Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Anvendelse af flowvermimetri til kvantificering og analyse af Caenorhabditis elegans tarmmikrobiomet

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/64605
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1,2
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Caenorhabditis elegans er en kraftfuld model til at undersøge de molekylære determinanter, der driver værtsmikrobiominteraktioner. Vi præsenterer en pipeline med høj kapacitet, der profilerer de enkelte dyrs niveauer af tarmmikrobiomkolonisering sammen med nøgleaspekter af C. elegans fysiologi.

Abstract

Sammensætningen af tarmmikrobiomet kan have en dramatisk indvirkning på værtsfysiologien gennem dyrets udvikling og liv. Måling af sammensætningsændringer i mikrobiomet er afgørende for at identificere de funktionelle forhold mellem disse fysiologiske ændringer. Caenorhabditis elegans er opstået som et kraftfuldt værtssystem til at undersøge de molekylære drivkræfter for værtsmikrobiominteraktioner. Med sin gennemsigtige kropsplan og fluorescerende mærkede naturlige mikrober kan de relative niveauer af mikrober i tarmmikrobiomet hos et individuelt C. elegans-dyr let kvantificeres ved hjælp af en stor partikelsorterer. Her beskriver vi procedurerne for eksperimentel opsætning af et mikrobiom, indsamling og analyse af C. elegans populationer i det ønskede livsstadium, drift og vedligeholdelse af sortereren og statistiske analyser af de resulterende datasæt. Vi diskuterer også overvejelser om optimering af sorteringsindstillinger baseret på mikrober af interesse, udvikling af effektive gatingstrategier for C. elegans livsstadier, og hvordan man udnytter sorteringskapacitet til at berige dyrepopulationer baseret på tarmmikrobiomsammensætning. Eksempler på potentielle applikationer vil blive præsenteret som en del af protokollen, herunder potentialet for skalerbarhed til applikationer med højt gennemløb.

Introduction

Dyrenes evolution er under konstant mikrobiel indflydelse1. Fra forskellige mikrober i miljøet erhverver dyreværter specifikke partnere2 , der udvider værtsens evner og driver dets fysiologi og modtagelighed for sygdom3. For eksempel afdækkede metagenomiske analyser af tarmmikrobiomet berigede metaboliske klasser af mikrobielle gener, der kan give større energihøst og lagring i overvægtige mus4, hvoraf mange også findes i det menneskelige tarmmikrobiom5. Der er stadig et stort behov for at etablere årsagssammenhænge og lokalisere de molekylære determinanter for mikrobiompåvirkningen, selvom fremskridt er blevet hæmmet af værtssystemernes mikrobiomkompleksitet og trækbarhed til storskala screening.

Modelorganismen C. elegans giver en platform til at fremme molekylær forståelse af forbindelser mellem mikrobiom og værtsfysiologi. C. elegans besidder 20 tarmceller med et slimhindelaget og villistrukturer. Disse celler er udstyret med rigelige kemoreceptorgener, der fornemmer mikrobielle produkter og producerer antimikrobielle molekyler, der potentielt regulerer deres tarmkolonisatorer 6,7. Denne bevarede biologi af C. elegans har ført til et enormt antal opdagelser i værtssignalering, der regulerer tarmmikrober, herunder insulinsignalering, TGF-beta og MAP Kinase 8,9,10.

C. elegans bruger mikrober som både deres kost til vækst under udvikling og mikrobiom som voksne. Med alderdom kan nogle mikrober overakkumulere i tarmens lumen, og værtsmikrobeforholdet skifter fra symbiose til patogenese11. I deres naturlige levesteder møder C. elegans en bred vifte af bakteriearter12,13. Sekventering af 16S rDNA fra repræsentative prøver indsamlet i naturlige levesteder (rådne frugter, plantestamme og dyrevektorer) afslørede, at det naturlige mikrobiom af C. elegans domineres af fire bakterielle phyla: Proteobakterier, Bacteroidetes, Firmicutes og Actinobacteria. Inden for disse opdelinger ligger stor variation i mangfoldigheden og rigdommen af bakterier baseret på habitatet12,13,14,15. Flere definerede samfund er blevet etableret, herunder samlingerne med 63 medlemmer (BIGbiome)16 og 12 medlemmer (CeMbio), der repræsenterer de øverste mikrobiomslægter, der er skabt til C. elegans-forskningssamfundet 17. Både mikrobiomer og komponentstammer kan have en forskellig indvirkning på fysiologien hos C. elegans, såsom kropsstørrelse, vækstrater og stressresponser 9,16,17. Disse undersøgelser giver ressourcer og eksempler til at etablere C. elegans som en model for mikrobiomforskning.

