Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

Dit protocol demonstreert het gebruik van een microfluïdisch kanaal met veranderende geometrie langs de vloeistofstroomrichting om extensieve spanning (stretching) te genereren om vezels uit te lijnen in een 3D-collageenhydrogel (< 250 μm dik). De resulterende uitlijning strekt zich uit over enkele millimeters en wordt beïnvloed door de extensieve reksnelheid.

Abstract

Uitgelijnde collageen I (COL1) vezels begeleiden de motiliteit van tumorcellen, beïnvloeden de morfologie van endotheelcellen, controleren stamceldifferentiatie en zijn een kenmerk van hart- en bewegingsweefsels. Om de celrespons op uitgelijnde micro-omgevingen in vitro te bestuderen, zijn verschillende protocollen ontwikkeld om COL1-matrices te genereren met gedefinieerde vezeluitlijning, waaronder magnetische, mechanische, celgebaseerde en microfluïdische methoden. Hiervan bieden microfluïdische benaderingen geavanceerde mogelijkheden, zoals nauwkeurige controle over vloeistofstromen en de cellulaire micro-omgeving. De microfluïdische benaderingen om uitgelijnde COL1-matrices te genereren voor geavanceerde in vitro kweekplatforms zijn echter beperkt tot dunne "matten" (<40 μm in dikte) van COL1-vezels die zich uitstrekken over afstanden van minder dan 500 μm en niet bevorderlijk zijn voor 3D-celkweektoepassingen. Hier presenteren we een protocol om 3D COL1-matrices (130-250 μm dik) te fabriceren met millimeterschaalgebieden van gedefinieerde vezeluitlijning in een microfluïdisch apparaat. Dit platform biedt geavanceerde celkweekmogelijkheden om gestructureerde weefselmicro-omgevingen te modelleren door directe toegang te bieden tot de micro-engineered matrix voor celkweek.

Introduction

Cellen bevinden zich in een complex 3D-vezelig netwerk dat de extracellulaire matrix (ECM) wordt genoemd, waarvan het grootste deel bestaat uit het structurele eiwit collageen type I (COL1)1,2. De biofysische eigenschappen van de ECM geven aanwijzingen aan cellen en als reactie daarop hermodelleren cellen de ECM-microarchitectuur 3,4,5. Deze reciproke cel-matrix interacties kunnen aanleiding geven tot uitgelijnde COL1 vezeldomeinen6 die angiogenese en celinvasie in de tumoromgeving 7,8,9 bevorderen en de celmorfologie 10,11,12, polarisatie 13 en differentiatie 14 beïnvloeden. Uitgelijnde collageenvezels bevorderen ook wondgenezing 15, spelen een sleutelrol in weefselontwikkeling16 en dragen bij aan celcommunicatie op lange afstand17,18. Daarom is het repliceren van de inheemse COL1-vezelmicroarchitectuur in vitro een belangrijke stap in de richting van het ontwikkelen van gestructureerde modellen om celreacties op uitgelijnde micro-omgevingen te bestuderen.

Microfluïdische celkweeksystemen zijn vastgesteld als een voorkeurstechnologie om microfysiologische systemen (MPS) te ontwikkelen 19,20,21,22,23. Door gebruik te maken van gunstige schaaleffecten op microschaal, bieden deze systemen nauwkeurige controle over vloeistofstromen, ondersteunen ze de gecontroleerde introductie van mechanische krachten en definiëren ze de biochemische micro-omgeving binnen een microkanaal 21,24,25,26,27. MPS-platforms zijn gebruikt om weefselspecifieke micro-omgevingen te modelleren en multi-orgaaninteracties te bestuderen28. Tegelijkertijd zijn hydrogels op grote schaal onderzocht om de 3D-mechanica en biologische invloed van de ECM die in vivo worden waargenomen samen te vatten 29,30. Met een groeiende nadruk op het integreren van 3D-cultuur met microfluïdische platforms, kunnen tal van benaderingen COL1-hydrogels combineren in microfluïdische apparaten31,32,33. De methoden om COL1-hydrogels in microfluïdische kanalen uit te lijnen, zijn echter beperkt tot dunne 2D-"matten" (<40 μm dik) in kanalen <1 mm breed, met een beperkt potentieel om celresponsen te modelleren in uitgelijnde 3D-micro-omgevingen31,34,35,36.

Om uitgelijnde 3D COL1-hydrogels in een microfluïdisch systeem te bereiken, is aangetoond dat, wanneer een zelfassemblerende COL1-oplossing wordt blootgesteld aan lokale extensieve stromen (snelheidsverandering langs de stroomsgewijze richting), de resulterende COL1-hydrogels een mate van vezeluitlijning vertonen die recht evenredig is met de grootte van de extensieve reksnelheid die ze ervaren37, 38. Het microkanaalontwerp in dit protocol is op twee manieren uniek; ten eerste introduceert het gesegmenteerde ontwerp lokale extensieve spanning in de COL1-oplossing, en ten tweede stelt de "tweedelige" constructie de gebruiker in staat om COL1-vezels uit te lijnen en vervolgens het kanaal te demonteren om rechtstreeks toegang te krijgen tot de uitgelijnde vezels in een open formaat. Deze aanpak kan verder worden toegepast om modulaire microfluïdische platforms te ontwikkelen die microfysiologische systemen ontwikkelen met geordende COL1-matrices. Het volgende protocol beschrijft het proces van het fabriceren van gesegmenteerde microkanalen en beschrijft het gebruik van de kanalen om runderatelo COL1 uit te lijnen. Dit protocol biedt ook instructies voor het kweken van cellen op COL1 in een open putformaat en bespreekt het toevoegen van functionaliteit aan het platform met behulp van een modulaire, magnetische basislaag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabricage van het tweedelige kanaal en de modulaire platformbasis

OPMERKING: Het microfluïdische kanaal is opgebouwd uit twee delen - de microfluïdische kanaal "uitsparing", die scheermes gesneden is uit een polydimethyl siloxaan (PDMS) plaat van gedefinieerde dikte, en de kanaalafdekking, die reversibel aan de uitsparing bindt en het kanaal vormt. Het kanaal is omgeven door een poly (methylmethacrylaat) (PMMA) frame dat zal fungeren als een mediareservoir (figuur 1). Het PMMA-frame kan ook worden gebruikt om gespecialiseerde modules magnetisch vast te zetten voor extra functionaliteit.

  1. Scheermessnijkanalen van PDMS-vellen:
    OPMERKING: Het ontwerp van het microfluïdische kanaal voor deze stap is weergegeven in aanvullende figuur 1. Het kanaal bestaat uit vijf segmenten van elk 5 mm lengte en breedtes van 10 mm, 5 mm, 2,5 mm, 1,25 mm en 0,75 mm. De snelheid van de collageenoplossing, geïnjecteerd met een constante stroomsnelheid (50-400 μL·min−1), neemt lokaal langs het kanaal toe naarmate de kanaalbreedte wordt verminderd om extensieve stroom te genereren.
    1. Monteer een 250 μm dikke PDMS-plaat op een plastic dragervel en snijd het microfluïdische ontwerp met behulp van een ambachtelijke snijder met een mesdiepte van 0,5 mm, 1 cm·s−1 snelheid en hoge kracht.
    2. Reinig met behulp van een ultrasoon bad de microfluïdische kanaaluitsparingen gedurende 5 minuten. Spoel de gesonificeerde kanalen in gedeïoniseerd (DI) water en droog ze op een schone kookplaat bij 100 °C gedurende 5 minuten.
    3. Bewaar de kanalen in een schone, afgedekte petrischaal tot gebruik.
  2. Fabriceren van de PDMS-afdekking en oppervlaktepassivering:
    OPMERKING: De kanaaluitsparing uit paragraaf 1.1 vereist een deksel dat erop kan worden geplaatst om een afgesloten kanaal te creëren waarin een COL1-oplossing kan worden geïnjecteerd (aanvullende figuur 1). De afdekking kan worden verwijderd nadat de COL1 zelf is gemonteerd. Om de kans te minimaliseren dat de COL1 in het kanaal zich aan de hoes bindt, wordt de hoes gepassiveerd met runderserumalbumine (BSA). Het malontwerp voor de PDMS-afdekking is aanwezig. De mal moet minstens 2 mm dik zijn en moet een voetafdruk hebben die gelijk is aan de voetafdruk van de microfluïdische kanaaluitsparing. In dit protocol was de matrijsvoetafdruk 35 mm x 15 mm.
    1. Om de mal voor te bereiden, bevestigt u een vel drukgevoelige lijm (PSA) op een 2,5 mm dikke plaat PMMA en lasersnijdt u de gewenste matrijsvorm.
    2. Reinig de lasergesneden PMMA-mal met een vochtig, pluisvrij doekje en verwijder de achterkant van de PSA-film. Bevestig de mal aan een siliciumwafer met een diameter van 100 mm en druk stevig naar beneden.
    3. Bereid PDMS voor in een verhouding van 10:1 (base:crosslinker). Meng krachtig gedurende 1 minuut om een goede menging te garanderen en ontgast het mengsel in een vacuümkamer om luchtbellen te verwijderen.
    4. Giet de ontgaste PDMS-oplossing in de PMMA/siliciummal en laat 20 minuten uitharden op een kookplaat bij 100 °C. Laat de vorm afkoelen, verwijder het uitgeharde PDMS en trim het overtollige met een scheermesje.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de naar siliconen wafers gerichte zijden (platte zijden) van de PDMS-covers naar boven zijn gericht tijdens alle volgende stappen.
    5. Gebruik een biopsiepons met een diameter van 1 mm om inlaat- en uitlaatgaten te maken die overeenkomen met de uiteinden van het microfluïdische kanaal. De kanaaluitsparing uit stap 1.1 kan worden gebruikt als sjabloon om de positie van de gaten te sturen.
    6. Soniceer de afdekking in isopropanol (IPA) gedurende 5 minuten, spoel af met DI-water, droog met een persluchtbron en bewaar vervolgens in een schone, afgedekte petrischaal. Plaats de petrischaal gedurende 1 minuut in een UV-sterilisatiekamer (onbedekt) om te steriliseren.
    7. Afdekken en overbrengen naar een bioveiligheidskast (BSC).
    8. Pipetteer 300 μL van 40 mg•ml-1 runderserumalbumine (BSA) in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op de PDMS-deksels en verdeel de oplossing gelijkmatig met behulp van een pipetpunt. Zet voor gebruik minstens 4 uur in de koelkast bij 4 °C.
    9. Verplaats de deksels van de koelkast naar een BSC, was 5x met 1x PBS en laat ze 10 min drogen in de lucht.
      OPMERKING: De PDMS-hoezen kunnen tot 1 week na het coaten met BSA in de koelkast worden bewaard.
  3. Glutaaraldehyde behandeling van coverslips
    OPMERKING: Het functionaliseren van de coverslips met glutaaraldehyde bindt COL1 covalent aan de coverslip en voorkomt dat de hydrogel loslaat.
    1. Bereid een 2% (v/v) aminopropyltriethoxysilaan (APTES) oplossing in een glazen bekerglas door 1 ml APTES toe te voegen aan 49 ml aceton.
    2. Verdun een 25% glutaaraldehyde-oplossing tot 5% in DI-water. Maak 2 ml oplossing voor elke dekplaat van 24 mm x 50 mm. Voor 24 mm x 24 mm of 22 mm x 22 mm coverslips, maak 1 ml oplossing voor elk.
    3. Reinig de coverslips in een badsonicator gedurende 5 minuten met behulp van IPA. Spoel de IPA van de coverslips af met DI-water. De IPA wordt volledig gespoeld wanneer er een gladde waterfilm op de dekslip te zien is.
    4. Droog de coverslips op een hete plaat gedurende 5 minuten bij 100 °C. Plaats de gedroogde afdekstroken in schone petrischaaltjes en zorg ervoor dat ze elkaar niet overlappen.
    5. Stel met behulp van een corona-ontladingsstokje de coverslips elk 1 minuut bloot aan een corona-ontlading.
      OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in een goed geventileerde ruimte of een chemische kap.
    6. Verwijder de coverslips uit de petrischaal en dompel vervolgens gedurende 10 s binnen 5 minuten na blootstelling aan corona onder in de APTES-oplossing, zodat de coverslip onder water staat.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u bijhoudt welke kant met plasma is behandeld en houd deze naar boven gericht.
    7. Dompel de coverslip vervolgens 10 s onder in aceton en droog af met perslucht. Plaats de droge coverslip terug in de petrischaal, behandelde kant naar boven gericht.
      OPMERKING: Herhaal stap 1.3.5-1.3.7 voor alle coverslips.
    8. Pipetteer 1 ml glutaaraldehyde-oplossing op het oppervlak van elke dekplaat. Bedek zoveel mogelijk oppervlak zonder dat de oplossing over de rand van de afdekplaat loopt. Indien nodig kan meer glutaaraldehyde-oplossing worden toegevoegd. Zorg ervoor dat u het oppervlak niet bekrast met de pipetpunt.
    9. Laat de coverslips 30 minuten in contact met de oplossing zitten en spoel ze vervolgens 20 s af met DI-water. Droog de afdekstroken met perslucht en plaats ze terug in de petrischaaltjes, met de plasmabehandelde kant naar boven.
      OPMERKING: De coverslips kunnen tot 1 week bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard.
  4. Lasersnijden van de modulaire magnetische basis
    OPMERKING: Het ontwerp van de modulaire magnetische basis is weergegeven in aanvullende figuur 1. De modulaire basis dient als een put om de media vast te houden en kan ook worden gebruikt om gespecialiseerde modules magnetisch te bevestigen, zoals beschreven in eerder gepubliceerde werken 22,37,38,39.
    1. Knip de ontwerpen uit de PMMA-laag met behulp van de juiste laserinstellingen, zoals het aantal passages en het vermogen.
      OPMERKING: De laserinstellingen moeten zodanig worden ingesteld dat de magneten in de PMMA-laag kunnen worden gedrukt. Elke laser is anders en de snijparameters moeten experimenteel worden geoptimaliseerd. Voor een 45 W laser worden 100% snelheid, 100% vermogen en 3 gangen aanbevolen voor het snijden van 2 mm tot 2 mm dik PMMA.
    2. Was het lasergesneden deel met water en zeep om vuil uit het lasersnijproces te verwijderen.
      OPMERKING: Gebruik geen oplosmiddelen om de lasergesneden onderdelen te reinigen. Oplosmiddelen kunnen leiden tot de verspreiding van microscheuren in de lasergesneden randen.
  5. Het platform in elkaar zetten
    1. Duw magneten (3/16 in diameter, 1/16 in dik) met de hand in de lasergesneden basis. Een zachte hamer of schroevendraaier kan worden gebruikt om de magneet in te duwen. De dikte van de magneten moet kleiner zijn dan de dikte van de PMMA-basis om ervoor te zorgen dat de magneten gelijk zijn met het oppervlak van de basis.
      OPMERKING: Met de magneten kan de gebruiker functionaliteit aan het platform toevoegen door extra modules te bevestigen.
    2. Verwijder de achterkant van de PSA-plaat en bevestig de basis aan een met glutaaraldehyde behandelde coverslip met de gefunctionaliseerde kant naar boven gericht.
    3. Plaats de PDMS-kanaaluitsparing voorzichtig in de holte die door het frame wordt gedefinieerd. Druk met een pincet met brede punt om luchtbellen te verwijderen en te zorgen voor conformaal contact.
    4. Plaats de met BSA behandelde kanaalafdekking bovenop de kanaaluitsparing, met de BSA-zijde naar beneden gericht. Zorg ervoor dat de vloeistofinlaat- en uitlaatpoorten zijn uitgelijnd met het kanaal.
    5. Het apparaat is klaar voor de COL1-injectie.

2. De COL1-oplossing in het microkanaal injecteren en de afdekking voor celkweektoepassingen verwijderen

  1. De COL1-oplossing voorbereiden
    1. Plaats alle benodigde reagentia (COL1-stamoplossing [6 mg·ml−1], ultrapuur water, 10x PBS, 0,1 M NaOH) op ijs in de bioveiligheidskast.
    2. Bereken het volume van de reagentia als volgt
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
      OPMERKING: Voeg daarom, om 1 ml 2,5 mg ml−1 geneutraliseerd collageen te maken uit een kolf van 6 mg· ml−1 stam, 416,67 μl collageen, 429,16 μl DI-water, 100 μl 10x PBS en 54,16 μl 0,1 m NaOH toe voor een uiteindelijke pH van 7. Voeg 20 μL van 0,1 M NaOH toe om een pH van 9,0 te bereiken.
    3. Voeg de reagentia toe aan een lege injectieflacon van 5 ml in de volgende volgorde: i) COL1-bouillon, ii) DI-water, iii) 10x PBS, iv) 0,1 M NaOH.
      OPMERKING: Gebruik een verdringingspipet om de COL1-oplossing te hanteren. Er kan een aanzienlijk monsterverlies optreden als een gewone pipet wordt gebruikt, wat leidt tot schommelingen in de concentratie van de uiteindelijke oplossing.
    4. Verhoog de pH van de oplossing tot de gewenste pH (meestal tussen 7-9).
  2. Injecteren van de COL1-oplossing
    1. Plaats een spuitpomp, een gekoelde steriele spuit, gekoelde geneutraliseerde COL1-oplossing en een steriele Luer-vergrendelingsnaald met een hoek van 20 G van 90° in een bioveiligheidskast. Laad de COL1-oplossing in de spuit en zorg ervoor dat er geen bubbels worden geïntroduceerd.
    2. Bevestig de naaldpunt van 90° 20 G aan de spuit, plaats de spuit in de spuitpomp, de naald naar beneden gericht en bereid de naald voor met de COL1-oplossing.
    3. Stel de spuitpomp in op het vereiste debiet, tussen 50-2.000 μL/min.
    4. Plaats voorbereide PDMS-kanalen (sectie 1) op een laboratoriumaansluiting en waterpas met de naald.
    5. Steek de naald in de inlaatpoort van het PDMS-kanaal (brede zijde). Injecteer het kanaal totdat een druppel COL1 van ~ 30 μL zich aan de uitlaatzijde verzamelt.
    6. Laat de lab-aansluiting zakken en scheid de naald voorzichtig van het nieuw gevulde kanaal.
    7. Herhaal stap 2.2.5-2.2.9 totdat alle kanalen zijn gevuld met COL1-oplossing.
    8. Laad de gevulde kanalen in de petrischalen naast een schoon, pluisvrij doekje verzadigd met DI-water om uitdroging van de nieuw gevormde COL1-gel te voorkomen.
    9. Dek de petrischaal af en plaats de geladen kanalen in de incubator (37 °C, 95% vochtigheid) gedurende 2 uur voor de afpelstap.
  3. Afpellen en media-equilibratie
    1. Stel de gepolymeriseerde COL1-gel bloot door de PDMS-afdekking met een pincet af te tillen. De BSA-behandeling voorkomt dat COL1 zich aan de hoes hecht.
    2. Voeg 650 μL EGM toe aan de put.
    3. Laat de apparaten minimaal 4 uur in de couveuse (37 °C, 95% vochtigheid) om de gel en de media in evenwicht te brengen. Vervang de media voor het zaaien met cellen
  4. Cellen uitzaaien
    1. Plaats warme 0,25% trypsine en kweekmedia samen met het vereiste aantal pipetten van 5 ml en 10 ml in de bioveiligheidskast.
    2. Kweek menselijke navelstreng-endotheelcellen (HUVECs) tot 80% confluentie in endotheelgroeimedia (EGM) bij 37 °C, in 95% vochtigheid. Plaats de weefselkweekkolf met HUVECs in het BSC na controle van de confluentie onder een microscoop.
    3. Gooi de media weg in de T25-kolf en was de cellen 2x met 1x PBS. Voeg 1 ml trypsine toe aan de kolf en plaats deze gedurende 3 minuten in de couveuse (37 °C, 95% vochtigheid).
    4. Controleer de kolf na 3 minuten onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen volledig van het oppervlak zijn losgemaakt.
    5. Voeg 3 ml EGM (met serum) toe aan de kolf om de trypsine te neutraliseren. Breng vervolgens de celoplossing over met behulp van een pipet van 5 ml in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de conische buis met cellen op 150 x g gedurende 5 min.
    6. Plaats de conische buis in de bioveiligheidskast en gooi het supernatant weg zonder de celkorrel te verstoren. Resuspendeer de cellen in 1 ml verse kweekmedia.
    7. Voeg 15 μL trypan blue en 15 μL van de geresuspendeerde celoplossing toe en meng deze in een conische buis van 1 ml.
    8. Injecteer trypan blue en celoplossing aan beide zijden van een celtelplaat en plaats de dia in een celtelapparaat.
    9. Verdun de celoplossing in endotheelgroeimedia tot de vereiste concentratie op basis van de celconcentratie die wordt verkregen met het celtelapparaat.
      OPMERKING: Een T25-kolf met HUVECs bij 80% confluentie levert ~ 750.000 cellen op ·ml−1 indien verdund in 1 ml media. Het volume van de te zaaien celsuspensie wordt berekend als oppervlakte van het kweekoppervlak × celdichtheid/concentratie van de celsuspensie. Voorbeeld: Om 20.000 cellen·cm−2 in de put van 35 mm x 15 mm te zaaien, heeft men ~140 μL van de celsuspensie nodig.
    10. Zuig de media op de gemanipuleerde COL1-matrix.
    11. Voeg het vereiste volume van de celoplossing toe aan het COL1-substraat en laat de cellen minimaal 4 uur bezinken voordat ze worden afgebeeld.
  5. Labelen van de celkern en het cytoskelet
    1. Zuig de media uit de cellen en was 3x met 1x PBS, 500 μL in elke wasbeurt. Bedek de cellaag met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij RT.
    2. Zuig de paraformaldehyde aan en was met 1x PBS Tween-20 gedurende 5 min.
    3. Permeabiliseer het celmembraan met behulp van 500 μL 0,1% Triton-X-oplossing in PBS gedurende 15 minuten. Wassen met 1x PBS Tween-20 gedurende 5 min.
    4. Blokkeer de niet-specifieke bindingsplaatsen met 500 μL van 4% BSA in PBS gedurende 30 minuten bij RT.
    5. Verdun de falloidine-actine fluorescerende labeloplossing in 4% BSA (1 μL bouillon in 400 μL BSA).
    6. Zuig de BSA-oplossing op, voeg de falloïdine-oplossing toe aan de cellen en wacht 30 minuten bij RT.
    7. Verdun de nucleaire vlek in 4% BSA (1 μL in 500 μL), zuig de falloïdine op, voeg de werkende nucleaire vlekoplossing toe en wacht 15 minuten bij RT.
    8. Zuig de nucleaire vlekwerkoplossing op, was met PBS Tween-20 3x gedurende 5 minuten elk en vervang door 1x PBS voordat u beeldvorming maakt.
    9. Beeld met behulp van een epifluorescente microscoop met behulp van het FITC-kanaal (ex 491 nm/em 516 nm) en DAPI-kanaal (ex 360 nm/em 460 nm) met een 40x lens. Beeld het collageen af met behulp van een laserscanning confocaal in de reflectiemodus met behulp van de 488 nm laserlijn (15% vermogen) en 40x water-onderdompeling objectief.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wanneer een zelfassemblerende COL1-oplossing door een kanaal met afnemende doorsnede stroomt, neemt de stroomsgewijze snelheid (v x) van de COL1-oplossing lokaal toe met een magnitude, ∂v x, langs de lengte van de vernauwing tussen de twee segmenten (∂x), wat resulteert in een extensieve reksnelheid (ε̇) waarbij ε̇ = ∂v x/∂x. De extensieve reksnelheid kan worden berekend uit de vloeistofsnelheid, die wordt gemeten met behulp van deeltjesbeeldvelocimetrie (PIV), zoals te zien is in figuur 2.

Eerder is aangetoond dat lokale extensieve spanning de uitlijning van COL1-vezels over lange afstandbevordert 37,38,40 (figuur 3). De uitlijning van COl1 wordt direct beïnvloed door de grootte van de extensieve reksnelheid in de vernauwing en kan worden waargenomen om zich uniform uit te strekken over de 5 mm lengte van het segment. Om de vezeluitlijning te meten, werden confocale reflectiemicroscopie (CRM) -afbeeldingen van vezels gebruikt om een histogram van vezeluitlijning te maken. De uitlijningscoëfficiënt (CoA) is de fractie van vezels die zijn uitgelijnd binnen ±15° van de moduswaarde in het histogram 38,42,43,44. CoA varieert van 0-1 met waarden >0,5 werden als uitgelijnd beschouwd.

Het injecteren van een 3D-hydrogel in traditionele, afgesloten microkanalen beperkt waar media en cellen in de matrix kunnen worden geïntroduceerd. Het tweedelige kanaal in dit protocol overwint de beperking van toegang tot een hydrogel in een kanaal door de gebruiker in staat te stellen de kanaalafdekking op te tillen en rechtstreeks toegang te krijgen tot de volledige COL1-matrix. Channel lift-off wordt mogelijk gemaakt door de glazen coverslip te functionaliseren met glutaaraldehyde om COL1-bevestiging te bevorderen met behulp van amine-aldehyde-amine-interacties en de PDMS-afdekking te functionaliseren met BSA om COL1-adsorptie op de cover te voorkomen. De COL1-vezeluitlijning blijft onaangetast na het optillen van de hoes, zoals visueel te zien is in figuur 4.

Van uitgelijnde COL1-substraten is bekend dat ze de celuitlijning beïnvloeden door uitsteeksels 9,12,45,46 te sturen en, op hun beurt, de organisatie van spanningsfilamenten. Endotheelcellen in de niet-uitgelijnde en uitgelijnde COL1-segmenten werden in beeld gebracht om de cellulaire respons op de COL1-matrices te onderzoeken die met behulp van dit protocol zijn ontwikkeld. De cellen werden 4 uur na het zaaien gefixeerd en gekleurd. Representatieve beelden van de HUVEC's gekweekt op het uitgelijnde segment van de matrix toonden een verhoogde actinevezeluitlijning in vergelijking met de HUVECs op het segment met willekeurige vezels (figuur 5).

Figure 1
Figuur 1: Schema met de assemblage van de lagen. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Ahmed et al.38. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Getrapte kanaal- en extensieve reksnelheden . (A) Schema van het getrapte kanaal met afmetingen. Outset toont de berekening van de extensieve reksnelheid. De extensieve reksnelheid in elke vernauwing wordt berekend op basis van de snelheid gemeten met behulp van particle image velocimetry (PIV). (B) De extensieve reksnelheden in elke vernauwing. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Ahmed et al.38. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Confocale reflectiebeelden van COL1-vezels in elk microkanaalsegment na COL1-polymerisatie. De toename van de mate van vezeluitlijning van segment (a) naar segment (e) kan visueel worden waargenomen. Schaalbalk = 25 μm. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Ahmed et al.38. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Confocale reflectiebeelden van COL1-vezels die laten zien dat de vezeluitlijning onaangetast blijft door het verwijderen van de kanaalafdekking. Schaalbalk = 25 μm. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Ahmed et al.38. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve beelden van cellen en COL1-vezels. Representatieve afbeeldingen van cellen en COL1-vezels in segment (e) van de COL1-matrix en segment (a) van de COL1-matrix. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Figuur met lasergesneden componenten met afmetingen. (A) Kanaal, (B) magnetische basis en (C) kanaalafdekkingsvorm. Alle afmetingen in millimeters. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protocollen voor het genereren van COL1-matrices met uitgelijnde vezels zijn beschreven met behulp van magnetische methoden, de directe toepassing van mechanische spanning en microfluïdische technieken47. Microfluïdische benaderingen worden vaak gebruikt om microfysiologische systemen te creëren vanwege hun goed gedefinieerde stroom- en transportkenmerken, die nauwkeurige controle over de biochemische micro-omgeving mogelijk maken. Aangezien uitgelijnde COL1-vezels belangrijke instructieve signalen bieden tijdens pathofysiologische processen zoals wondgenezing, tumorcelinvasie en weefselontwikkeling, is het genereren van uitgelijnde COL1-matrices in microfluïdische systemen een stap in de richting van het ontwikkelen van biologisch relevante microfysiologische systemen.

Dit protocol biedt de mogelijkheid om op millimeterschaal uitgelijnde COL1-matrices te fabriceren met regio's van gedefinieerde vezeluitlijning. Om uitlijning te induceren, wordt een microfluïdisch kanaal met stapsgewijze verminderingen in breedte gebruikt. Naarmate een zelfassemblerende COL1-oplossing met een constant debiet door het kanaal stroomt, neemt de stroomsnelheid van de oplossing toe bij de vernauwingen, wat resulteert in lokale extensieve spanning en uitlijning op lange afstand van de zelfassemblerende COL1-vezels. In vergelijking met door de schuifstroom geïnduceerde vezeluitlijning, hebben we vezeluitlijning waargenomen in kanalen met een dikte tot 250 μm, waardoor we 3D-hydrogels in een microfluïdisch kanaal konden maken. Aangezien COL1-vezeluitlijning afhankelijk is van de extensieve reksnelheid, kunnen gebruikers het geleverde kanaal wijzigen of aangepaste kanaalontwerpen ontwikkelen om extensieve stroom te genereren en COL1-matrices van de gewenste grootte en vorm te maken. Extra flexibiliteit wordt geboden door de zachte lithografievrije fabricage van de kanalen, waardoor snelle prototyping van kanaalontwerpen mogelijk is.

De tweedelige kanaalbenadering die in dit protocol wordt gepresenteerd, overwint de beperkingen van toegang tot een 3D-hydrogel in microkanalen. Een tweedelig kanaal biedt directe toegang tot de COL1-hydrogel, waarbij de kanaalafdekking kan worden opgetild om de COL1-matrix in het kanaal te onthullen. Directe toegang tot de COL1 na polymerisatie elimineert de noodzaak om cellen te mengen in de COL1-precursoroplossing, waardoor een gebruiker de COL1-precursoroplossing gedurende langere perioden bij niet-fysiologische pH en lage temperaturen kan manipuleren. Verder kan een modulaire aanpak worden gebruikt om de cellen te positioneren en laag-voor-laag biofabricagemogelijkheden te bieden, zoals aangetoond in ons eerdere werk. Modules kunnen worden gebruikt om membranen voor co-cultuur te introduceren, continue perfusie te introduceren en ook meerlaagse ECM-constructieste maken 22,38,39. Aangepaste modules kunnen ook worden vervaardigd, afhankelijk van de experimentele behoeften. In combinatie met magnetische vergrendeling is de modulaire aanpak ook zeer geschikt voor experimenten die met de tijd functionaliteit moeten toevoegen.

Er zijn enkele kritieke stappen die in dit protocol moeten worden overwogen. Alle componenten, inclusief de kanaaluitsparing, afdekking, afdekstroken en modulaire basis, moeten op de juiste manier worden gereinigd om een goede hechting en chemische functionalisering te garanderen. Het collageen moet op ijs worden bereid en alle componenten moeten koud worden gehouden om consistentie te garanderen. Eenmaal bereid, moet de collageenoplossing binnen 10 minuten na bereiding worden gebruikt. De uiteindelijke pH van de collageenoplossing moet worden gemeten met behulp van een pH-sonde om consistentie te garanderen. Een schoon, vochtig doekje moet met het collageen in de petrischaal worden geplaatst om ervoor te zorgen dat het collageen niet uitdroogt in de warme couveuse.

Enkele wijzigingen en probleemoplossing van het protocol omvatten het volgende. (i) Als media lekken tijdens de celkweek, moet men ervoor zorgen dat het PMMA-frame en de afdekplaten worden bevestigd zonder openingen in de kleeflaag. (ii) Als de magneten niet vlak in de basislaag zijn geplaatst, voorkomen ze dat de dekplaat zich aan de basis hecht, wat resulteert in openingen. iii) De glutaaraldehydecoating op de deklaag kan indien nodig ook een lagere concentratie hebben (tot 0,1%). De optimale concentratie van glutaaraldehyde om toxiciteit te voorkomen, moet experimenteel worden bepaald voor elke cellijn die in het experiment moet worden gebruikt, aangezien glutaaraldehyde toxiciteit voor cellen kan opleveren. (iv) Men kan extra materialen zoals hyaluronzuur, fibronectine of fluorescerende kralen samen met collageen bevatten om de matrix verder aan te passen. (v) Indien nodig kan het kanaalontwerp worden aangepast om langere of kortere segmenten te hebben om grens- en randeffecten te voorkomen48.

Dit protocol heeft de volgende beperkingen. Atelo rundercollageen is een zacht materiaal (G' <100 Pa) bij 2,5 mg·ml−1. Om de gelstijfheid te verhogen, kunnen onderzoekers hogere concentraties collageen gebruiken of crosslinking-middelen introduceren. Hoewel dit protocol alleen is gevalideerd voor het uitlijnen van collageenmatrices tot 250 μm dik, kunnen dikkere matrices worden ontwikkeld door de kanaaldikte te vergroten en de stroomsnelheden te optimaliseren om voldoende extensieve reksnelheden te introduceren.

Verwacht wordt dat dit protocol van nut zal zijn voor onderzoekers die weefselspecifieke geordende micro-omgevingen willen ontwikkelen. Het kan ook worden gebruikt als een gids voor het creëren van modulaire fluidic platforms om microfysiologische systemen op te zetten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of Health onder toekenningsnummer R21GM143658 en door de National Science Foundation onder subsidienummer 2150798. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de financieringsagentschappen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) Sigma Aldrich 440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip Jensen Global JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet KJ Magnetics D31
3M (TC) 12X12-6-467MP DigiKey 3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% Signa Aldrich 179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER Electro-Technic Products 12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar VWR AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet McMaster-Carr 8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested VWR 45000-666
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CT-FIRE software LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL Lonza CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL VWR VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50 Graphtec CE LITE-50
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer McMaster-Carr 87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells Thermo Fisher Scientific C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
Isopropanol Fisher Scientific A4154
Laser cutter Full Spectrum 20x12 H-series
Microfluidics Syringe pump New Era Syringe Pumps NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E Gilson FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen Advanced BioMatrix 5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4 VWR 70011044.00
PBS pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 Alfa Aesar J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 USCUTTER GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip Restek 22766.00
Silicon wafer University wafer 452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g VWR BDH9292-500G
Sylgard 184 VWR 102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 Thermo Fisher Scientific 28352.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  3. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  4. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  5. Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058 (2011).
  6. Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
  7. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  8. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11 (2008).
  9. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  10. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  11. Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
  12. Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107 (2018).
  13. Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
  14. Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
  15. Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780 (2019).
  16. Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323 (2018).
  17. Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
  18. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  19. Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506 (2018).
  20. Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016 (2017).
  21. Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
  22. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341 (2016).
  23. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
  24. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769 (2022).
  25. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  26. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
  28. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
  29. Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848 (2021).
  30. Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911 (2018).
  31. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
  32. Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
  33. Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276 (2021).
  34. Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
  35. Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
  36. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  37. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
  38. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
  39. Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
  40. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  41. Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931 (2020).
  42. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  43. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  44. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
  45. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  46. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
  47. Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).

Tags

Intrekking Nummer 187
Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M.… More

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M. R., Vidas, J. A., Byerley, A. M., Mansouri, M., Day, S. W., Abhyankar, V. V. Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment. J. Vis. Exp. (187), e64457, doi:10.3791/64457 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter