actief te reorganiseren. Dit kenmerk wordt toegeschreven aan de mechanische en dynamische eigenschappen van het celcytoskelet, met name het actomyosinecytoskelet, een actieve gel van polaire actinefilamenten, myosinemotoren en accessoire eiwitten die intrinsieke contractie-eigenschappen vertonen. De algemeen aanvaarde opvatting is dat het cytoskelet zich gedraagt als een visco-elastisch materiaal. Dit model kan echter niet altijd de experimentele resultaten verklaren, die meer consistent zijn met een beeld dat het cytoskelet beschrijft als een poro-elastisch actief materiaal - een elastisch netwerk ingebed met cytosol. Contractiliteitsgradiënten gegenereerd door de myosinemotoren drijven de stroom van het cytosol door de gelporiën, wat afleidt dat de mechanica van het cytoskelet en het cytosol nauw met elkaar verbonden zijn. Een belangrijk kenmerk van poro-elasticiteit is de diffusieve ontspanning van spanningen in het netwerk, gekenmerkt door een effectieve diffusieconstante die afhankelijk is van de gelelastische modulus, porositeit en cytosol (oplosmiddel) viscositeit. Omdat cellen veel manieren hebben om hun structuur en materiaaleigenschappen te reguleren, blijft ons huidige begrip van hoe cytoskeletmechanica en cytosolstroomdynamiek zijn gekoppeld, slecht begrepen. Hier wordt een in vitro reconstitutiebenadering gebruikt om de materiaaleigenschappen van poro-elastische actomyosinegels te karakteriseren als een modelsysteem voor het celcytoskelet. Gelcontractie wordt aangedreven door myosine motorische contractiliteit, wat leidt tot het ontstaan van een stroom van het penetrerende oplosmiddel. Het artikel beschrijft hoe deze gels te bereiden en experimenten uit te voeren. We bespreken ook hoe de oplosmiddelstroom en gelcontractie kunnen worden gemeten en geanalyseerd, zowel op lokale als op wereldwijde schaal. De verschillende schaalrelaties die worden gebruikt voor gegevenskwantificering worden gegeven. Ten slotte worden de experimentele uitdagingen en veelvoorkomende valkuilen besproken, inclusief hun relevantie voor de cytoskeletmechanica van cellen.
Introduction
Levende cellen hebben unieke mechanische eigenschappen. Naast het vermogen om passief te reageren op toegepaste krachten, zijn ze ook in staat om actief krachten te genereren als reactie op externe stimuli1. Deze kenmerken, die essentieel zijn voor een verscheidenheid aan cellulaire processen, met name tijdens celmotiliteit, worden voornamelijk toegeschreven aan de mechanische en dynamische eigenschappen van het celcytoskelet, met name het actomyosinecytoskelet, een actieve gel van polaire actinefilamenten, myosinemoleculaire motoren en accessoire-eiwitten. Deze actomyosinenetwerken vertonen intrinsieke zelforganisatie- en contractie-eigenschappen aangedreven door de myosinemotoreiwitten, die de actinefilamenten met elkaar verbinden en actief mechanische spanningen genereren in het netwerk dat wordt gevoed door ATP-hydrolyse2.
Talrijke experimentele en theoretische studies zijn uitgevoerd om de materiaaleigenschappen van het cytoskelet3 te bestuderen. De algemeen aanvaarde opvatting is dat het cytoskelet zich gedraagt als een visco-elastisch materiaal4. Dit betekent dat op korte tijdschalen het cytoskelet zich gedraagt als een elastisch materiaal en op lange tijdschalen gedraagt het zich als een viskeuze vloeistof vanwege de crosslinking-eiwitten en myosinemotorische loslating (en herbevestiging), waardoor het netwerk dynamisch kan omslaan. In veel situaties kan het visco-elastische model echter niet de experimentele resultaten beschrijven, die meer consistent zijn met een beeld dat het cytoskelet beschrijft en, meer in het algemeen, het celcytoplasma dat wordt beschreven als een poro-elastisch actief materiaal 5,6. Twee hoofdkenmerken kenmerken dit soort materialen. (i) Het eerste hoofdkenmerk is het genereren van een stroom van het doordringende cytosol (het "oplosmiddel") over de gelporiën door contractiliteitsgradiënten aangedreven door de myosinemotoren, die ten grondslag liggen aan processen zoals cel blebbing7, motiliteit8 en celvormoscillaties9. De opkomst van dergelijke cytosolische stromen kan lokaal zijn, voor blebbing, of globaal, zoals in celmotiliteit. In het laatste geval drijven de contractiel aangebrachte spanningen aan de achterkant van de cel de stroom van de cytosolische vloeistof naar de voorkant van de cel, die de eiwitpool aanvult die nodig is voor lamellipodia-assemblage8. (ii) Het tweede hoofdkenmerk is dat de ontspanning van spanningen diffuus is en wordt gekenmerkt door een effectieve diffusieconstante, , die afhankelijk is van de gelelastische modulus, gelporositeit en oplosmiddelviscositeit5. De poro-elastische diffusieconstante bepaalt hoe snel het systeem reageert op een toegepaste spanning. Hogere diffusieconstanten komen overeen met een snellere herverdeling van de spanning. Dit bepaalt op zijn beurt hoe lang het duurt voordat de intracellulaire cytosolische vloeistof binnen de cel wordt herverdeeld na toegepaste mechanische stress, hetzij extern of intern, zoals de actieve contractiele spanningen die worden gegenereerd door myosinemotoren. Deze voorbeelden tonen dus aan dat de mechanica van het cytoskelet en het cytosol nauw met elkaar verbonden zijn en niet afzonderlijk kunnen worden behandeld3.
Omdat cellen hun mechanische eigenschappen op verschillende manieren kunnen reguleren, blijft het samenspel tussen netwerkmechanica en vloeistofstroomdynamica slecht begrepen. Een krachtige alternatieve benadering is het gebruik van in vitro gereconstitueerde systemen die volledige controle over de verschillende microscopische bestanddelen en de systeemparameters mogelijk maken, waardoor deze modelsystemen optimaal zijn voor fysische analyse10,11. Deze aanpak is met succes gebruikt om de impact van eiwitsamenstelling en systeemgeometrie op actine-gebaseerde motiliteit 12,13,14,15,16,17,18 te bestuderen, de 2D-patronen van actomyosinenetwerken 19,20,21,22, en de wisselwerking tussen netwerkcontractiliteit en vloeistofstroomdynamica van poro-elastische actomyosinegels, waar dit artikel zich op richt23.
In dit manuscript wordt de voorbereiding van contractiele elastische actomyosinenetwerken van controleerbare dimensies en materiaaleigenschappen besproken op basis van het werk van Ideses et al.23. De dynamiek van de samentrekkende gel en het gedraineerde oplosmiddel worden geanalyseerd en gekwantificeerd, waardoor wordt aangetoond dat deze actomyosine-gels kunnen worden beschreven als een poro-elastisch actief materiaal. Het bestuderen van het effect van oplosmiddelviscositeit op spanningsdiffusiviteit bevestigt verder de poro-elastische aard van deze netwerken. De verschillende schaalrelaties die worden gebruikt voor de kwantificering van gegevens worden verstrekt. Tot slot worden ook de experimentele uitdagingen, de veelvoorkomende valkuilen en de relevantie van de experimentele resultaten voor het celcytoskelet besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oppervlaktebehandeling en passivering van glas:
OPMERKING: Deze sectie bevat drie belangrijke stappen (zie figuur 1): (i) reiniging en hydrofielisatie, (ii) silanisatie en (iii) oppervlaktepassivering.
- Reiniging en hydrofielisatie
- Gebruik Piranha-oplossing voor het reinigen van glasoppervlakken.
OPMERKING: Piranha-oplossing is een mengsel van 30% H 2O 2 en 70% H2 SO4 (materiaaltabel). Het belangrijkste doel is om organische verontreinigingen van dekplaatoppervlakken te verwijderen en de OH-groepen op het glasoppervlak bloot te leggen. Op deze manier wordt het glasoppervlak hydrofiel. - Plaats 10-12 #1.5 (22 mm x 22 mm) glazen coverslips (Table of Materials) in een zelfgemaakte polytetrafluorethyleenhouder (basisoppervlak: 5,5 cm x 5,5 cm). Breng de polytetrafluorethyleenhouder over in een bekerglas van 400 ml (materiaaltabel) en incubeer het gedurende 2 uur met 300 ml piranha-oplossing. Doe deze stap op ijs en in een chemische kap.
OPMERKING: De polytetrafluorethyleenpaal die op de houderbasis is geschroefd, is 12 cm lang en langer dan het bekerglas (11 cm), waardoor de houder veilig kan worden overgebracht/uitgetrokken in/van de Piranha-oplossing. Omdat de Piranha-oplossing nog steeds zeer reactief en zeer heet kan zijn, is het noodzakelijk om de reactie te stoppen. De eenvoudigste manier om de reactie te stoppen is om de Piranha-oplossing in (kraan)water te gieten om een verdunning van 50x (ten minste) te bereiken. De oplossing kan dan veilig worden weggegooid. Bewaar de gebruikte Piranha-oplossing nooit in een gesloten glazen fles - dit kan eindigen in een flesexplosie. - Breng de polytetrafluorethyleenhouder over in een schoon bekerglas gevuld met vers dubbel gedestilleerd water (DDW) om overtollige Piranha van de dekzeilen te wassen.
- Breng het bekerglas over in een ultrasoonapparaatbad (materiaaltafel) en soniceer op 80 Hz op vol vermogen gedurende 10 minuten bij 25 °C. Herhaal deze stap nog twee keer met verse DDW. Gebruik telkens verse DDW.
- Gebruik Piranha-oplossing voor het reinigen van glasoppervlakken.
- Silanisatie
- Breng de houder over in een schoon bekerglas (400 ml) gevuld met 300 ml zuivere methanol (materiaaltafel) en vervolgens in een ultrasoonapparaatbad (materiaaltafel). Sonicate op 80 Hz op vol vermogen gedurende 30 minuten bij 25 °C.
- Breng de houder na ultrasoonapparaat over in een silaanoplossing bereid met 15 ml DDW, 3,1 ml azijnzuur (materiaaltabel), 340 ml methanol en 7,6 ml silaan ((3-mercaptopropyl) trimethoxysilaan) (materiaaltabel). Sluit het bekerglas af met parafilm en bewaar het een nacht in de koelkast op 4 °C.
OPMERKING: De bereiding en hantering van de silaanoplossing moet worden uitgevoerd in een chemische kap. Na de silanisatiestap plaatst u de gebruikte silaanoplossing (afval) in een speciale glazen fles in de chemische kap. - Breng de houder de volgende dag gedurende 15 s over in een schoon bekerglas gevuld met 300 ml zuivere methanol. Breng de houder vervolgens over in een schoon bekerglas, niet voordat u de bodem van de polytetrafluorethyleenhouder hebt gedroogd om overtollige methanol te verwijderen. Breng het bekerglas over in de oven (Materiaaltafel) om de glazen afdekplaten gedurende 5 minuten bij 120 °C te drogen.
- Oppervlaktepassivering met een inert polymeer
- Bereik oppervlaktepassivering door de glazen afdekplaten te incuberen met een inert polymeer (Table of Materials). Neem voor elk experiment twee coverslips en plaats ze in een petrischaal bedekt met een parafilmlaag die aanvankelijk is gereinigd met ethanol (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) (tabel met materialen).
- Incubeer elke coverslip met 1 ml van een 4 mg·ml−1 5 kDa molecuulgewicht methoxypolyethyleenglycolmaleimide (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (materiaaltabel) in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (materiaaltabel) gedurende 1 uur bij 22 °C.
OPMERKING: Door de coverslips op een hydrofobe parafilmlaag te plaatsen, wordt de hydrofiele PEG-polymeeroplossing beperkt tot het oppervlak van de glazen dekplaat. De incubatietijd is van cruciaal belang voor het bereiken van optimale passivering. Gebruik incubatietijden variërend tussen 45 min en 2 h. Boven deze incubatietijd kan het oppervlak van de glazen afdekplaat verslechteren, wat leidt tot eiwithechting en een verlies van transparantie. - Spoel aan het einde van het incubatieproces elke coverslip af met 5 ml DDW en droog met een stroom van N2 (gas). Droog de afdekstroken niet onder vacuüm. Aangezien de afdekstroken na passivering nat moeten worden gehouden, plaatst u onmiddellijk 1 ml 10 mM Tris op de gepegyleerde oppervlakken. Gebruik de coverslips binnen 2 uur.
OPMERKING: De verschillende stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stromingskamer om verontreiniging van het glasoppervlak te voorkomen.
2. Eiwitzuivering
- Zuiver G-actine van konijnenskeletspieracetonpoeder met behulp van de gelfiltratiemethode24.
- Actine zuivering duurt 1 week. Bewaar de gezuiverde G-actine in G-buffer (5 mM Tris pH 7,8, 0,01% NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP en 1 mM DTT) en bewaar het op ijs. Gebruik de oplossing binnen 2 weken.
OPMERKING: Vervang het ijs om de paar dagen. - Label de actine met een maleimide-gemodificeerde fluorescerende kleurstof16 (Tabel met materialen). Zuiver de GST-fascin op basis van de methode van Ono et al.25. Flash-freeze beide eiwitten in vloeibare N2, en opslaan bij −80 °C.
- Actine zuivering duurt 1 week. Bewaar de gezuiverde G-actine in G-buffer (5 mM Tris pH 7,8, 0,01% NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP en 1 mM DTT) en bewaar het op ijs. Gebruik de oplossing binnen 2 weken.
- Gebruik een standaardprotocol om myosine II te zuiveren van de skeletspieren van konijnen26. De gezuiverde myosine II (dimeren) voorraadbuffer omvat 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl en 35% w/v sucrose. Bevries de myosine in vloeistof N2 en bewaar bij −80 °C.
OPMERKING: De hoge concentratie KCl houdt de myosinemotoren in een dimere vorm, terwijl het hoge percentage sucrose ervoor zorgt dat de activiteit van de motoren niet wordt belemmerd bij het bevriezen. Gebruik een speciale pipet voor het hanteren van viskeuze vloeistoffen bij het werken met myosine II-stamoplossingen (materiaaltabel).- Label de myosine II-dimeren met een fluorescerende kleurstof (Materiaaltabel) op paren gemanipuleerde cysteïneresiduen19,27. Gebruik daarvoor een kippenmaag RLC-mutant A26. Vries het gelabelde myosine II in vloeistof N2 in en bewaar bij −80 °C.
OPMERKING: Deze etiketteringsprocedure zorgt ervoor dat het gelabelde myosine actief is als het inheemse myosine II-eiwit.
- Label de myosine II-dimeren met een fluorescerende kleurstof (Materiaaltabel) op paren gemanipuleerde cysteïneresiduen19,27. Gebruik daarvoor een kippenmaag RLC-mutant A26. Vries het gelabelde myosine II in vloeistof N2 in en bewaar bij −80 °C.
- Gebruik een UV-Vis-spectrofotometer (materiaaltabel) om de absorptie van de stockeiwitoplossingen te meten en leid de eiwitconcentraties af met de wet van Beer-Lambert met behulp van de volgende extinctiecoëfficiënten: G-actine (ε290 = 26.460 M−1·cm−1), GST-fascin (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), myosine II-dimeer (ε280 = 268.800 M−1·cm−1), en RLC-mutant A (ε280 = 3.960 M−1·cm−1)19.
3. Monstervoorbereiding
OPMERKING: Polymeriseer de actinemonomeren in de aanwezigheid van grote aggregaten van myosine II-motoren en de sterke passieve crosslinker fascin om macroscopisch contractiele elastische actomyosinenetwerken te produceren19,23. Het toevoegen van fluorescerende kralen aan de oplossing maakt het mogelijk om de oplosmiddelstroom tijdens gelcontractie te volgen.
- Eiwit ("actomyosine") oplossing
- Bewaar de eiwitten, behalve G-actine, op −80°C in kleine aliquots en ontdooi ze voor gebruik bij 37°C. Het totale volume van de actomyosine-oplossing is 40 μL.
- Bereid de oplossing door 10 mM Tris pH 7,4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, een ATP-regenererend systeem (0,5 mg·ml−1 creatinekinase en 5 mM creatinekosfaat), 200 μM EGTA (chelaten Ca2+ ionen), een antibleekoplossing (0,1 mg·ml−1 glucoseoxidase, 0,018 mg·ml−1 katalase en 5 mg·ml−1 glucose) te mengen, 5 μM G-actine, 280 nM GST-fascin en 1,67 nM myosine II. Het percentage gelabelde G-actine is 5% (molair percentage).
OPMERKING: Gebruik een laag percentage gelabelde G-actine om de verzadiging van het fluorescerende signaal in de gevorderde stadia van gelcontractie te voorkomen.
- Voorbereiding van myosine II motoraggregaten
- Voeg de myosinemotoren toe aan de eiwitoplossing in de vorm van aggregaten. Om grote myosineaggregaten (150 myosinedimeren/aggregaat) te vormen, verdunt u de myosine-stamoplossing met 10 mM Tris pH 7,4 om een eindconcentratie van 25 mM KCl te bereiken.
- Bewaar de verdunde myosine-oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) en breng deze vervolgens over op ijs tot gebruik. De motoren zijn tot 2 uur volledig actief.
- Het meten van de oplosmiddelstroom
- Om de oplosmiddelstroom door de gelporiën te volgen, voegt u de fluorescerende kralen toe aan de actomyosine-oplossing. Verminder de interactie tussen de kralen en het actomyosinenetwerk door de kralen te passiveren. Incubeer praktisch 1 μL kralen (Tabel van Materialen) met 5 μM G-actine gedurende 20 minuten bij RT, en verwijder vervolgens overtollig G-actine door centrifugatie (Materiaaltabel) (omstandigheden: 6.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C).
- Herhaal deze stap met 10 mg·ml−1 runderserumalbumine (BSA) (materiaaltabel) om (mogelijk) het resterende ongecoate oppervlak te blokkeren. Gebruik de kralen bij een uiteindelijke verdunning van 1:10.000 vol/vol in de experimenten.
OPMERKING: Het is belangrijk om de diameter van de kralen aan te passen aan de grootte van de gelporiën, zodat de verhouding tussen kraal en porie in alle stadia <1 is.
- Effect van de viscositeit van de oplossing
- Controleer de viscositeit van de oplossing door glycerol (materiaaltabel) aan de actomyosine-oplossing toe te voegen. Het toevoegen van glycerol met een gewichtspercentage variërend van 0% tot 34% induceert een overeenkomstige toename van de viscositeit van de oplossing van η ω tot 2,76 η ω, waarbij η ω de viscositeit van water bij 20 °C28 is.
OPMERKING: Het is essentieel om een speciale pipet te gebruiken voor het hanteren van viskeuze vloeistoffen bij het werken met glycerol (materiaaltabel).
- Controleer de viscositeit van de oplossing door glycerol (materiaaltabel) aan de actomyosine-oplossing toe te voegen. Het toevoegen van glycerol met een gewichtspercentage variërend van 0% tot 34% induceert een overeenkomstige toename van de viscositeit van de oplossing van η ω tot 2,76 η ω, waarbij η ω de viscositeit van water bij 20 °C28 is.
4. Een experiment uitvoeren
- Zelfgemaakte monsterhouder handling
- Neem een van de PEG-gepassiveerde coverslips, plaats er een ingevette parafilm spacer op en plaats deze in de monsterhouder.
OPMERKING: Men kan de parafilm spacer vervangen door elke spacer.
- Neem een van de PEG-gepassiveerde coverslips, plaats er een ingevette parafilm spacer op en plaats deze in de monsterhouder.
- De actomyosine-oplossing bereiden
- Bereid de actomyosine-oplossing op ijs in een microcentrifugebuis door de verschillende microscopische bestanddelen op te nemen, de myosine II-motoraggregaten toe te voegen en als laatste EGTA toe te voegen. Meng de oplossing goed. De toevoeging van EGTA initieert actomyosine-netwerkpolymerisatie, die de starttijd van het experiment bepaalt.
- Plaats 1,1 μL van die oplossing op de op de houder gemonteerde coverslip en plaats de tweede coverslip erop. Schroef de houder vast om het monster af te dichten. Dit proces knijpt enigszins in de druppel, die een schijfachtige vorm aanneemt. De druppeldiameters variëren tussen 2.800-3.000 μm.
- Plaats de monsterhouder op de microscoop en start de acquisitie. Bereid de microscoop van tevoren voor om de initiële acquisitietijd te verkorten. Het duurt meestal 1-2 minuten na het mengen om de beeldvorming van het monster te starten.
5. Microscopie technieken
- Beeld de monsters af met behulp van een omgekeerde fluorescerende microscoop (Table of Materials) die wordt bestuurd door speciale software (Table of Materials).
- Gebruik lage vergrotingen van 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-objectief (Materiaaltabel) om het hele gelgebied te visualiseren en de macroscopische samentrekking met de tijd te volgen.
- Gebruik een 10x/0.3 Ph1 UPlanFL-doelstelling (Table of Materials) om de porositeit en structuur van het netwerk te karakteriseren en om de zelforganisatie en contractie van het netwerk met de tijd te volgen.
OPMERKING: Dit doel is ook nuttig voor het lokaliseren van de myosine II-motoraggregaten binnen het netwerk en het volgen van de beweging van fluorescerende kralen over de gelporiën. Hogere vergrotingen kunnen worden gebruikt ten koste van een verminderd gezichtsveld, wat nog belangrijker is in de beeldvormingsmodus met twee kleuren (Table of Materials).
- Prikkel de monsters bij 488 nm (actine/fluorescerende kralen) en 561 nm (myosinemotoraggregaten/fluorescerende kralen). Verkrijg de beelden met 100 ms per frame met speciale software (Table of Materials) in streamingmodus met een EMCCD-camera (Electron Multiplying Charge-coupled Device) (Table of Materials).
OPMERKING: De intensiteit van de fluorescentielamp (materiaaltabel) moet op de laagst mogelijke waarde worden gehouden om signaalverzadiging tijdens netwerkcontractie te voorkomen. - Gelijktijdige tweekleurenbeeldvorming
- Gebruik deze modus voor twee doeleinden: (i) het detecteren van de lokalisatie van de myosinemotoraggregaten binnen het actinenetwerk, en (i) het karakteriseren van de uitwendige oplosmiddelstroom binnen en buiten tijdens netwerkcontractie.
- Exciteer de actine- en myosine II-motoren bij respectievelijk 488 nm en 561 nm en neem de beelden gelijktijdig op een EMCCD-camera (materiaaltabel) op met behulp van een apparaat met dubbele emissie (materiaaltabel). Gebruik hetzelfde beeldvormingssysteem om tegelijkertijd de actinegel (488 nm) en de fluorescerende kralen (561 nm) in beeld te brengen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per experiment worden twee glazen dekplaten gebruikt. De glazen afdekplaten worden gereinigd en gepassiveerd met PEG-polymeren. Passivering is essentieel om te voorkomen dat de opgeloste eiwitten zich in de vroege experimentele stadia aan de glasoppervlakken hechten en om de interactie van het samentrekkende netwerk met de glazen wanden te minimaliseren. Het niet bereiken van een goede passivering kan leiden tot inefficiënte contractie en kan in extreme gevallen zelfs de vorming van het actinenetwerk remmen.
Figuur 1 beschrijft de drie belangrijkste stappen van de oppervlaktebehandelingsprocedure. Deze stappen omvatten het volgende: (i) oppervlaktereiniging en hydrofilisatie met behulp van een Piranha-oplossing, die organische verontreiniging van de deklipoppervlakken verwijdert en de OH-groepen op het glasoppervlak blootstelt; ii) oppervlaktesilanisatie met (3-mercaptopropyl)trimethoxysilaan, dat tot doel heeft het silaan covalent aan het glasoppervlak te binden, waarbij elk silaanmolecuul eindigt met een SH-groep; iii) passivering met PEG-polymeren (mPEG-mal, 5 kDa)-in deze stap interageert de maleimidegroep van het PEG-polymeer covalent met de SH-groep op de (3-mercaptopropyl)trimethoxysilaan, wat resulteert in de vorming van een PEG-monolaag op het glasoppervlak.
Voor Piranha-behandeling en silanisatie worden 10-12 glazen afdekplaten # 1,5 (22 mm x 22 mm) in een polytetrafluorethyleenhouder (figuur 2A) geplaatst en die houder wordt overgebracht naar een bekerglas van 400 ml. Voor de passiveringsstap worden twee glazen afdekplaten overgebracht op een met parafilm gecoate petrischaal (figuur 2B). Het plaatsen van de coverslips op een hydrofobe parafilmlaag zorgt ervoor dat de hydrofiele PEG-polymeeroplossing gedurende de incubatietijd beperkt blijft tot het glasoppervlak. Elke coverslip wordt geïncubeerd met 1 ml 4 mg·ml−1 5 kDa mPEG-mal in 1x PBS gedurende 1 uur bij 22 °C (figuur 2B). Voor dit PEG polymeer molecuulgewicht en concentratie leidt glaspassivering tot de vorming van een PEG-monolaag, waarbij elk PEG-polymeer zich in een paddestoelachtige conformatiebevindt 29. Aan het einde van het incubatieproces wordt elke dekplaat gespoeld met 5 ml DDW en gedroogd met een stroom van N2 (gas). Als de coverslips niet onmiddellijk worden gebruikt, moet 1 ml 10 mM Tris op de gepegyleerde oppervlakken worden aangebracht om de dekslipoppervlakken nat te houden. De coverslips worden gedroogd met een stroom van N2 (gas) vlak voordat een experiment wordt gestart. Het is beter om de coverslips binnen 2 uur te gebruiken.
Macroscopisch contractiele elastische actomyosinenetwerken worden gevormd door 5 μM G-actine te mengen met 16,7 nM myosine, dat wordt toegevoegd in de vorm van grote aggregaten (~150 myosine dimeren/aggregaten), en 280 nM van de sterke crosslinker fascin. De oplossing omvat 1 mM ATP, die constant wordt gehouden met behulp van een ATP-regenererend systeem en een anti-bleekoplossing (zie details in de sectie protocol). Om de stroom van het penetrerende oplosmiddel te analyseren, worden fluorescerende kralen toegevoegd aan de actomyosine-oplossing.
De experimenten worden uitgevoerd in een zelfgemaakte monsterhouder, die past bij de afmetingen van een standaard microscooptrap (figuur 3). Een ingevette parafilm afstandhouder van dikte h (~150 μm) wordt op een van de twee PEG-gepassiveerde coverslips geplaatst en die coverslip wordt in de monsterhouder geplaatst (figuur 3A). Vervolgens wordt de actomyosine-oplossing bereid op ijs in een microcentrifugebuis door de verschillende microscopische bestanddelen op te nemen, waarbij als laatste de G-actine, myosineaggregaten en vervolgens EGTA worden toegevoegd, die actinepolymerisatie veroorzaakt. De oplossing moet goed worden gemengd - dit stelt de starttijd van de experimenten in (t = 0). Onmiddellijk wordt 1,1 μl van die oplossing op de dekplaat geplaatst (figuur 3B), de tweede PEG-gepassiveerde dekplaat wordt erop geplaatst (figuur 3C) en de houder wordt geschroefd om de val ertussen te beperken (figuur 3D). Voor dit druppelvolume en afstandstype is de druppeldiameter ongeveer 3.000 μm, maar onderzoekers moeten niet op deze geschatte waarden vertrouwen. De werkelijke valdikte en diameter moeten altijd rechtstreeks uit de microscopiebeelden worden gemeten. Voor de dikte moet een confocale microscoop worden gebruikt.
De monsterhouder wordt op de microscoop geplaatst en de acquisitie wordt gestart. De microscoop moet van tevoren worden voorbereid om de tijd tot het starten van de verwerving tot een minimum te beperken. Het duurt meestal 1-2 minuten om de beeldvorming van het monster te starten. De monsters worden geëxciteerd bij 488 nm en/of 561 nm en in beeld gebracht met behulp van een omgekeerde fluorescerende microscoop die wordt bestuurd door een speciale software. De beelden moeten worden verkregen met een snelheid van 100 ms per frame (of minder) in streamingmodus met een EMCCD-camera. Om tegelijkertijd het actinenetwerk en de myosinemotoraggregaten of de fluorescerende kralen in de oplossing in beeld te brengen, moet een systeem met dubbele emissie worden gebruikt. De intensiteit van de fluorescentielamp moet zo laag mogelijk worden gehouden om signaalverzadiging in de gevorderde stadia van netwerkcontractie te voorkomen.
Een 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-objectief wordt gebruikt om de laterale contractiedynamiek van de gel en de richting en snelheid van de vloeistofstroom op de lengteschaal van de gel te karakteriseren. Dit zijn afbeeldingen met een lage resolutie die nuttig zijn voor het volgen van de veranderingen in gelradius met de tijd, waaruit de gel radiale (laterale) contractiesnelheid kan worden afgeleid. Om de structuur en porositeit van het netwerk, de locatie van de myosinemotoraggregaten binnen het netwerk en de beweging van individuele fluorescerende kralen over de gelporiën op te lossen, moeten hogere vergrotingsobjectieven worden gebruikt (bijvoorbeeld een 10x / 0,3 Ph1 UPlanFL-objectief). Hogere vergrotingen kunnen ook worden gebruikt, maar ten koste van een verminderd gezichtsveld, wat belangrijker is als de dual-color beeldvormingsmodus wordt gebruikt. De (2D) fluorescentiemicroscopiegegevens moeten worden aangevuld met confocale beeldvorming van de samentrekkende gel in 3D om de contractiedynamiek in zowel de laterale als verticale richting te karakteriseren. Confocale microscopie wordt gebruikt om de afstand tussen de twee coverslips te meten - deze afstand definieert de initiële geldikte. Bovendien moet de dikte van de gel aan het einde van het experiment worden gemeten wanneer een mechanisch stabiele toestand wordt bereikt.
Er moet aan verschillende criteria worden voldaan om aan te tonen dat de actomyosinenetwerken zich gedragen als een poro-elastisch materiaal: (i) het netwerk hermodelleert niet, wat zou afleiden dat het zich gedraagt als een elastisch materiaal (figuur 4), (ii) de waterstroom (oplosmiddel) door de gelporiën wordt aangedreven door myosinecontractiliteit (figuur 5) en (iii) de elastische stressontspanning wordt gekenmerkt door een effectieve diffusieconstante, D ~ κ/γ, die afhankelijk is van de effectieve elastische modulus van de gel, κ, en de effectieve wrijvingsconstante, γ, die verantwoordelijk is voor de wrijving tussen het bewegende oplosmiddel en de gelporiën (figuur 6). Hieronder bespreken we elk criterium afzonderlijk en laten we zien hoe hieraan wordt voldaan in het huidige systeem.
Doel (i)
Ten eerste moeten de gelstructuur en porositeit worden geanalyseerd en moet worden bepaald of het netwerk dynamisch remodelleert. Een schematische weergave van het actomyosinenetwerk is weergegeven in figuur 4A. Netwerkvorming begint met de spontane nucleatie en polymerisatie van de actinefilamenten, die vervolgens bundelen (figuur 4B). Het netwerk organiseert zich vervolgens actief in een macroscopisch isotroop onderling verbonden netwerk van actinebundels, dat dynamisch verruwt met de tijd en uiteindelijk samentrekt. Netwerkzelforganisatie en contractie worden aangedreven door de myosineaggregaten, die voornamelijk lokaliseren op de snijpunten van de filamentbundels (figuur 4C). De myosineaggregaten blijven door gelcontractie aan het netwerk gehecht, waaruit kan worden geconcludeerd dat deze actomyosinegels zich gedragen als elastische actieve materialen (figuur 4C). Bovendien wordt in deze actomyosine-gels de contractie geregeld door filamentglijden, zoals afgeleid door de end-to-end afstanden van de filamentbundels, l end-to-end en contourlengten, lcont te vergelijken (figuur 4D, E). Dit staat in contrast met de samentrekking van losse actinebundels die zijn verknoopt door α-actinine, die worden gedomineerd door actinefilament dat knikt29.
De porositeit van de gel wordt gekenmerkt door de grootte van de gelporiën waardoor de oplosmiddelstroom beweegt. Voor gezuiverde actinenetwerken geeft de maaswijdte, die de afstand tussen crosslinks in de gel definieert (hier de myosineaggregaten), ook een goede schatting van de poriegrootte van de gel. De maaswijdte kan direct uit de (2D) fluorescentiebeelden worden geëxtraheerd en wordt geëvalueerd aan de hand van het geometrische gemiddelde van de afstanden tussen paren tegengestelde actinebundels in een gelporie (figuur 4B). Aangezien het netwerk isotroop is tot aan het begin van de contractie, zijn de gemiddelde maaswijdten in de verticale (d.w.z. over de dikte) en laterale (langs de straal) richtingen hetzelfde, ξ 0, = ξ 0,ll
= ξ0 (= 67 μm). Omdat de actinebundels tijdens de contractie recht blijven, krimpen de maas- en poriegroottes in verhouding tot de veranderingen in geldikte en diameter. Voor het huidige experimentele systeem begint de in-plane (radiale) contractie nadat de verticale contractie praktisch eindigt (niet weergegeven), zodat radiale contractie verloopt bij een constante geldikte die kleiner is dan de initiële dikte met een factor ~ 0,3. Bijgevolg, terwijl de maaswijdte binnen het contractievlak, ξ ll (t) = r(t)/R, afneemt tijdens radiale contractie, waarbij r(t) de straal van de gel is op tijdstip t, is de gemiddelde maaswijdte in de loodrechte richting constant, ξ
= 20μm23. Deze waarden van de maaswijdte/poriegroottes worden gebruikt om de gelelastische modulus, κ en wrijvingscoëfficiënt γ te evalueren, zoals hieronder beschreven (doel [iii], figuur 6).
Doel (ii)
Dit doel omvat het aantonen dat een uitwendige oplosmiddelstroom wordt gegenereerd door myosinecontractiliteit. Om de oplosmiddelstroom te volgen, worden fluorescerende kralen toegevoegd aan de actomyosine-oplossing. De kralen worden gepassiveerd om de interactie tussen de bewegende kralen en het actomyosinenetwerk te verminderen. In totaal wordt 1 μL kralen (Materiaaltabel) geïncubeerd met 5 μm G-actine gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en wordt overtollig G-actine verwijderd door centrifugeren (Materiaaltabel, zie de protocolsectie voor details). Deze stap wordt herhaald met 10 mg·ml-1 BSA (materiaaltabel). De kralen worden aan de eiwitoplossing toegevoegd met een uiteindelijke verdunning van 1:10.000 v/v. Omdat het doel is om de kralen vrij over de gelporie te laten bewegen, is het belangrijk om de diameters van de kralen aan te passen aan de grootte van de gelporiën, zodat hun grootteverhouding altijd <<1 is. Als zodanig worden kralen met een diameter van 2.300 nm gebruikt om de begin- en tussenstadia van contractie te analyseren (figuur 5A, B) wanneer de gemiddelde poriegrootte groter is dan 15 μm, en kralen met een diameter van 200 nm worden gebruikt wanneer de poriegrootte kleiner is (figuur 5D-G). De massamiddelpuntpositie van de kralen wordt geëxtraheerd voor elke keer, t, (x(t),y(t))kraal, met behulp van een standaard deeltjesvolgalgoritme (Table of Materials), waaruit het traject (figuur 5B) en de lokale kraalsnelheid
kunnen worden afgeleid. De kralen, en dus het penetrerende oplosmiddel, bewegen gemiddeld in de radiale richting naar buiten (figuur 5A,B), terwijl de gel naar binnen samentrekt, zoals blijkt uit de analyse van de deeltjesbeeldsnelheid (PIV) (zie de groene pijlen in figuur 6A). Deze radiale beweging kan verder worden uitgewerkt door de radiale snelheid van de lokale kralen, νr, te extraheren, die wordt geëvalueerd door de lokale kraalsnelheid te projecteren op de radiale richting gedefinieerd door de eenheidsvector, , die het gelcentrum (x 0, 
y0) en de kraalmiddel-van-massapositie op tijdstip t verbindt: 
waarbij 
De gegevens tonen aan dat naarmate de kralen vanuit het gelcentrum naar buiten bewegen, hun snelheden aanvankelijk toenemen en ze vervolgens vertragen naarmate ze de gelgrens naderen (figuur 5C). Met name de kraalsnelheid kan 20 keer groter zijn dan de radiale contractiesnelheid van de gel (blauwe curve in figuur 5C). De gevulde cirkels markeren het tijdstip waarop de kralen de gel verlaten. De kralen blijven bewegen na het verlaten van de gelgrens gedurende enige tijd. Deze beweging kan niet het gevolg zijn van traagheidseffecten, omdat het Reynoldsgetal <10-4 is. De radiale kraalsnelheid neemt af met de tijd die gelijktijdig is met de afname van de gelcontractie; Met name wanneer de radiale contractiesnelheid van de gel aanzienlijk is afgenomen, fluctueert de snelheid van de kralen aanzienlijk.
Om te testen of deze fluctuaties het gevolg zijn van de poreuze structuur van het actomyosine, volgt het netwerk de beweging van de kralen met een hogere ruimtelijke resolutie, wat mogelijk is wanneer de samentrekking van de gel aanzienlijk is vertraagd (figuur 5D-F). De baan van de kralen is inderdaad kronkelig (figuur 5D, E), met aanzienlijke fluctuaties in de lokale snelheid van de kralen, die de poreuze structuur van de gel weerspiegelt - dat wil zeggen dat de lokale snelheid het snelst is dicht bij het poriecentrum en het langzaamst in de buurt van een actinebundel (figuur 5F).
Ten slotte toont het berekenen van de correlatiefunctie van de gelsnelheid en oplosmiddelsnelheid aan dat lokaal de vloeistofstroom tegengesteld is aan de samentrekkende gel. Met behulp van lokale heldere vlekken in de gel als fiduciale markers, kan hun massamiddelpuntpositie voor elk tijdpunt, t, (x (t), y (t) gel, worden berekend en kan de lokale gelsnelheid worden afgeleid: 
. Vervolgens wordt voor elke kraal en een nabijgelegen punt in de gel de correlatie tussen de lokale kraalsnelheid en gelsnelheid berekend om de hoek, θ, tussen de twee vectoren te extraheren: 
, waarbij 
en zijn de lokale snelheden (grootte) van respectievelijk de kraal en 
de gel. De gegevens tonen aan dat onafhankelijk van de positie van de kraal in de gelporie, lokaal, de vloeistofstroom in de tegenovergestelde richting wordt gericht ten opzichte van de gel (figuur 5G). Over het algemeen laten de resultaten zien dat een uitwendige vloeistofstroom wordt gegenereerd door myosinecontractiliteit, zoals verwacht voor een poro-elastisch actief materiaal 3,7,23,30.
Doel (iii)
Dit doel omvat het aantonen dat stressontspanning wordt gekenmerkt door een effectieve poro-elastische diffusieconstante, D, die afhankelijk is van de netwerkelastische modulus, porositeit en oplosmiddelviscositeit. Eerst wordt de laterale (in-plane) snelheid van de samentrekkende gel gekwantificeerd (figuur 6A). Ten eerste worden de fluorescentiebeelden gebinariseerd en wordt het gelgeprojecteerde gebied op elk tijdstip t, A (t), geëxtraheerd. Vervolgens wordt de gelradius berekend 
(figuur 6B). Hieruit wordt de radiale contractiesnelheid op tijdstip t,,
afgeleid die de gelrandsnelheid beschrijft (figuur 6C). De randsnelheid toont een typisch temporeel evolutieprofiel dat wordt gekenmerkt door een initiële lineaire fase, waarin de randsnelheid met een constante snelheid toeneemt, totdat een maximale snelheid, ν max, 
wordt bereikt op tijdstip t max. De snelheid vervalt dan exponentieel met een karakteristieke relaxatietijd, τ, totdat een mechanisch stabiele toestand wordt bereikt (figuur 6C). De rmaxis de gelradius aan het begin van die ontspanningsfase.
Voor een poro-elastisch materiaal is de ontspanningstijd 
, waarbij 
een effectieve poro-elastische diffusieconstante is, κ een effectieve elastische gelmodulus en γ een effectieve wrijvingsconstante is die verantwoordelijk is voor de beweging van de waterige oplossing door de actine-gelporiën. De elastische modulus heeft eenheden van energie per volume-eenheid en is omgekeerd evenredig met het volume van een eenheidscel in de gel, bepaald door de afstand tussen crosslinks of de maaswijdte, zodanig dat 
. De wrijvingscoëfficiënt γ is afhankelijk van het poriefacet loodrecht op de oplosmiddelstroom. Voor in-plane gelcontractie is het relevante poriefacet , en bijgevolg de wrijvingscoëfficiënt 
, waarbij η de oplosmiddelviscositeit31,32 is
. Over het algemeen krijgen we de volgende relatie: 
, waarbij de relevante in-plane poriegrootte 
wordt geëvalueerd op tmax. Al met al verkrijgen 
we , wat afleidt dat de relaxatietijd lineair moet schalen met oplosmiddelviscositeit23.
Om te testen of deze relatie wordt gehoorzaamd, worden de experimenten herhaald met verschillende hoeveelheden glycerol. Het gebruik van glycerol is voordelig omdat het naar verwachting de activiteit van eiwitten niet beïnvloedt, met name de myosinemotoren. Bovendien zijn er in de literatuur correlaties beschikbaar tussen de viscositeit van water-glyceroloplossingen en de hoeveelheid toegevoegde glycerol28. Deze correlaties tonen aan dat een toename van het glycerolgewichtspercentage van 0% tot 34% leidt tot een proportionele toename van de viscositeit van de water-glyceroloplossing van η ω tot 2,76 η ω, waarbij ηω de waterviscositeit bij 20 °C is. In dit glycerolbereik en voor dezelfde initiële druppeldiameter, 2R = 2.800 μm, verhoogt een toename van de viscositeit de duur van de netwerkpolymerisatie- en zelforganisatiefasen, hoewel de lineaire versnelling en maximale radiale contractiesnelheid (νmax) grotendeels ongewijzigd zijn. Dit bewijs suggereert dat zowel netwerkreorganisatie (porositeit) als myosine-activiteit niet worden beïnvloed door de viscositeit van de oplossing23, en het effect van oplosmiddelviscositeit moet in wezen worden weerspiegeld in de tijd die nodig is om de elastische spanningen te ontspannen. De relaxatietijd toont inderdaad een lineaire afhankelijkheid van de viscositeit van de oplossing (figuur 6D), wat afleidt dat de hierboven afgeleide schaalrelatie wordt gehoorzaamd, wat de poro-elastische aard van het systeem verder bevestigt.
Figuur 1: Schematische beschrijving van de drie belangrijkste stappen van de oppervlaktebehandelingsprocedure voor glazen dekslips . (i) Reiniging van het glasoppervlak (Piranha-behandeling) en hydrofielisatie, (ii) oppervlaktesilanisatie en (iii) passivering met mPEG-mal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Glazen coverslip passivering. (A) Piranha-reiniging en silanisatie worden uitgevoerd in een bekerglas van 400 ml met behulp van een zelfgemaakte polytetrafluorethyleenhouder bestaande uit 12 lineaire groeven. (B) Oppervlaktepassivering wordt uitgevoerd in een petrischaal met parafilmcoating. Elke coverslip wordt geïncubeerd met 1 ml 5 kDa mPEG-mal bij 4mg·mL−1 in 1x PBS (Table of Materials) gedurende 1 uur bij 22 °C. De hydrofobe parafilmlaag zorgt ervoor dat de hydrofiele PEG-polymeeroplossing gedurende de incubatietijd beperkt blijft tot het glasoppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het uitvoeren van een experiment - de zelfgemaakte monsterhouder. Experimenten worden uitgevoerd in een zelfgemaakte monsterhouder die past bij de afmetingen van een standaard microscooptrap. (A) Een ingevette parafilm afstandhouder van dikte h (~150 μm) wordt op een PEG-gepassiveerde coverslip geplaatst en die coverslip wordt in de monsterhouder geplaatst. B) de actomyosine-oplossing wordt op ijs bereid in een Eppendorf-buis en 1,1 μl van die oplossing wordt op de dekplaat geplaatst; vervolgens (C) wordt er een tweede PEG-gepassiveerde coverslip op geplaatst en (D) wordt de monsterhouder geschroefd om de druppel te beperken, die een schijfachtige vorm aanneemt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Poro-elasticiteitsdoelstelling (i). Het actomyosinenetwerk gedraagt zich als een elastisch materiaal. (A) Schematische weergave van een actomyosinenetwerk. (B) Actomyosine-netwerkvorming. Fluorescentiemicroscopiebeelden tonen aan dat de actinefilamenten spontaan nucleeren en polymeriseren tot een isotroop onderling verbonden netwerk dat met de tijd verruwt en uiteindelijk macroscopisch samentrekt. De porositeit van het netwerk wordt gekenmerkt door de netwerkmaaswijdte, ξ (dubbele pijl). (C-E) Actomyosine netwerkcontractie wordt aangedreven door actine filament bundel glijden. (C) Netwerkcontractie initieert aan de gelperiferie ("P") en verspreidt zich naar binnen in de gelbulk. De witte pijlen geven de richting van de samentrekking aan. Het gelcentrum is gemarkeerd met een "C". De fluorescerende beelden laten zien dat de myosinemotoraggregaten (561 nm, rode stippen) zijn ingebed in het actinenetwerk (488 nm, groen) en eraan blijven hechten gedurende de netwerkcontractie. (D) De actinefilamentbundels blijven recht tijdens netwerkcontractie. De verhouding van de contourlengte, l cont, en end-to-end afstand, lend-to-end, als functie van de tijd. (E) Verdeling van de verhouding tussen de contourlengte en de eind-tot-eindafstand bij t = 316 s (effen rood) en t = 327 s (gestreept, grijs). Inzet: contourlengte (blauw) en end-to-end afstand (wit) van een typische bundel. Voorwaarden: (B,C,E[inzet]): Beelden worden verkregen op een omgekeerde fluorescerende microscoop met een EMCCD-camera en een 10x/0,3 Ph1 UPlanFL-luchtobjectief in normale modus (B) en in dubbele beeldvormingsmodus na beeldoverlay (C,E[inzet]). Schaalstaven zijn (B,C) 100 μm en (E[inzet]) 50 μm. Deze figuur is met toestemming overgenomen van Ideses et al.23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Poro-elasticiteitsdoelstelling (ii). Een uitwendige oplosmiddelstroom wordt gegenereerd door myosine motorische contractiliteit. (A) Beeldvorming van de gel bij een lage vergroting in tussenliggende stadia van contractie: gelijktijdige fluorescentiebeeldvorming van een contracterend actinenetwerk (488 nm, links) en 2.300 nm fluorescerende kralen toegevoegd aan de oplossing (561 nm, rechts) als functie van de tijd. De cirkels markeren de posities van vier kralen. De pijlen markeren de globale richting van de kraalbeweging. (B) De trajecten van negen geselecteerde kralen zijn afgebeeld. De pijlen markeren de globale radiale richting van de beweging van de kralen. Het omcirkelde kruis geeft het gelcentrum (x0,y0) (C) Lokale radiale kraalsnelheid νr (open cirkels) en (radiale) gelrandsnelheid (blauwe stippen) versus tijd aan. De gevulde cirkels geven de tijd aan waarop een bepaalde kraal de gelgrens verlaat. (D-F) Het oplossen van de porositeit van het netwerk en de beweging van het oplosmiddel door de gelporiën in vergevorderde stadia van samentrekking. (D) Epifluorescentiebeelden van de samentrekkende gel en fluorescerende kralen met een diameter van 200 nm toegevoegd aan de oplossing. Zowel de actine als de kralen zijn opgewonden bij 488 nm. De rode cirkels volgen de positie van een kraal met de tijd. De grijze lijn geeft de gelgrens aan. (E) Traject van de kraal afgebeeld onder (D). In het getoonde veld trekt de gel gemiddeld naar beneden toe. De coördinaten worden gemeten ten opzichte van de herkomst van de camera. (F) De lokale snelheid van de kraal weerspiegelt de poreuze structuur van de gel. Boven: Lokale kraalsnelheid (open cirkels), lokale gelsnelheid (grijze cirkels) en gelrandsnelheid (blauwe cirkels) versus tijd. Onder: Snapshots tonen de positie van de kraal voor geselecteerde tijden. De kraal wordt gemarkeerd door een rode cirkel. De stippellijn markeert het tijdstip waarop de kraal de gel verlaat. (G) Verdeling van hoeken tussen de lokale gel en lokale kraalsnelheden. Voorwaarden: Beelden worden verkregen op een omgekeerde fluorescerende microscoop met een EMCCD-camera en (A) een 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-objectief en (D,F) een 10x/0,3 Ph1 UPlanFL-objectief. De schaalstaven zijn (A) 400 μm, (D) 100 μm, (F) en 50 μm. Deze figuur is met toestemming overgenomen van Ideses et al.23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Poro-elasticiteitsdoel (iii). Stressontspanning wordt gekenmerkt door een effectieve poro-elastische diffusieconstante. (A) Tl-beelden van bovenaanzicht van een samentrekkende actomyosinegel bij lage vergroting vanaf de mengtijd tot aan de steady state. Het snelheidsveld (groene pijlen) wordt geëxtraheerd uit de PIV-analyse. De beelden worden verkregen op een omgekeerde fluorescerende microscoop met een EMCCD-camera en een 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-objectief. De excitatiegolflengte is 488 nm (actine). De schaalbalk is 500 μm. (B) Gelradius en (C) radiale contractiesnelheid (d.w.z. de gelrandsnelheid 
versus tijd). A geeft de versnelling aan, Vmax geeft de maximale snelheid aan en Τ is een karakteristieke relaxatietijd. (D) De actomyosinenetwerken gedragen zich als een poro-elastisch actief materiaal. 
en oplosmiddelviscositeit, η, versus glycerolgewichtspercentage (wt%). De hoeveelheden worden genormaliseerd tot hun waarden bij 0 wt% glycerol. De beginradius van de gel is R = 1.400 μm. De foutbalken zijn de standaardafwijkingen van de experimentele waarden. Deze figuur is met toestemming overgenomen van Ideses et al.23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een in vitro benadering gebruikt om de mechanica van poro-elastische actomyosinegels te karakteriseren als een modelsysteem van het celcytoskelet en, meer in het algemeen, van het celcytoplasma, waarvan is aangetoond dat het zich gedraagt als een poro-elastisch materiaal 3,5. De reologie van het celcytoskelet (cytoplasma) is gekenmerkt door een poro-elastische diffusieconstante, die dicteert hoe lang het duurt voordat de intracellulaire cytosolische vloeistof zich na toegepaste mechanische stress in de cel herverdeelt. Cellen zijn voorgesteld om dit mechanisme te gebruiken om hun vorm te reguleren5.
Gemotiveerd door deze bevindingen hebben we een raamwerk ontwikkeld om poro-elasticiteit in vitro te bestuderen. Met behulp van het voorgestelde modelsysteem geven we inzicht in hoe myosinecontractiliteit bijdraagt aan het ontstaan van een vloeistofstroom en hoe netwerksnelheid en oplosmiddelsnelheid directionaliteit en snelheid correleren in tijd en ruimte. Hiermee tonen we aan dat het netwerk en het ingebedde oplosmiddel met elkaar verbonden zijn en niet als afzonderlijke objecten kunnen worden beschouwd. We beschrijven de experimentele opzet en bieden een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van de gels en het uitvoeren van een experiment. Er wordt ook een gedetailleerd kader voor de kwantificering van gegevens gepresenteerd. Het voorgestelde kader kan gemakkelijk worden aangepast om poro-elasticiteit te bestuderen in een verscheidenheid aan experimentele opstellingen en systemen, ongeacht de specificiteit van het onderzochte experimentele systeem.
We valideren de poro-elasticiteit van de actomyosinenetwerken door de veranderingen in de tijdschaal van stressontspanning te analyseren. We kiezen ervoor om dit aan te tonen door de viscositeit van het medium te variëren door verschillende hoeveelheden glycerol aan de actomyosine-oplossing toe te voegen. Het voordeel van het gebruik van glycerol is dat het de porositeit en structuur van de netwerken niet beïnvloedt, en dus is het enige effect op stressontspanning de toename van wrijving tussen de bewegende oplossing en de gelporiën23. Veranderingen in de porositeit van het netwerk zouden een extra complicatie hebben veroorzaakt, omdat zowel de elastische modulus als de grootte van de netwerkporie de relaxatietijd op een niet-lineaire manier beïnvloeden 23,31,32.
Het uitvoeren van succesvolle experimenten vereist de passivering van de glazen afdekplaten met een inert polymeer. Deze stap is cruciaal. De hier toegepaste procedure voor glaspassivering kan worden vervangen door andere procedures als de kwaliteit van de passivering behouden blijft33,34. Defecte oppervlaktepassivering kan aanleiding geven tot massale eiwithechting, die de netwerkassemblage kan remmen. Glaspassivering is ook belangrijk om de interactie van de samentrekkende gel met de glasoppervlakken te voorkomen. Dit zou leiden tot een extra wrijvingsterm, naast de vloeistof-gelwrijving die hier wordt overwogen, die veel moeilijker in te schatten of te kwantificeren zou zijn. Afgezien van oppervlaktepassivering, vereisen succesvolle experimenten het gebruik van verse actine. Bovendien is de activiteit van de motoren ook cruciaal en moet de bereiding van verse partijen myosine elke 3-4 maanden worden herhaald.
Over het algemeen is gebleken dat deze experimentele aanpak succesvol is voor het bestuderen van poro-elasticiteit in vitro. Een beperking van de momenteel gebruikte experimentele procedure is hoe de initiële gelafmetingen robuuster kunnen worden gecontroleerd. Een optie zou zijn om voorgevormde kamers van controleerbare afmetingen te gebruiken. Het gebruik van voorgevormde kamers zou niet alleen de onderzoeker in staat stellen om de systeemgrootte beter te controleren, maar ook om de geometrie van het systeem gemakkelijk te veranderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Dina Aranovich bedanken voor de eiwitzuivering en etikettering. G.L. is het Israëlische ministerie van Wetenschap, Technologie en Ruimte dankbaar voor de Jabotinsky PhD Scholarship. A.B.G. is de Israel Science Foundation (subsidie 2101/20) en het Ministerie van Wetenschap en Technologie - Staat Israël (subsidie 3-17491) dankbaar voor financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
| Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
| Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
| Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
| Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
| Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
| Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
| Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
| Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
| Oven | WTC Binder | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
| DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
| MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
| MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |
References
- Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
- Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
- Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
- Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
- Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L.
- Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
- Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
- Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
- Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
- Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).
- Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).
- Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413 (2019).
- Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
- Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
- Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).
- Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
- Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
- Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
- Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).
- Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
- Cheng, N. -S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
- Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).
- MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).
- Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
- Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