Her præsenteres en stor partikelsorteringsbaseret arbejdsgang (LPS) (figur 1), der udnytter C. elegans-systemet til samtidig at måle mikrobiomsammensætning og grundlæggende mål for værtsfysiologi på populationsskala. Fra den mikrobielle side kan arbejdsgangen tilpasses til at samle et defineret mikrobiom eller enkelte mikrober for at teste samfundets robusthed og plasticitet med stigende mikrobielle interaktioner. Fra værtssiden muliggør arbejdsgangen analyser med høj gennemstrømning for at måle koloniseringsniveauer af fluorescerende mikrober i mikrobiomet og være vært for fysiologisk aflæsning med hensyn til udvikling, kropsstørrelse og reproduktion. Samlet set muliggør C. elegans-mikrobiommodellen skærme med høj gennemstrømning for at lokalisere de metaboliske og genetiske determinanter, der modulerer værtsfysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af mikrobiomblanding

  1. Stempel eller stribe bakterier ud fra en glycerol frysebestand på en lysogeny bouillon (LB) plade, eller passende vækstmedium, og vokse natten over ved en optimal temperatur baseret på bakteriestammer af interesse (typisk 25 ° C for C. elegans naturlige mikrober).
  2. Fra LB-pladen skal du bruge en enkelt koloni fra hvert bakterieisolat (f.eks. 12 bakterier i CeMbio-samlingen) til at inokulere 800 μL LB-medium i separate brønde med en 1 ml dyb brøndplade. Inkuber natten over ved den optimale temperatur med omrystning ved 250 o / min.
    BEMÆRK: Denne protokol er optimeret til brug med definerede naturlige mikrobiomer (f.eks. CeMbio), men kan let justeres til individuelle mikrober ved vækst under passende forhold eller andre dyrkningsbeholdere (rør).
  3. Vurder væksten af hver mikrobe ved spektrofotometri. Der overføres en 20 μL delprøve til 80 μL LB, og opløsningen tilsættes til en klar, fladbundet plade med 96 brønde. Mål OD600 på en pladelæser.
  4. Efter tilvækst natten over centrifugeres dybbrøndskulturpladen ved 4.000 x g i 10 minutter for at pelletere bakterier, og supernatanten fjernes ved aspiration ved hjælp af en 96-brønds aspirationsmanifold eller multikanalpipette.
  5. Ved hjælp af OD 600-værdier normaliseres koncentrationen af hver mikrobe til en endelig OD600 på 1,0 ved hjælp af sterilt M9-medium.
  6. Hvis du kombinerer mikrober, skal du bestemme mængden af bakteriekultur, der er nødvendig til eksperimentet, og oprette en mikrobiommasterblanding ved at kombinere lige store mængder af hver bakteriestamme i et rør af tilstrækkelig størrelse (f.eks. 5 ml eller 15 ml rør).
  7. Spot 30-50 μL af mikroberne med en endelig OD600 på 1,0 på midten af hver nematodevækstmedium (NGM) agarholdig plade eller brønd18. Lad det frøede mikrobiom vokse natten over ved en optimal temperatur (25 °C her).
    BEMÆRK: Forbered NGM-agarplader på forhånd i henhold til instruktionerne i ormebogen eller ved hjælp af færdigblandet NGM-pulver18. For eksempel tilsættes 3 ml NGM til plader med 12 brønde, og 1,5 ml tilsættes til plader med 24 brønde.

2. Forberedelse af synkroniserede C. elegans til vækst på mikrobiomet

  1. Dyrk ca. 100 orme på NGM-plader (6 cm diameter) podet med Escherichia coli OP50, indtil ormene når gravid voksenalder. I forbindelse med denne protokol blev C. elegans N2-stammen anvendt, selvom protokollen let kan tilpasses andre nematodestammer.
  2. Tilføj 6 ml M9-buffer (plus 0,01% triton X-100; M9-TX) til pladen, pipetteres op og ned for at vaske ca. 100 gravide voksne orme af i et 15 ml konisk rør.
  3. Forbered frisklavet blegemiddelopløsning ved at blande to dele blegemiddel med en del af 5 M NaOH.
  4. Centrifuger ormene ved 3.000 x g i 30 s for at pelletere ormene. Aspirer for at bringe lydstyrken ned til 4 ml, og tilsæt derefter 2 ml blegemiddelopløsning.
  5. Luk låget tæt og ryst røret. Overvåg de voksne orme i opløsningen under et stereomikroskop ved 10x forstørrelse. Når voksne kroppe begynder at gå i stykker, typisk efter 3,5 min, skal du stoppe med at ryste og centrifugere ved 3.000 x g i 30 sekunder.
  6. Aspirer til et minimalt volumen med en pipette. Resuspender, centrifuger og aspirer fire gange i M9-TX for at vaske blegemidlet ud.
  7. Resuspender i 4-6 ml M9-TX og placer røret på en rotator natten over, så æg kan klække og synkronisere på L1-stadiet.
  8. Næste dag skal du tage 10 μL L1-orme i M9-TX fra røret og slippe dem på en ren petriskål. Tæl antallet af levende L1-orme under et stereomikroskop ved 20x total forstørrelse.
  9. Baseret på L1-densiteten pipetteres det passende volumen til at droppe ~50 synkroniserede L1-larver på kanten af de mikrobiomfrøede NGM-plader og inkubere ved 20 °C. Lad orme vokse indtil den ønskede alder (dag 2 eller dag 3 i voksenalderen).

3. Indsamling af ormepopulation til tarmmikrobiomanalyser

  1. Vask ormene af bakterieplænen med 1-2 ml M9-TX til en steriliseret 2 ml 96-brønds dyb plade.
    BEMÆRK: For mikrobielle stammer, der skaber betydelige biofilm, rystes pladen med væske i 5 minutter for at nedbryde mikrobielt affald.
  2. Centrifuger dybbrøndpladen ved 300 x g i 1 min for at pelletere ormene, og fjern derefter væsken ved hjælp af en aspireringsmanifold.
    BEMÆRK: Brugere kan bruge en multikanalpipette til manuelt at fjerne væsken, hvis en aspireringsmanifold ikke er tilgængelig. Sørg for, at pipettespidserne ikke rører bunden af hullerne for at undgå tab af ormeprøver.
  3. Der tilsættes 1,8 ml M9-TX til hvert hul i dybbrøndpladen ved hjælp af en 1,2 ml multikanalpipette. Bland ved pipettering op og ned et par gange, og centrifuger ved 300 x g i 1 min. Gentag dette trin fire gange for at fjerne bakterier i væsken.
  4. Efter den sidste vask bringes volumenet i hvert hul op på 100 μL ved hjælp af sugemanifolden.
    BEMÆRK: For at adskille voksne fra larverne ved hjælp af tyngdekraften, lad pladen stå på bænken i 30-60 s, så voksne orme kan synke til bunden af brønden. Derefter aspireres pladen for at fjerne larver fra suspensionen.
  5. Tilsæt 100 μL 10 mM levamisol i M9-TX til hver brønd og lad ormene lamme i 5 min. Efter levamisolbehandlingen tilsættes 4% af blegemiddelopløsningen beskrevet i trin 2.3 til hvert hul i 2 minutter for at reducere bakterieklumper, hvis det er nødvendigt. Der vaskes med M9-TX to gange efter blegemiddelbehandlingen og suges til et slutvolumen på 100 μL efter anden vask.
  6. Overfør orme til en fladbundet 96-brønds plade indeholdende 150 μL 10 mM levamisol i M9-TX. Hold ormens tæthed på 50-100 pr. brønd og del ormene i flere brønde, hvis populationen er for overfyldt.

4. Opsætning af den store partikelsortering og autosampler

  1. Tænd for luftkompressoren, computeren og LPS-instrumentet. Kontroller og tøm affaldstanken. Tilsæt derefter 500 ml blegemiddel til den tomme affaldstank. Kontroller og genopfyld kappe og vandtanke, hvis lydstyrken er lav. Sørg for, at den 250 μm fluidiske og optiske kerneenhed (FOCA) er på plads.
  2. Kør kontrolpartiklerne til kvalitetskontrol. Åbn LPS-instrumentsoftwaren. I softwarevinduet skal du markere Aktivér lasere for at tænde 488 nm og 561 nm lasere .
    BEMÆRK: Det er muligt at springe trin 4.2-4.5 over, hvis kontrolpartiklerne er blevet kørt inden for de foregående 2 uger, og FOCA ikke er blevet ændret i det tidsrum.
  3. Vælg Konfigurer > kontrolpartikler. Vælg Nej i prompten for at gå til standardindstillingerne. Kontrolpartiklerne (10 mldH-2O- og 10 ml-kontrolpartikler i et 50 ml konisk rør) hvirvler før hver brug og lægges i prøveporten.
  4. Når du er klar, skal du klikke på Anskaf for at optage 500 begivenheder. Sørg for, at hændelsesfrekvensen er mellem 15-30 hændelser/s.
    BEMÆRK: Hvis hændelsesfrekvensen ikke er 15-30 hændelser/s, skal en tekniker kontaktes for at justere maskinens indstillinger.
  5. Undersøg variationskoefficienten (CV) for alle parametre. Hvis CV < 15%, er kvalitetskontrollen bestået, og LPS-softwaren kan lukkes. Hvis CV > 15%, skal du køre igen og justere mikrometer med frisklavede kontrolpartikler for at justere laseren med flowcellen.
  6. Tilslut og tænd autosampleren. Åbn instrumentsoftwaren til autosampleren. Dette åbner autosampleren og LPS-softwaren. I LPS-softwarevinduet skal du gå til Filer > nyt eksperiment og derefter Fil > nyt eksempel. Marker Aktivér lasere for at tænde 488 nm og 561 nm lasere , hvis det ikke allerede er gjort.
  7. Opret skabeloner til anskaffelsespunktplots ved hjælp af flyvetid (TOF), udryddelse (EXT) og fluorescerende kanaler i LPS-softwarevinduet. Et godt startmaksimum for at fange alle ormene er 8.000 for TOF og EXT. Fluorescensskalaer varierer afhængigt af hver mikrobe. Inkluder kontrolormprøver dyrket på ikke-fluorescerende mikrobe (f.eks. OP50) og hver fluorescerende mikrobe alene (hvis blanding af mikrober) som kontroller med hvert eksperiment.
    1. Højreklik i brødteksten i en graf for at ændre skaleringen. Brug kontroldyr såsom dag 1 voksne eller synkroniserede L1'er (eller population af interesse) til at hjælpe med TOF og EXT gating udvælgelse.
  8. I vinduet autosampler skal du vælge Prime. Gå til File > Open Script for at vælge det korrekte indbyggede script, og klik derefter på OK.
    1. Kun til analyse skal du vælge scriptet med Erhverv. For sortering skal du vælge scriptet med Dispenser. For erhvervelse fra 96-brøndplader skal du vælge scriptet med 96-brønden; For erhvervelse fra 384-brøndplader skal du vælge scriptet med 384-brønden. For prøvevolumen (40 eller 100 μL) skal du vælge scriptet med det tilsvarende volumen.
  9. Gå til Pladeskabelon i autosampler-softwaremenuen for at vælge de ønskede brønde til analyse. Fyld kontrolprøverne. Når pladen er lagt på autosamplerfasen og fastgjort, skal du trykke på Kør plade i autosamplervinduet. Gem filen, når du bliver bedt om det.
    BEMÆRK: Kontrolprøver og indstillinger kan udføres med et 50 ml konisk rør på LPS-prøveporten, før LP-prøveudtageren monteres.
  10. Når erhvervelsen er afsluttet, skal du klikke på knappen Gem data på det øverste bånd i LPS-softwarevinduet og gemme dataene igen.

5. Analyse af C. elegans egenskaber og tarmmikrobiom niveauer pr. dyr

  1. Rådata gemmes i tre filtyper: .lmd, .bxr3, .txt. Indlæs tekstfilen mærket .txt fil i R-programmet til analyse. Udfør nedenstående trin i R19.
  2. Brug pakken tidyverse20 som ramme for analysen.
  3. Brug ggplot-funktionen (inkluderet i tidyverse) til at plotte LPS-dataene ved hjælp af TOF-værdierne som x-aksen og EXT-værdierne som y-aksen. Et normalt plot viser to skyer af prikker. Sørg for, at man er tæt på oprindelsen og x-aksen, hvilket indikerer mindre partikler såsom larver og små affald, og den anden gruppe partikler er øverst til højre i plottet og repræsenterer voksne nematoder.
  4. Brug denne gruppering som vejledning til at vælge passende TOF- og EXT-afskæringsværdier. Gating kan variere af C. elegans stammer på forskellige mikrober baseret på ændringer i fysiologi (fx mørke vs. klare dyr eller ændringer i ægvogn kan ændre EXT koefficienter).
  5. Brug funktionsdelmængden til at adskille voksne og larver ved TOF og EXT gating. I eksemplet her skal du bruge TOF > 1.200 og EXT > 1.000 indstillinger til gate for voksne dyr.
  6. Analysere de resulterende datasæt for statistiske forskelle; Brug t-test-funktionen i R til dette eksperiment.
    1. For at bestemme virkningen af mikrobiom på størrelsen og den optiske tæthed af C. elegans skal du sammenligne henholdsvis TOF- og EXT-værdierne mellem forholdene. TOF er en proxy for ormstørrelse og kan indikere ændringer i dyrenes vækstrater på bestemte tidspunkter. EXT-ændringer er størst mellem slutningen af udviklingen og voksenalderen på grund af lyset spredt af æg og kan bruges til at vurdere ændringer i tidspunktet for denne overgang og frugtbarhed. Vurder andelen og fordelingen af afkommet, hvis de blev bevaret under analyserne.
    2. For at bestemme ændringer i tarmmikrobiomets koloniseringsniveauer skal du først normalisere fluorescensværdier (f.eks. Røde eller grønne søjler) ved at dividere med individuelle TOF-værdier for hvert dyr. Efterhånden som orme vokser i størrelse og bliver voksne, bliver mængden af deres tarm også større. Normalisering hjælper med at reducere artefakter fra forskelle i prøvedyrstørrelsesfordelinger. Brug normaliserede dyr til at vurdere ændringer i tarmmikrobiomkolonisering på tværs af forhold.
      BEMÆRK: Et rådataeksempel og tilsvarende R-scripts findes i Supplementary File 1 JOVE_worm_microbiome.txt og Supplementary File 2 JOVE_worm_microbiome.r. Se figur 2 og figur 3 for et repræsentativt eksempel på disse analyser af værten og mikrobiomet ved hjælp af to fluorescerende bakterier.

6. Sortering af C. elegans dyr efter tarmmikrobiomfunktioner

  1. Indsamle en C. elegans-population dyrket på fluorescerende mærkede mikrober (f.eks. RFP) som beskrevet i trin 3. Orme skal placeres i 50 ml koniske rør med mindst 5 ml prøve. Sigt efter ca. 2.000 orme/ml inklusive alle voksne og afkom.
    BEMÆRK: Dette kan også gøres i en fladbundet plade med 96 brønde ved hjælp af LP-sampleren. Hold ormens tæthed på 50-100 pr. Brønd.
    1. Hvis LP-sampleren er blevet brugt, skal du slukke og frakoble LP-sampleren. Tilslut prøven igen, og ryd linjer til LPS før sortering.
  2. Åbn LPS-softwaren, gå til File > New Experiment og derefter File > New Sample. Opret et prikdiagram med TOF på x-aksen og Extinction på y-aksen. Opret endnu et prikdiagram med TOF på x-aksen og rød på y-aksen. Brug samme akseskala og laserindstillinger som tidligere anvendt. Marker Aktivér lasere for at tænde 488 nm og 561 nm lasere
    BEMÆRK: Hvis disse afbildninger er oprettet tidligere, skal du gå til Filer > Åbn eksperiment og Fil > Åbn eksempel for at indlæse grafer.
    1. Kontrolprøveglasset anbringes på prøveåbningen. Klik på Hent i dialogboksen Køb/dispenser. Gem filen, når du bliver bedt om det. Når der er målt nok orme til at skelne populationer, skal du klikke på Afbryd.
      BEMÆRK: Flowhastigheder skal være ca. 15-30 hændelser/s. Hvis ikke, skal du justere ormkoncentrationerne for at sikre, at de enkelte dyr analyseres eller sorteres pr. Dråbe. I LPS passerer orme gennem laserens vej i forskellige positioner (lige versus krøllet eller bøjet). De kan tage en anden tid at passere laseren og detektoren afhængigt af deres positioner.
    2. I TOF vs Extinction dot plot tegne en port omkring den voksne befolkning. I TOF vs Red dot plottet tegne porte omkring områderne med høje og lave røde værdier som regioner af interesse for voksne orme med forskellige niveauer af mikrobiom kolonisering. Gå til Vis > Gating Hierarchy , og sørg for, at fluorescerende porte er angivet under porten til voksne indbyggere. Når indstillingerne er optimeret, skal du gå til Filer > Gem eksperiment og Fil > Gem eksempel.
      BEMÆRK: I eksemplet her skal du vælge dyr baseret på TOF/EXT-porte til voksne og sortere i puljer, der udviser enten høj eller lav kolonisering med røde fluorescerende proteinekspressive bakterier. Enhver kombination af parametre målt af LPS kan dog bruges til at identificere den eller de relevante populationer.
  3. Før sortering skal du sikre dig, at det korrekte opsamlingsapparat er indlæst. Hvis du vil lægge 96-brøndspladen på opsamlingsapparatet, skal du vælge Ilægningsplade A > Flyt under afsnittet Flyt fase i dialogboksen Anskaffe/dispensere for at tillade, at indsamlingsfasen flyttes til en position, der er klar til ilægning af en 96-brøndsplade.
  4. Ved massesortering skal du vælge den relevante rørstørrelse og klikke på Flyt for at indlæse enten et konisk rør på 15 ml eller 50 ml. I afsnittet Sortering i dialogboksen Hent/dispenser skal du vælge sorteringsporten på rullelisten over de oprettede områder. Indtast antallet af genstande fra det definerede område, der skal dispenseres til et opsamlingsrør direkte under flowcelledysen. Klik på knappen Massesortering under dialogboksen Køb/dispenser.
  5. For dispensering til en 96-brønds plade skal du gå til Opsætning > plader > kalibrerede plader > 96-brøndsplade. Gå derefter til Vis > pladeskabelon, vælg de brønde, som ormene skal sorteres til, indtast antallet af objekter, der skal sorteres i hver brønd, og vælg de lukkede områder af interesse. Hvis mere end et lukket område sorteres i samme plade, skal du markere afkrydsningsfeltet Port hver brønd. Klik på OK for at gemme ændringer.
  6. Når sorteringsnumre og placeringer er blevet tildelt, skal du klikke på knapperne Fyldplade i dialogboksen Køb/dispenser for at starte dispensering til en plade med 96 brønde.
    1. Før du fylder hele 96-brøndspladen, skal du udføre testsortering af en delmængde af dyr eller kontroller i en 96-brøndplade og analysere ved hjælp af et stereomikroskop for at sikre, at passende antal og ønskede dyrepopulationer er sorteret. Når nøjagtig sortering er bekræftet, gentages trin 6.3-6.6 for forsøgsprøver. Klik på knappen Gem data på det øverste bånd i LPS-softwarevinduet for at gemme data igen.
      BEMÆRK: Alle målinger (EXT, TOF, RFP, GFP osv.) kan også indsamles for sorterede dyr og sammenlignes med dem, der ikke blev sorteret. Dette kan gøre det muligt at køre analyse- og sorteringstilstande på samme tid, hvis det ønskes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Definition af voksne og larver population porte
Her blev synkroniserede C. elegans L1'er dyrket på en NGM-plade podet med E. coli OP50 (Eco), en standard laboratoriediæt. C. elegans-populationer blev indsamlet til LPS-analyse efter 96 timer eller 120 timers vækst ved 20 °C (figur 2A). Et prikplot af udryddelse (EXT, en proxy for kropstæthed) versus flyvetid (TOF, en proxy for kropslængde) skaber to visuelt adskilte skyer af dyr. Hver prik repræsenterer et enkelt dyr, hvor højere EXT- og TOF-værdier observeres hos voksne sammenlignet med larver (figur 2B). Disse to parametre er værdifulde slutninger for befolkningstilvækst og fysiologi. For eksempel kan et tæthedsplot af larver TOF visualisere fordelingen af larvestadier. Afkom fra 2 dage gamle voksne var domineret af L1 og L2 stadier med en TOF under 200, mens de fleste afkom fra 3 dage gamle voksne nåede L3 og L4 stadier (figur 2C). Derudover er 2D-tæthed og box-whisker-plots nyttige til at visualisere ændringer i voksen kropsstørrelse og densitet, da værdierne for TOF og EXT stiger på dag 3 sammenlignet med dag 2, når de dyrkes på E. coli (figur 2D-F). Dette forhold er typisk lineært i voksenalderen, men nogle ændringer i fysiologi kan påvirke en funktion mere end en anden (f.eks. Voksne uden æg kan have lavere EXT-værdier uden at påvirke TOF).

Profilering af tarmmikrobiomsammensætning ved hjælp af fluorescerende mærkede mikrober
For at illustrere forskellige niveauer af kolonisering sammenligner vi en dominerende kolonisator af det naturlige C. elegans mikrobiom dTomato-tagget Ochrobactrum BH3 (Och) og grønt fluorescerende protein (GFP)-mærket E. coli OP50. Disse to blev podet individuelt og i en lige blanding baseret på OD (1: 1 mix) på NGM-pladen. Synkroniserede C. elegans L1'er blev dyrket på de tre betingelser og indsamlet ved 120 timer for at undersøge koloniseringsdynamikken hos 3 dage gamle voksne (figur 3A). 2D-tæthed og box-whisker-plots viste, at der er forskelle i voksne TOF- og EXT-værdier, når C. elegans dyrkes på Ochrobactrum BH3 og blandingskulturer (figur 3B-E). Gut kolonisering af bakterier kan udledes af fluorescensniveauet detekteret i de enkelte nematoder. Box-whisker plots af røde fluorescerende aflæsninger viser øget Ochrobactrum BH3 kolonisering i blandingstilstanden end i Ochrobactrum BH3 alene. I modsætning hertil indikerer grønfluorescerende værdier lavere OP50-kolonisering i blandingstilstanden end i OP50 alene. Lignende tendenser observeres i TOF-normaliserede fluorescerende signaler, hvilket fjerner effekten af kropsstørrelse og reducerer variation i befolkningen (figur 3F-I). For et defineret mikrobiom med flere fluorescerende mærkede mikrober kan et prikplot illustrere koloniseringsmønstre for disse mikrober. For eksempel viser et prikplot af rødt fluorescerende protein (RFP) versus GFP-kanaler i to-leddets blandingsmikrobiom, at orme er stærkt skæve mod y-aksen (RFP), hvilket tyder på, at OP50-kolonisering er lav i de fleste orme, mens niveauerne af Ochrobactrum BH3-kolonisering er jævnt fordelt i befolkningen (figur 3J). På samme måde kan et prikplot af RFP versus EXT afsløre forholdet mellem Ochrobactrum BH3-koloniseringsniveauer og værtsudvikling såsom kropstæthed (figur 3K). Desuden kan forskellene i reproduktionsmønstre observeres ved at plotte tæthedsplottet for den respektive larverpopulation på de tre betingelser (figur 3L).

Berigelse for målrettede populationer baseret på mikrobiomkolonisering
De 3 dage gamle voksne, der dyrkes på to-leddet blandingsmikrobiom, udviser en bred vifte af RFP-intensitet, hvilket indikerer individuelle variationer i Ochrobactrum BH3-kolonisering inden for gruppen (figur 4A). For yderligere at adskille disse undergrupper blev sorteringsportene for høj og lav RFP manuelt tegnet for at sortere 15 individer fra hver port til en 96-brønds plade, som vist på RFP-billedet af hele brønden (figur 4B). Under højere forstørrelse bekræfter overlejringsbilleder af lyse felter og RFP-kanaler, at sorteringsmetoden vælger høje og lave Ochrobactrum BH3-koloniserede orme, hvilket muliggør yderligere karakterisering af fænotypiske konsekvenser og molekylære drivere (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Et flowdiagram for flowvermimetribaserede metoder til vurdering af tarmmikrobiom og værtsfysiologi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Definition af populationer af voksne larver og larver. (A) En arbejdsgang til indsamling af C. elegans-populationer på dag 2 og dag 3 i voksenalderen. (B) Dot plot of time-of-flight (TOF) versus udryddelse (EXT) for C. elegans populationer på dag 2 (grå) og dag 3 (rød) i voksenalderen. (C) Tæthedsplot af larver TOF på dag 2 og dag 3 i voksenalderen. (D-E) Dot og box-and-whisker plots af TOF versus EXT for voksne på dag 2 og dag 3 i voksenalderen. (F) Box-and-whisker plot af voksen udryddelse på dag 2 og dag 3 i voksenalderen. P-værdier blev beregnet med elevens t-test (*** p < 0,001; Dag 2 n = 38; Dag 3 n = 88). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Profilering af tarmmikrobiomkolonisering ved hjælp af fluorescerende mærkede mikrober. (A) Indsamling af 3 dage gamle voksne populationer dyrket på Ochrobactrum BH3 (dtomat-udtrykkende; Och), E. coli OP50 (GFP-udtrykkende; Eco) eller en 1:1 blanding af de to bakterier (bland). (B) Prikplot af TOF versus EXT for dag 3 voksne dyrket på blandingen. (C-E) Dot og box-and-whisker plots af TOF versus EXT for 3-dages gamle voksne dyrket på Ochrobactrum BH3. Grå bindestregslinjer angiver middelværdien af den befolkning, der er vokset på OP50. (F-G) Box-and-whisker plot af rå og TOF-normaliserede dTomato (RFP) værdier for 3-dages gamle voksne dyrket på Mix og Ochrobactrum BH3 alene. (H-I) Box-and-whisker plots af rå og TOF-normaliseret GFP til 3-dages gamle voksne dyrket på mix og OP50. (J) Prikplot af Ochrobactrum BH3 (RFP) versus E. coli OP50 (GFP) for 3 dage gamle voksne dyrket på blanding. (K) Prikplot af RFP versus EXT for 3 dage gamle voksne dyrket på blanding. (L) Tæthedsplot af larver fra 3 dage gamle voksne dyrket på blanding, Ochrobactrum BH3 og OP50. Alle P-værdier blev genereret fra elevens t-test (*** p < 0,001; ** p < 0,01; n.s., ikke signifikant; mix n = 230; Och n = 45). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Berig målrettede populationer baseret på mikrobiomkolonisering . (A) Prikplot af TOF versus RFP (Ochrobactrum BH3) for 3 dage gamle voksne. Høj (rød boks) og lav (sort boks) RFP-porte trækkes for at berige C. elegans med høj og lav Ochrobactrum BH3-kolonisering. (B) Repræsentative RFP-billeder (4x) af brøndene indeholdende 15 sorterede orme fra høje og lave RFP-porte (Bar = 1 mm). (C) Repræsentative billeder (10x) af individuelle orme fra høje og lave RFP-porte (Bar = 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Repræsentativt datasæt genereret af stor partikelsortering for N2-populationer i dag 2 og dag 3 voksenalder dyrket på E. coli OP50 og Ochrobactrum BH3. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Scripts, der bruges til analyse og figurgenerering af repræsentative datasæt i R-miljøet. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flowvermimetri er blevet brugt til at karakterisere C. elegans gener og veje mod patogenkolonisering og toksicitet i flere undersøgelser21,22. Her præsenteres en høj gennemstrømningsmetode, der bruger C. elegans til at undersøge, hvordan tarmmikrobiomer modulerer deres værtsfysiologi. Sammenlignet med eksisterende metoder, der anvender kolonidannende enheder (CFU) eller 16S rRNA-ampliconsekventering 9,16,17,23,24, kræver denne tilgang ikke arbejdskrævende tælling eller introducerer potentiel PCR-bias. Ud over at måle mikrobiomer i en hel befolkning giver denne tilgang brugerne mulighed for at visualisere individuelle variationer inden for befolkningen. Denne tilgang er kun begrænset af tilgængeligheden af fluorescerende proteinekspression eller farvning af mikrober og antallet af detektionskanaler i LPS. Yderligere overvejelser i forbindelse med eksperimentelt design diskuteres nedenfor, så brugerne kan oprette en tilpasset arbejdsproces baseret på deres behov.

Overvejelser ved oprettelse og såning af et defineret mikrobiom
For det første normaliseres hver bakteriekultur til en OD600-værdi på 1, før forskellige stammer blandes. Det er værd at bemærke, at starttætheden afhængigt af samfundets kompleksitet og forholdet mellem arterne kan have forskellige virkninger på den etablerede mikrobiomsammensætning23. Mens OD let kan måles med spektrofotometre, er en advarsel, at forskellige bakterier vil have forskellige koncentrationer (fx antallet af celler pr. ml) for den samme OD-værdi og bør justeres i overensstemmelse hermed. For det andet skal der tages højde for variation i mikrobiomsammensætningen i græsplæner. Når mikrobiomet er podet på NGM-pladen (eller andre medier), får mikrobiomet lov til at vokse natten over ved stuetemperatur, før det falder synkroniserede L1 C. elegans-populationer på pladerne. På grund af variationer i væksthastigheder og interaktioner mellem arter blandt bakteriestammer vil mikrobiomer dyrket på NGM-plader eller enhver plade med substrater til vækst afvige i sammensætning fra den oprindelige frøblanding. Brug af en peptonefri NGM-plade kan bevare det oprindelige mikrobielle samfund13. På grund af begrænset mikrobiomvækst på den peptonefri plade kan der dog være behov for en højere såning OD eller et reduceret antal synkroniserede L1'er pr. Plade. Dette forhindrer befolkningen i at sulte, før den når den ønskede alder for analyse. En anden tilgang er at sekvensere eller på anden måde bestemme andelen af mikrober i plænen.

Måling af mikrobiom kolonisering og C. elegans fysiologi
For det første kan udryddelsestærsklerne (EXT) og time-of-flight (TOF) for voksne variere afhængigt af alder, C. elegans stamme baggrund og de mikrober, som de dyrkes på. At have en 1 dag gammel voksen population i eksperimentet for hver orm / bakteriel tilstand kan være nyttigt til at bestemme TOF og udryddelsesafbrydelser samt til at kontrollere variationen på grund af vækstmedier og miljø. Udover gating for voksne kan TOF og EXT anvendes til port for larver, og et tæthedsplot af afkom kan estimere tidspunktet og produktionen af reproduktion på populationsniveau (figur 3L). For det andet skal PMT-forstærkninger og spænding på LPS justeres for at maksimere signal-støj-forholdet og indstille signalområdet for at undgå mætning. Dette afhænger af den fluorescerende intensitet af bakteriestammerne og deres koloniseringsniveauer. Standard PMT ved 350 fungerer godt for høje kolonisatorer som Ochrobactrum BH3, men brugerne skal muligvis øge PMT- eller spændingsværdierne for lave kolonisatorer som E. coli OP50. For det tredje afspejler fluorescerende værdier på grund af forskelle i fluoroforernes egenskaber og deres ekspressionsniveauer i transgene bakteriestammer ikke det absolutte antal bakterier, der er til stede i mikrobiomet. Derfor kan GFP- og RFP-værdier ikke bruges til at sammenligne kolonisering mellem to forskellige fluorescerende mikrober direkte. Forstyrrelse og plettering af dyr for at identificere levende bakterietal kan bidrage til bedre at løse disse forhold24.

Potentielle anvendelser af berigelsesbaserede strategier
Denne metode giver en tilgængelig platform med høj kapacitet til at undersøge virkningen af mikrobiomændringer på værtsfysiologi på befolkningsniveau. På den mikrobielle side vil den stigende tilgængelighed af værktøjer og ressourcer til redigering af bakterielle genomer25,26,27 øge antallet af fluorescerende og funktionelle mikrobielle mutanter relateret til C. elegans naturlige mikrobiom. Fra værtssiden er adskillige fluorescerende journalister tilgængelige for at udforske forbindelsen mellem cellesignalering og mikrobiomsammensætning. Evnen til at berige en værtspopulation eller mutant fra en mutageniseret population (f.eks. EMS fremadrettet mutagenese)28 eller samlede vilde stammer29 med specifikke mikrobiomkoloniseringsfunktioner kan i høj grad fremme evnen til at forbinde værtsgener, der regulerer mikrobiompåvirkningen. Desuden kan udvælgelsen af populationer baseret på værts- og/eller mikrobiomegenskaber også lette en kadre af omics-baserede profileringsmetoder. Denne tilgang har stor fleksibilitet og lover at fremme forståelsen af de molekylære mediatorer af værtsmikrobiominteraktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud DP2DK116645 (til BSS), Dunn Foundation pilotpris og NASA-tilskud 80NSSC22K0250 (til BSS). Dette projekt blev også støttet af cytometri og cellesorteringskerne ved Baylor College of Medicine med finansiering fra CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 og RR024574) og bistand fra Joel M. Sederstrom plus et instrumenteringstilskud til LPS NIH-tilskuddet (S10 OD025251). Nogle stammer blev leveret af CGC, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical bottom centrifuge tubes VWR 10026-076
96 deep-well plates (1 mL) Axygen P-DW-11-C
96 deep-well plates (2 mL) Axygen P-DW-20-C
96-well Costar plate Corning 3694
Agar Millipore Sigma Standard bacteriology agar is also sufficient.
Aspirating manifold V&P scientific VP1171A
Bleach Clorox
Bleach solution  Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode Reader Biotek Cytation 5 Bacterial OD measurement
Centrifuge Thermo scientific  Sorvall Legend XTR For 96 well plate and conical tubes
Fluorescent Microscope Nikon TiE
ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. R package Version 3.3.2
Large Particle Autosampler Union Biometrica LP Sampler
Large Particle Sorter Union Biometrica COPAS Biosorter
Levamisole Fisher AC187870100
Lysogeny Broth (LB) RPI L24066 Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.
M9 solution  22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Growth Medium RPI N81800-1000.0 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.
RStudio GNU Version 1.3.1093
Sodium hypochlorite Sigma-Aldrich 5M NaOH
Stereo Microscope Nikon SMZ745
Sterile 10 cm diameter petri dishes Corning 351029
Sterile 12-well plates VWR 10062-894
Sterile 24-well plates VWR 10062-896
Sterile 6 cm diameter petri dishes Corning 351007
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
  3. Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
  5. Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).
  6. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
  7. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
  8. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  9. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  10. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
  11. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
  12. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  13. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  16. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  17. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
  19. R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
  20. Wickham, H., et al. tidyverse. , (2019).
  21. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  22. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).
  23. Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).
  24. Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
  25. Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877 (2018).
  26. Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
  29. Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).

Tags

Biologi udgave 193 Analyse Caenorhabditis elegans tarmmikrobiom sammensætning værtsfysiologi sammensætningsændringer funktionelle relationer molekylære drivere værtsmikrobiominteraktioner gennemsigtig kropsplan fluorescerende mærkede naturlige mikrober relative niveauer af mikrober stor partikelsortering eksperimentel opsætning indsamling analyse C. elegans populationer sorteringsdrift og vedligeholdelse statistiske analyser optimering af sorteringsindstillinger effektive gatingstrategier berigelse Antal dyrepopulationer skalerbarhed til applikationer med høj kapacitet
Anvendelse af flowvermimetri til kvantificering og analyse af <em>Caenorhabditis elegans</em> tarmmikrobiomet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, F., Blackburn, D., Hosea, C.… More

Zhang, F., Blackburn, D., Hosea, C. N., Assié, A., Samuel, B. S. Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome. J. Vis. Exp. (193), e64605, doi:10.3791/64605 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter