Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microengineering 3D Collagen Hydrogels med långväga fiberinriktning

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

Detta protokoll demonstrerar användningen av en mikrofluidisk kanal med förändrad geometri längs vätskeflödesriktningen för att generera förlängningstöjning (sträckning) för att justera fibrer i en 3D-kollagenhydrogel (<250 μm i tjocklek). Den resulterande inriktningen sträcker sig över flera millimeter och påverkas av förlängningstöjningshastigheten.

Abstract

Justerade kollagen I (COL1) fibrer styr tumörcellens rörlighet, påverkar endotelcellmorfologi, kontrollerar stamcellsdifferentiering och är ett kännetecken för hjärt- och muskuloskeletala vävnader. För att studera cellrespons på anpassade mikromiljöer in vitro har flera protokoll utvecklats för att generera COL1-matriser med definierad fiberinriktning, inklusive magnetiska, mekaniska, cellbaserade och mikrofluidiska metoder. Av dessa erbjuder mikrofluidiska metoder avancerade funktioner som noggrann kontroll över vätskeflöden och den cellulära mikromiljön. De mikrofluidiska metoderna för att generera anpassade COL1-matriser för avancerade in vitro-odlingsplattformar har dock begränsats till tunna "mattor" (<40 μm i tjocklek) av COL1-fibrer som sträcker sig över avstånd mindre än 500 μm och inte bidrar till 3D-cellodlingsapplikationer. Här presenterar vi ett protokoll för att tillverka 3D COL1-matriser (130-250 μm i tjocklek) med millimeterskaleregioner med definierad fiberinriktning i en mikrofluidisk enhet. Denna plattform ger avancerade cellodlingsfunktioner för att modellera strukturerade vävnadsmikromiljöer genom att ge direkt tillgång till den mikrokonstruerade matrisen för cellodling.

Introduction

Celler finns i ett komplext 3D-fibröst nätverk som kallas extracellulär matris (ECM), varav huvuddelen består av det strukturella proteinet kollagen typ I (COL1)1,2. De biofysiska egenskaperna hos ECM ger vägledande ledtrådar till celler, och som svar omformar celler ECM-mikroarkitekturen 3,4,5. Dessa ömsesidiga cell-matrisinteraktioner kan ge upphov till anpassade COL1-fiberdomäner6 som främjar angiogenes och cellinvasion i tumörmiljön 7,8,9 och påverkar cellmorfologin 10,11,12, polarisering 13 och differentiering 14. Inriktade kollagenfibrer främjar också sårläkning 15, spelar en nyckelroll i vävnadsutveckling16 och bidrar till långväga cellkommunikation17,18. Därför är replikering av den ursprungliga COL1-fibermikroarkitekturen in vitro ett viktigt steg mot att utveckla strukturerade modeller för att studera cellsvar på anpassade mikromiljöer.

Mikrofluidiska cellodlingssystem har etablerats som en föredragen teknik för att utveckla mikrofysiologiska system (MPS)19,20,21,22,23. Genom att utnyttja gynnsamma skalningseffekter i mikroskala ger dessa system exakt kontroll över vätskeflöden, stöder kontrollerad införande av mekaniska krafter och definierar den biokemiska mikromiljön inom en mikrokanal 21,24,25,26,27. MPS-plattformar har använts för att modellera vävnadsspecifika mikromiljöer och studera interaktioner mellan flera organ28. Samtidigt har hydrogeler undersökts i stor utsträckning för att rekapitulera 3D-mekaniken och det biologiska inflytandet av ECM som observeras in vivo29,30. Med en växande tonvikt på att integrera 3D-kultur med mikrofluidiska plattformar kan många tillvägagångssätt kombinera COL1-hydrogeler i mikrofluidiska enheter31,32,33. Metoderna för att anpassa COL1-hydrogeler i mikrofluidiska kanaler har dock begränsats till tunna 2D-"mattor" (<40 μm i tjocklek) i kanaler <1 mm breda, vilket ger begränsad potential att modellera cellsvar i inriktade 3D-mikromiljöer31,34,35,36.

För att uppnå anpassade 3D COL1-hydrogeler i ett mikrofluidiskt system har det visats att när en självmonterande COL1-lösning utsätts för lokala förlängningsflöden (hastighetsförändring längs strömriktningen) uppvisar de resulterande COL1-hydrogelerna en grad av fiberinriktning som är direkt proportionell mot storleken på den förlängningstöjningshastighet de upplever37, 38. Mikrokanaldesignen i detta protokoll är unik på två sätt; För det första introducerar den segmenterade designen lokal förlängningsbelastning till COL1-lösningen, och för det andra tillåter dess "tvådelade" konstruktion användaren att rikta in COL1-fibrer och sedan demontera kanalen för att direkt komma åt de inriktade fibrerna i ett öppet format. Detta tillvägagångssätt kan vidare användas för att utveckla modulära mikrofluidiska plattformar som utvecklar mikrofysiologiska system med ordnade COL1-matriser. Följande protokoll beskriver processen för tillverkning av segmenterade mikrokanaler och beskriver användningen av kanalerna för att anpassa bovint atelo COL1. Detta protokoll ger också instruktioner för odling av celler på COL1 i ett öppet brunnsformat och diskuterar att lägga till funktionalitet till plattformen med hjälp av ett modulärt, magnetiskt baslager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tillverkning av den tvådelade kanalen och modulära plattformsbasen

OBS: Den mikrofluidiska kanalen är konstruerad med två delar - den mikrofluidiska kanalen "cutout", som är rakhyvel skuren från ett polydimetylsiloxan (PDMS) ark med definierad tjocklek och kanalkåpan, som reversibelt binder till utskärningen och bildar kanalen. Kanalen är omgiven av en poly(metylmetakrylat) (PMMA) ram som kommer att fungera som en mediereservoar (figur 1). PMMA-ramen kan också användas för att magnetiskt låsa specialmoduler för ökad funktionalitet.

  1. Rakhyvelskärkanaler från PDMS-ark:
    OBS: Den mikrofluidiska kanaldesignen för detta steg finns i kompletterande figur 1. Kanalen består av fem segment med längd 5 mm vardera och bredder på 10 mm, 5 mm, 2,5 mm, 1,25 mm och 0,75 mm. Kollagenlösningens hastighet, injicerad med en konstant flödeshastighet (50-400 μl · min-1), ökar lokalt längs kanalen när kanalbredden minskas för att generera förlängningsflöde.
    1. Montera ett 250 μm tjockt PDMS-ark på en plastbärark och rakhyvla den mikrofluidiska designen med en hantverksskärare med ett bladdjup på 0,5 mm, 1 cm · s-1 hastighet och hög kraft.
    2. Använd ett ultraljudsbad och rengör de mikrofluidiska kanalutskärningarna i 5 minuter. Skölj de sonicated kanalerna i avjoniserat (DI) vatten och torka dem på en ren kokplatta vid 100 ° C i 5 min.
    3. Förvara kanalerna i en ren, täckt petriskål tills de används.
  2. Tillverkning av PDMS-locket och ytpassivering:
    OBS: Kanalutskärningen från avsnitt 1.1 kräver ett lock som kan placeras ovanpå det för att skapa en sluten kanal som en COL1-lösning kan injiceras i (kompletterande figur 1). Locket kan tas bort efter att COL1 har monterats själv. För att minimera risken för att COL1 i kanalen binder till omslaget passiveras locket med bovint serumalbumin (BSA). Formdesignen för PDMS-locket tillhandahålls. Formen måste vara minst 2 mm tjock och bör ha ett fotavtryck som är lika med fotavtrycket för den mikrofluidiska kanalutskärningen. I detta protokoll var formfotavtrycket 35 mm x 15 mm.
    1. För att förbereda formen, fäst ett ark tryckkänsligt lim (PSA) på ett 2,5 mm tjockt ark PMMA och laserskär önskad formform.
    2. Rengör den laserskurna PMMA-formen med en fuktig, luddfri torka och ta bort baksidan från PSA-filmen. Fäst formen på en kiselskiva med en diameter på 100 mm bt och tryck ner ordentligt.
    3. Förbered PDMS i förhållandet 10:1 (bas:tvärbindare). Blanda kraftigt i 1 min för att säkerställa korrekt blandning och avgasa blandningen i en vakuumkammare för att avlägsna luftbubblor.
    4. Häll den avgasade PDMS-lösningen i PMMA/kiselformen och härda på en värmeplatta vid 100 °C i 20 minuter. Låt formen svalna, ta bort det härdade PDMS och trimma eventuellt överskott med ett rakblad.
      Se till att kiselskivans sidor (plana sidor) på PDMS-kåporna är vända uppåt i alla följande steg.
    5. Använd en biopsi stans med en diameter på 1 mm för att skapa inlopps- och utloppshål som motsvarar ändarna på mikrofluidkanalen. Kanalutskärningen från steg 1.1 kan användas som mall för att styra hålens position.
    6. Sonicate locket i isopropanol (IPA) i 5 min, skölj med DI-vatten, torka med en tryckluftskälla och förvara sedan i en ren, täckt petriskål. Placera petriskålen i en UV-steriliseringskammare (utan lock) i 1 minut för att sterilisera.
    7. Täck över och överför till ett biosäkerhetsskåp (BSC).
    8. Pipettera 300 μl 40 mg•ml-1 bovint serumalbumin (BSA) i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på PDMS-locken och fördela lösningen jämnt med en pipettspets. Förvaras i kylskåp vid 4 °C i minst 4 timmar före användning.
    9. Flytta locken från kylskåpet till en BSC, tvätta 5x med 1x PBS och låt dem torka i luft i 10 minuter.
      PDMS-skydden kan förvaras i kylen i upp till 1 vecka efter beläggning med BSA.
  3. Glutaraldehydbehandling av täckglas
    OBS: Funktionalisering av täckglasen med glutaraldehyd binder kovalent COL1 till täckglaset och förhindrar att hydrogelen lossnar.
    1. Bered en 2% (v / v) aminopropyltrietoxisilan (APTES) lösning i en glasbägare genom att tillsätta 1 ml APTES till 49 ml aceton.
    2. Späd en 25% glutaraldehydlösning till 5% i DI-vatten. Gör 2 ml lösning för varje 24 mm x 50 mm täckglas. För 24 mm x 24 mm eller 22 mm x 22 mm täckglas, gör 1 ml lösning för varje.
    3. Rengör täckglasen i en badljudläkare i 5 minuter med IPA. Skölj bort IPA från täckglasen med DI-vatten. IPA sköljs helt när en slät film av vatten kan ses på täckglaset.
    4. Torka täckglasen på värmeplatta i 5 min vid 100 °C. Lägg de torkade täckglasen i rena petriskålar, så att de inte överlappar varandra.
    5. Använd en koronaurladdningsstav och utsätt täckglasen för en koronaurladdning i 1 minut vardera.
      OBS: Detta steg ska utföras i ett väl ventilerat område eller en kemisk huv.
    6. Ta bort täckglasen från petriskålen och sänk sedan ner i APTES-lösningen i 10 s inom 5 minuter efter koronaexponering, så att täckglaset är nedsänkt.
      OBS: Se till att hålla reda på vilken sida som behandlades med plasma och håll den uppåt.
    7. Sänk sedan ner täckglaset i aceton i 10 sekunder och torka med tryckluft. Lägg tillbaka det torra täckglaset i petriskålen med behandlad sida uppåt.
      Upprepa steg 1.3.5-1.3.7 för alla täckglas.
    8. Pipettera 1 ml glutaraldehydlösning på ytan av varje täckglas. Täck så mycket yta som möjligt utan att låta lösningen spilla över kanten på täckglaset. Mer glutaraldehydlösning kan tillsättas vid behov. Se till att inte repa ytan med pipettspetsen.
    9. Låt täckglasen sitta i kontakt med lösningen i 30 minuter och skölj sedan med DI-vatten i 20 sekunder. Torka täckglasen med tryckluft och lägg tillbaka dem i petriskålarna med plasmabehandlad sida uppåt.
      OBS: Täckglasen kan förvaras i upp till 1 vecka vid rumstemperatur (RT).
  4. Laserskärning av den modulära magnetiska basen
    OBS: Utformningen av den modulära magnetiska basen finns i kompletterande figur 1. Den modulära basen fungerar som en brunn för att hålla media och kan också användas för att magnetiskt fästa specialiserade moduler, som beskrivs i tidigare publicerade verk 22,37,38,39.
    1. Klipp ut designerna från PMMA-lagret med lämpliga laserinställningar som antal pass och effekt.
      OBS: Laserinställningarna bör justeras så att magneterna kan pressmonteras i PMMA-lagret. Varje laser är annorlunda, och skärparametrarna måste optimeras experimentellt. För en 45 W laser rekommenderas 100% hastighet, 100% effekt och 3 pass för skärning av 2 mm till 2 mm tjock PMMA.
    2. Tvätta den laserskurna delen med tvål och vatten för att ta bort skräp från laserskärningsprocessen.
      OBS: Använd inte lösningsmedel för att rengöra de laserskurna delarna. Lösningsmedel kan resultera i spridning av mikrosprickor i de laserskurna kanterna.
  5. Montering av plattformen
    1. Tryck in magneterna (3/16 i diameter, 1/16 i tjocka) för hand i den laserskurna basen. En mjuk hammare eller skruvmejselände kan användas för att hjälpa till att trycka in magneten. Tjockleken på magneterna måste vara mindre än tjockleken på PMMA-basen för att säkerställa att magneterna är i linje med basens yta.
      OBS: Magneterna tillåter användaren att lägga till funktionalitet till plattformen genom att bifoga ytterligare moduler.
    2. Dra av baksidan från PSA-arket och fäst basen på ett glutaraldehydbehandlat täckglas med den funktionaliserade sidan uppåt.
    3. Placera försiktigt PDMS-kanalutskärningen i hålrummet som definieras av ramen. Tryck ner med pincett med bred spets för att ta bort luftbubblor och säkerställa konform kontakt.
    4. Placera det BSA-behandlade kanallocket ovanpå kanalutskärningen, med BSA-sidan nedåt. Se till att vätskeinlopps- och utloppsportarna är i linje med kanalen.
    5. Enheten är klar för COL1-injektionen.

2. Injicera COL1-lösningen i mikrokanalen och ta bort locket för cellodlingsapplikationer

  1. Förbereda COL1-lösningen
    1. Placera alla nödvändiga reagens (COL1-stamlösning [6 mg·ml−1], ultrarent vatten, 10x PBS, 0,1 M NaOH) på is i biosäkerhetsskåpet.
    2. Beräkna volymen reagens enligt följande
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
      OBS: För att göra 1 ml 2,5 mg · ml − 1 neutraliserat kollagen från ett 6 mg · ml − 1 lager, tillsätt 416,67 μL kollagen, 429,16 μL DI-vatten, 100 μL 10x PBS och 54,16 μL 0,1 M NaOH för ett slutligt pH av 7. Tillsätt 20 μL 0,1 M NaOH för att uppnå ett pH på 9,0.
    3. Tillsätt reagenserna i en tom 5 ml injektionsflaska i följande ordning: i) COL1-lager, ii) DI-vatten, iii) 10x PBS, iv) 0,1 M NaOH.
      Använd en förskjutningspipett för att hantera COL1-lösningen. Betydande provförlust kan uppstå om en vanlig pipett används, vilket leder till fluktuationer i den slutliga lösningskoncentrationen.
    4. Höj lösningens pH till önskat pH (vanligtvis mellan 7-9).
  2. Injicera COL1-lösningen
    1. Placera en sprutpump, en kyld steril spruta, kyld neutraliserad COL1-lösning och en steril 20 G 90° vinkelspets Luer locknål i ett biosäkerhetsskåp. Fyll på COL1-lösningen i sprutan och var noga med att undvika bubblor.
    2. Sätt fast nålspetsen på 90° 20 G på sprutan, fyll på sprutan i sprutpumpen med nålen nedåt och fyll nålen med COL1-lösningen.
    3. Ställ in sprutpumpen på önskat flöde, mellan 50-2 000 μl/min.
    4. Placera förberedda PDMS-kanaler (avsnitt 1) på ett labbuttag och jämna med nålen.
    5. För in nålen i inloppsporten på PDMS-kanalen (bred sida). Injicera kanalen tills en ~30 μL droppe COL1 samlas på utloppssidan.
    6. Sänk labuttaget och separera försiktigt nålen från den nyfyllda kanalen.
    7. Upprepa steg 2.2.5-2.2.9 tills alla kanaler har fyllts med COL1-lösning.
    8. Ladda de fyllda kanalerna i petriskålarna tillsammans med en ren, luddfri torka mättad med DI-vatten för att förhindra uttorkning av den nybildade COL1-gelén.
    9. Täck petriskålen och placera de laddade kanalerna i inkubatorn (37 °C, 95% luftfuktighet) i 2 timmar före avskalningssteget.
  3. Avskalning och mediejämvikt
    1. Exponera den polymeriserade COL1-gelen genom att lyfta av PDMS-locket med pincett. BSA-behandlingen förhindrar att COL1 fäster på locket.
    2. Tillsätt 650 μL extra bolagsstämma i brunnen.
    3. Låt apparaterna ligga i inkubatorn (37 °C, 95 % luftfuktighet) i minst 4 timmar för att balansera gel och media. Byt ut mediet före seedning med celler
  4. Seeding celler
    1. Placera varmt 0,25% trypsin och odlingsmedia tillsammans med önskat antal 5 ml och 10 ml pipetter i biosäkerhetsskåpet.
    2. Odla humana navelvenendotelceller (HUVEC) till 80% sammanflöde i endoteltillväxtmedier (EGM) vid 37 °C, i 95% luftfuktighet. Placera vävnadsodlingskolven som innehåller HUVECs i BSC efter kontroll av sammanflödet under ett mikroskop.
    3. Kassera mediet i T25-kolven och tvätta cellerna 2x med 1x PBS. Tillsätt 1 ml trypsin till kolven och placera den i inkubatorn (37 °C, 95% luftfuktighet) i 3 minuter.
    4. Kontrollera kolven under mikroskopet efter 3 minuter för att säkerställa att cellerna är helt lossna från ytan.
    5. Tillsätt 3 ml EGM (med serum) till kolven för att neutralisera trypsinet. Överför sedan celllösningen med en 5 ml pipett till ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera det koniska röret som innehåller celler vid 150 x g i 5 minuter.
    6. Placera det koniska röret i biosäkerhetsskåpet och kassera supernatanten utan att störa cellpelleten. Resuspendera cellerna i 1 ml färskt odlingsmedium.
    7. Tillsätt och blanda 15 μl trypanblått och 15 μl av den återsuspenderade celllösningen i ett 1 ml koniskt rör.
    8. Injicera trypanblått och celllösning på båda sidor av ett cellräkningsglas och sätt in objektglaset i en cellräkningsanordning.
    9. Späd celllösningen i endoteltillväxtmedia till önskad koncentration baserat på cellkoncentrationen erhållen från cellräkningsanordningen.
      OBS: En T25-kolv HUVECs vid 80% sammanflöde ger ~ 750 000 celler · ml-1 om den späds i 1 ml media. Volymen av den cellsuspension som skall sås beräknas som arean av odlingsytan × celldensiteten/koncentrationen av cellsuspensionen. Exempel: För att fröa 20 000 celler · cm − 2 i brunnen 35 mm x 15 mm behöver man ~ 140 μL av cellsuspensionen.
    10. Aspirera mediet på den konstruerade COL1-matrisen.
    11. Tillsätt den erforderliga volymen av celllösningen på COL1-substratet och låt cellerna sedimentera i minst 4 timmar före avbildning.
  5. Märkning av cellkärnan och cytoskeletten
    1. Aspirera mediet från cellerna och tvätta 3x med 1x PBS, 500 μL i varje tvätt. Täck cellskiktet med 4% paraformaldehyd i 15 minuter vid rumstemperatur.
    2. Aspirera paraformaldehyden och tvätta med 1x PBS Tween-20 i 5 min.
    3. Permeabilisera cellmembranet med 500 μL 0,1% Triton-X-lösning i PBS i 15 minuter. Tvätta med 1x PBS Tween-20 i 5 min.
    4. Blockera de icke-specifika bindningsställena med 500 μl 4 % BSA i PBS i 30 minuter vid rumstemperatur.
    5. Späd den fluorescerande etikettlösningen av falloidinaktin i 4 % BSA (1 μl i 400 μl BSA).
    6. Aspirera BSA-lösningen, tillsätt falloidinlösningen till cellerna och vänta i 30 minuter vid RT.
    7. Späd kärnfläcken i 4% BSA (1 μL i 500 μL), aspirera falloidinet, tillsätt den fungerande kärnfläcklösningen och vänta i 15 minuter vid RT.
    8. Aspirera arbetslösningen för kärnfläcken, tvätta med PBS Tween-20 3x i 5 minuter vardera och ersätt med 1x PBS före avbildning.
    9. Bild med ett epifluorescerande mikroskop med FITC-kanalen (ex 491 nm/em 516 nm) och DAPI-kanalen (ex 360 nm/em 460 nm) med ett 40x-objektiv. Avbilda kollagenet med hjälp av en laserskanningskonfokal i reflektansläget med 488 nm laserlinje (15% effekt) och 40x vattennedsänkningsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

När en självmonterande COL1-lösning strömmar genom en kanal med minskande tvärsnittsarea ökar COL1-lösningens strömvisa hastighet (v x) lokalt med en storlek, ∂v x, längs längden på förträngningen mellan de två segmenten (∂x), vilket resulterar i en förlängningstöjningshastighet (ε̇) där ε̇ = ∂v x / ∂x. Förlängningstöjningshastigheten kan beräknas från vätskehastigheten, som mäts med hjälp av partikelbildvelocimetri (PIV), som visas i figur 2.

Tidigare har det visats att lokal förlängningsstam främjar långväga COL1-fiberinriktning37,38,40 (figur 3). Inriktningen av COl1 påverkas direkt av storleken på förlängningstöjningshastigheten i förträngningen och kan observeras sträcka sig jämnt över segmentets 5 mm längd. För att mäta fiberinriktningen användes konfokal reflektansmikroskopi (CRM) bilder av fibrer för att skapa ett histogram av fiberinriktning. Justeringskoefficienten (CoA) är fraktionen av fibrer inriktade inom ±15° av modvärdet i histogrammet 38,42,43,44. CoA sträcker sig från 0-1 med värden >0,5 ansågs vara anpassade.

Att injicera en 3D-hydrogel i traditionella, förseglade mikrokanaler begränsar var media och celler kan införas i matrisen. Den tvådelade kanalen i detta protokoll övervinner begränsningen av åtkomst till en hydrogel i en kanal genom att låta användaren lyfta av kanalkåpan och direkt komma åt hela COL1-matrisen. Kanallyft möjliggörs genom att funktionalisera glastäcket med glutaraldehyd för att främja COL1-fästning med amin-aldehyd-amininteraktioner och funktionalisera PDMS-locket med BSA för att förhindra COL1-adsorption på locket. COL1-fiberinriktningen förblir opåverkad efter att locket lyfts av, vilket ses visuellt i figur 4.

Inriktade COL1-substrat är kända för att påverka cellinriktningen genom att rikta utsprång 9,12,45,46 och i sin tur organisationen av spänningsfilament. Endotelceller i de ojusterade och inriktade COL1-segmenten avbildades för att undersöka det cellulära svaret på COL1-matriserna som utvecklats med hjälp av detta protokoll. Cellerna fixerades och färgades 4 timmar efter sådd. Representativa bilder av HUVECs odlade på det inriktade segmentet av matrisen visade ökad aktinfiberinriktning jämfört med HUVECs på segmentet med slumpmässiga fibrer (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av sammansättningen av lagren. Denna siffra anpassades med tillstånd från Ahmed et al.38. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Stegad kanal och förlängningstöjningshastigheter . (A) Schematisk bild av den stegade kanalen med mått. Outset visar beräkningen av förlängningstöjningshastigheten. Förlängningstöjningshastigheten i varje förträngning beräknas utifrån den hastighet som mäts med hjälp av partikelbildsvelocimetri (PIV). (B) Förlängningsstamhastigheterna i varje förträngning. Denna siffra anpassades med tillstånd från Ahmed et al.38. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Konfokala reflektansbilder av COL1-fibrer i varje mikrokanalsegment efter COL1-polymerisation. Ökningen av graden av fiberinriktning från segment (a) till segment (e) kan observeras visuellt. Skalstång = 25 μm. Denna siffra anpassades med tillstånd från Ahmed et al.38. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Konfokala reflektansbilder av COL1-fibrer som visar att fiberinriktningen förblir opåverkad genom att kanallocket tas bort. Skalstång = 25 μm. Denna siffra anpassades med tillstånd från Ahmed et al.38. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Representativa bilder av celler och COL1-fibrer. Representativa bilder av celler och COL1-fibrer i segment (e) av COL1-matrisen och segment (a) av COL1-matrisen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: Figur som visar laserskurna komponenter med mått. (A) Kanal, (B) magnetisk bas och (C) kanaltäckform. Alla dimensioner i millimeter. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokoll för att generera COL1-matriser med inriktade fibrer har beskrivits med hjälp av magnetiska metoder, direkt tillämpning av mekanisk töjning och mikrofluidiska tekniker47. Mikrofluidiska metoder används ofta för att skapa mikrofysiologiska system på grund av deras väldefinierade flödes- och transportegenskaper, vilket möjliggör exakt kontroll över den biokemiska mikromiljön. Eftersom anpassade COL1-fibrer ger viktiga lärorika signaler under patofysiologiska processer som sårläkning, tumörcellinvasion och vävnadsutveckling, är generering av anpassade COL1-matriser i mikrofluidiska system ett steg mot att utveckla biologiskt relevanta mikrofysiologiska system.

Detta protokoll ger möjlighet att tillverka millimeterskaliga, inriktade COL1-matriser med regioner med definierad fiberinriktning. För att inducera inriktning används en mikrofluidisk kanal med stegvisa breddminskningar. När en självmonterande COL1-lösning strömmar genom kanalen med en konstant flödeshastighet ökar lösningens flödeshastighet vid förträngningarna, vilket resulterar i lokal förlängningstöjning och långdistansinriktning av de självmonterande COL1-fibrerna. Jämfört med skjuvflödesinducerad fiberinriktning observerade vi fiberinriktning i kanaler upp till 250 μm i tjocklek, vilket gör att vi kan skapa 3D-hydrogeler i en mikrofluidisk kanal. Eftersom COL1-fiberjustering är beroende av förlängningstöjningshastigheten kan användare ändra den tillhandahållna kanalen eller utveckla anpassade kanaldesigner för att generera förlängningsflöde och skapa COL1-matriser av önskad storlek och form. Ytterligare flexibilitet tillhandahålls genom mjuk litografifri tillverkning av kanalerna, vilket möjliggör snabb prototypning av kanaldesign.

Den tvådelade kanalmetoden som presenteras i detta protokoll övervinner begränsningarna för åtkomst till en 3D-hydrogel i mikrokanaler. En tvådelad kanal ger direkt tillgång till COL1-hydrogelen, där kanalkåpan kan lyftas av för att avslöja COL1-matrisen i kanalen. Direkt åtkomst till COL1 efter polymerisation eliminerar behovet av att celler blandas i COL1-prekursorlösningen, vilket gör det möjligt för en användare att manipulera COL1-prekursorlösningen under längre perioder vid icke-fysiologiskt pH och låga temperaturer. Vidare kan ett modulärt tillvägagångssätt användas för att positionera cellerna och tillhandahålla lager-för-lager-biofabrikationskapacitet, vilket visats i vårt tidigare arbete. Moduler kan användas för att införa membran för samkultur, introducera kontinuerlig perfusion och även skapa flerskiktade ECM-konstruktioner 22,38,39. Anpassade moduler kan också tillverkas beroende på experimentella behov. Tillsammans med magnetisk låsning är det modulära tillvägagångssättet också väl lämpat för experiment som kräver att funktionalitet läggs till med tiden.

Det finns några kritiska steg som måste beaktas i detta protokoll. Alla komponenter, inklusive kanalutskärning, lock, täckglas och modulär bas, bör rengöras på lämpligt sätt för att säkerställa korrekt bindning och kemisk funktionalisering. Kollagenet bör beredas på is, och alla komponenter måste hållas kalla för att säkerställa konsistens. Efter beredning ska kollagenlösningen användas inom 10 minuter efter beredningen. Kollagenlösningens slutliga pH måste mätas med en pH-sond för att säkerställa konsistens. En ren, fuktig torka måste placeras i petriskålen med kollagenet för att säkerställa att kollagenet inte torkar ut i den varma inkubatorn.

Några ändringar och felsökning av protokollet inkluderar följande. (i) Om media läcker under cellodlingen bör man se till att PMMA-ramen och täckglasen fästs utan några luckor i limskiktet. (ii) Om magneterna inte är insatta i bottenskiktet förhindrar de att täckglaset fastnar på basen, vilket resulterar i luckor. (iii) Glutaraldehydbeläggningen på täckglaset kan också ha en lägre koncentration om det behövs (ner till 0,1%). Den optimala koncentrationen av glutaraldehyd för att förhindra toxicitet bör bestämmas experimentellt för varje cellinje som ska användas i experimentet eftersom glutaraldehyd kan uppvisa toxicitet för celler. (iv) Man kan inkludera ytterligare material såsom hyaluronsyra, fibronektin eller fluorescerande pärlor tillsammans med kollagen för att anpassa matrisen ytterligare. (v) Vid behov kan kanaldesignen ändras för att ha längre eller kortare segment för att undvika gräns- och kanteffekter48.

Detta protokoll har följande begränsningar. Atelo bovint kollagen är ett mjukt material (G '<100 Pa) vid 2,5 mg · ml − 1. För att öka gelstyvheten kan forskare använda högre koncentrationer av kollagen eller införa tvärbindningsmedel. Även om detta protokoll endast har validerats för att justera kollagenmatriser upp till 250 μm i tjocklek, kan tjockare matriser utvecklas genom att öka kanaltjockleken och optimera flödeshastigheterna för att införa adekvata förlängningstöjningshastigheter.

Det förväntas att detta protokoll kommer att vara till nytta för forskare som vill utveckla vävnadsspecifika ordnade mikromiljöer. Det kan också användas som en guide för att skapa modulära fluidiska plattformar för att etablera mikrofysiologiska system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författare deklarerar inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis av National Institute of Health under tilldelningsnummer R21GM143658 och av National Science Foundation under bidragsnummer 2150798. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis finansiärernas officiella åsikter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) Sigma Aldrich 440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip Jensen Global JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet KJ Magnetics D31
3M (TC) 12X12-6-467MP DigiKey 3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% Signa Aldrich 179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER Electro-Technic Products 12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar VWR AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet McMaster-Carr 8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested VWR 45000-666
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CT-FIRE software LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL Lonza CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL VWR VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50 Graphtec CE LITE-50
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer McMaster-Carr 87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells Thermo Fisher Scientific C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
Isopropanol Fisher Scientific A4154
Laser cutter Full Spectrum 20x12 H-series
Microfluidics Syringe pump New Era Syringe Pumps NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E Gilson FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen Advanced BioMatrix 5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4 VWR 70011044.00
PBS pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 Alfa Aesar J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 USCUTTER GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip Restek 22766.00
Silicon wafer University wafer 452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g VWR BDH9292-500G
Sylgard 184 VWR 102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 Thermo Fisher Scientific 28352.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  3. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  4. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  5. Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058 (2011).
  6. Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
  7. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  8. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11 (2008).
  9. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  10. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  11. Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
  12. Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107 (2018).
  13. Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
  14. Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
  15. Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780 (2019).
  16. Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323 (2018).
  17. Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
  18. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  19. Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506 (2018).
  20. Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016 (2017).
  21. Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
  22. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341 (2016).
  23. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
  24. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769 (2022).
  25. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  26. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
  28. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
  29. Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848 (2021).
  30. Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911 (2018).
  31. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
  32. Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
  33. Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276 (2021).
  34. Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
  35. Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
  36. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  37. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
  38. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
  39. Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
  40. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  41. Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931 (2020).
  42. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  43. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  44. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
  45. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  46. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
  47. Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).

Tags

Indragning utgåva 187
Microengineering 3D Collagen Hydrogels med långväga fiberinriktning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M.… More

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M. R., Vidas, J. A., Byerley, A. M., Mansouri, M., Day, S. W., Abhyankar, V. V. Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment. J. Vis. Exp. (187), e64457, doi:10.3791/64457 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter