Summary
توضح هذه المقالة بروتوكولا لتبسيط العملية وجعل تحضير المصل المشروط الذاتي (ACS) أقل تكلفة. ليست هناك حاجة إلى محاقن خاصة أو خرز زجاجي مطلي بالسطح. علاوة على ذلك ، فإن ACS المعدل (mACS) له مزايا تنافسية على المصل الذاتي التقليدي في التئام جروح القرنية لعيون الفئران خارج الجسم الحي.
Abstract
كانت العلاجات الموضعية المشتقة من الدم البشري نعمة للأطباء في العقود الأخيرة. يتم إثراء المصل الذاتي (AS) والبلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) بعوامل النمو الظهارية الضرورية في التئام جروح القرنية. على عكس AS ، يعتمد PRP على نظام الطرد المركزي التفاضلي ، مما ينتج عنه المزيد من عوامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية. المصل المكيف الذاتي (ACS) لا يحافظ فقط على إعداد AS و PRP ، ولكنه يركز أيضا على خصائص تعديل المناعة ، والتي تعتبر مهمة في الأمراض الالتهابية.
يعد الافتقار إلى البروتوكولات الموحدة وتكاليف التحضير المرتفعة قيودا على التطبيق السريري ل ACS. توضح تجربة الفيديو هذه إجراء تشغيليا قياسيا لتحضير قطرات العين المعدلة ذات المصل الذاتي المكيف (mACS). أولا ، تمت إضافة الجلسرين إلى محاقن الهيبارين كمثبت لخلايا الدم أثناء حضانة نقص الأكسجين. لتنشيط خلايا الدم ، بدأت حضانة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم طرد عينات الدم بالطرد المركزي عند 3500 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ترشيح المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، تم تحضير قطرات العين mACS بالكامل.
أظهرت تجربة مبدئية للتأثير العلاجي ل mACS أنه قد يكون له مزايا تنافسية على AS التقليدي في التئام جروح القرنية في عيون الفئران خارج الجسم الحي. تم إعداد AS المستخدم في هذه الدراسة وفقا للدراسات المنشورة والممارسة السريرية في مستشفانا. لذلك ، يمكن تقييم فعالية mACS على أمراض سطح العين في الأبحاث المستقبلية من خلال الدراسات الحيوانية في الجسم الحي والتجارب السريرية.
Introduction
تم الإبلاغ عن الآثار العلاجية للمصل الذاتي (AS) في أمراض جفاف العين لأول مرة في ثمانينيات القرن العشرين من قبل Fox et al.1. ويعتقد أن كل من خاصية التشحيم والمكونات الكيميائية الحيوية الأساسية الظهارية في AS، التي تحاكي الدموع الطبيعية، تفيد تكاثر الخلايا الظهارية القرنية. على مدى العقود الماضية ، تم إجراء العديد من الدراسات على هذا الأساس. تشمل المكونات الغذائية عامل نمو البشرة (EGF) وفيتامين أ وعامل النمو المحول β (TGF- β) والسيتوكينات الأخرى. ومن المثير للاهتمام أن المصل غني ب TGF- β وفيتامين أ ، والتي يعتقد أنها تلعب دورا محوريا في تكاثر البشرة2،3،4،5. بالإضافة إلى ذلك ، عند علاج المرضى الذين يعانون من أمراض سطح العين ، أظهرت العديد من الدراسات بعض مزايا قطرات العين AS في النتائج التي أبلغ عنها المريض ، ومعلمات العين الجافة الموضوعيةالأخرى 6,7 ، والنتائج المجهرية مثل كثافة الخلايا8. كشفت دراسات التحليل التلوي أنه قد تكون هناك بعض الفوائد في تحسين متلازمات المريض مع علاج قطرات العين AS ، ولكن النتائج والملاحظات على المدى الطويل لا تزال تفتقر إلى 9,10.
على عكس AS ، يتم اشتقاق البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) من إضافة مضاد للتخثر أثناء التحضير ، مع مزيد من الطرد المركزي التفاضلي والتنشيط الكيميائي للصفائح الدموية. بالمقارنة مع AS ، توجد العديد من المواد الكيميائية وعوامل النمو ، مثل TGF- β ، وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ، و EGF ، في PRP. كما تم تطبيقه على أمراض سطح العين مع فوائد سريرية في تخفيف الأعراض11.
العلاقة المتقاطعة بين العيوب الظهارية والالتهاب معقدة. والجدير بالذكر أن الفيزيولوجيا المناعية هي قضية مهمة أخرى في أمراض سطح العين. يعتقد أن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، مثل IL-1β و IFN-γ ، هي وسطاء محوريون في الشلالات الالتهابية12. وبالتالي يتم فتح طرق جديدة للعلاج على أساس فهم آلية المناعة. قد تلعب استراتيجيات إيقاف هذه العملية الالتهابية ، بما في ذلك إنتاج مضادات مستقبلات الإنترلوكين -1 (IL-1Ra) وغيرها من السيتوكينات المضادة للالتهابات ، دورا مهما في أمراض سطح العين13،14،15.
منذ عام 1998 ، تم استخدام Orthokine ، وهو مصل مكيف ذاتي تجاري (ACS) ، سريريا في مرضى العظام الذين يعانون من هشاشة العظام (OA) والتهاب المفاصل الروماتويدي (RA) واضطرابات العمود الفقري13. بالمقارنة مع AS و PRP ، فإن العلاج بالخرز الزجاجي المطلي كيميائيا وحضانة نقص الأكسجين لتنشيط الخلايا الوحيدة هي السمات المحددة ل ACS16. من الناحية النظرية ، يمكن إفراز المزيد من العوامل المضادة للالتهابات عن طريق إضافة إجهاد البقاء على قيد الحياة إلى الخلايا ، مما يؤدي إلى تركيز أعلى من المكونات الأساسية المعدلة للمناعة ، بما في ذلك IL-1Ra. كما تم الإبلاغ عن الفوائد العلاجية المحسنة ل ACS في الزراعة العضوية ، مقارنة ب AS ،17. تشترك أمراض سطح العين في خلفيات مناعية مماثلة مع أمراض التهاب العظام في بعض النواحي. لذلك ، بناء على النتائج الناجحة للعلاج المشتق من الدم البشري في مجال تقويم العظام ، قد يكون ل ACS مزايا على العلاجات التقليدية في الممارسة السريرية من خلال خصائص الظهارة وتعديل المناعة. على الرغم من استخدام ACS على نطاق واسع في أمراض التهاب العظام ، إلا أن تطبيقاته السريرية في طب العيون لا تزال بحاجة إلى استكشاف ، والتي قد تعوقها تكلفتها العالية ، ونقص دعم الأدبيات ، وعدم توحيد عملية التحضير ، مما يؤدي إلى أداء متنوع.
في مقالة الفيديو هذه ، تم عرض طريقة جديدة وفعالة من حيث التكلفة ومريحة لتوليد ACS المعدل (mACS) ، أو البلازما الغنية بعوامل النمو (PRGF) ، مما ينتج عنه محلول قطرة العين بقيمة عملية مماثلة ل ACSs التجارية. تم الاحتفاظ بالأفكار الرئيسية لإضافة مضادات التخثر وتحفيز خلايا الدم على إفراز السيتوكينات المضادة للالتهابات عن طريق الحضانة المجهدة ، ولكن على عكس الطرق المستحثة كيميائيا ، مثل تلك القائمة على الخرز الزجاجي المطلي ب CrSO4 والمجموعات التجارية ، يتم تحفيز حالة الإجهاد الحرجة جسديا عن طريق حضانة نقص الأكسجين في هذه الطريقة. علاوة على ذلك ، تمت إضافة الجلسرين لتوفير فوائد إضافية ، بما في ذلك زيادة استقرار غشاء خلايا الدم ، والحفاظ على ضغط السائل خارج الخلية التناضحيالمناسب 18 ، ومصدر مناسب للمغذيات في حالات نقص الأكسجين التي تتجنب الإجهاد الزائد للخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء البحث وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية في بداية قسم البروتوكول. تم تنفيذ جميع البروتوكولات والإجراءات وفقا لإعلان هلسنكي وتمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمؤسسة تشانغ غونغ الطبية. تم إبلاغ جميع المتطوعين بطبيعة هذه الدراسة ووقعوا على نموذج موافقة مستنيرة قبل إدراجهم. يتم عرض المواد الاستهلاكية المطلوبة للإجراء التجريبي بأكمله في الشكل 1 والشكل 2 ، وكذلك في جدول المواد.
1. تحضير المواد اللازمة لإنتاج قطرات العين mACS
- قم بإعداد 250 مل من محلول الجلسرين بنسبة 10٪ واحتفظ بمجموعة تسريب مجنحة الفراشة 21 جم ، ومحقنة سعة 3 مل بدون إبرة ، وستة أنابيب فراغ سعة 10 مل تحتوي على وحدات الهيبارين 158 USP جاهزة (الشكل 1).
- قم بتوصيل إبرة جمع الدم 21 جم بالمحقنة سعة 3 مل واسحب 3 مل من محلول الجلسرين بنسبة 10٪ إلى المحقنة المعدة.
ملاحظة: يجب تعقيم جميع المواد قبل إدخال الإبرة. - قم بتوزيع محلول الجلسرين بنسبة 10٪ في أنابيب الفراغ بالتسلسل ، مع ما يقرب من 0.5 مل من محلول الجلسرين بنسبة 10٪ في كل منها (الشكل 3 أ).
ملاحظة: بسبب الضغط السلبي في أنبوب الاختبار ، يجب أن تخرج الإبرة فور دخولها لتوزيع 3 مل من محلول الجلسرين بالتساوي على أنابيب الاختبار الستة. - تعقيم جلد المريض بمسحات قطنية معقمة بنسبة 75٪ من الكحول. ثقب الوريد السطحي للأطراف العلوية للمريض بإبرة جمع الدم 18 جرام. ارسم 60-70 مل من الدم الوريدي من الوريد السطحي في المجموع.
2. التحضير لقطرات العين mACS
- حقن 10 مل من الدم الوريدي المسحوب بالتتابع في كل من الأنابيب الفراغية الستة (الشكل 3 ب).
ملاحظة: تعتمد هذه الخطوة على الضغط السلبي للفراغ لملء الأنابيب. لتجنب اضطراب خلايا الدم وانحلال الدم ، لا تمارس أي ضغط إيجابي. - ضع الأنابيب الفراغية الستة في الحاضنة بدرجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات (الشكل 3C).
ملاحظة: يتم الحفاظ على حالة نقص الأكسجين واستقرارها من خلال الضغط السلبي المتبقي في أنبوب مغلق يتلقى الجلسرين. - قم بإزالة الأنابيب من الحاضنة بعد 4 ساعات وطردها مركزيا عند 3500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- في هذه المرحلة ، قم بإعداد المواد لاستخراج mACS ، بما في ذلك زجاجات قطرة العين المعقمة ، ومحقنة 3 مل بالإبرة ، ومرشح 0.22 ميكرومتر ، وإبرة 18 جم ، وزوج من القفازات المعقمة (الشكل 2).
ملاحظة: يجب مسح طاولة العمليات بنسبة 75٪ كحول لضمان بيئة معقمة. الطافي ، بعد الطرد المركزي ، هو بالفعل منتج نصف نهائي من mACS. - ضع الأنابيب الستة على رف الأنبوب وافتح الأغطية بعد الطرد المركزي الكامل (الشكل 3D).
ملاحظة: العقم غير مطلوب في هذه الخطوة. - ارتد قفازات معقمة واسحب mACS واحدا تلو الآخر باستخدام حقنة سعة 3 مل بإبرة 18 جرام.
ملاحظة: احرص على عدم رسم طبقة خلايا الدم السفلية خلال هذه الخطوة (الشكل 3E). - اسحب الإبرة ، وقم بتوصيلها بمرشح 0.22 ميكرومتر ، وقم بتوصيل إبرة جمع الدم 23 G ، 1.5 بوصة مع المحقنة الأصلية 3 مل بالمخرج أدناه (الشكل 3F).
- ادفع الإبرة برفق من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر في زجاجات قطرة العين المعقمة المعدة (الشكل 3G).
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه حتى يتم ترشيح جميع mACS وتخزينها في زجاجات قطرة العين (الشكل 3H).
- قم بتخزين قطرات العين mACS على حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري ؛ يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية للحفظ على المدى الطويل.
ملاحظة: لا تحتفظ بها لأكثر من أسبوعين عند 4 درجات مئوية أو لمدة تزيد عن 3 أشهر عند -20 درجة مئوية 9,19.
3. نموذج التئام الجروح خارج الجسم الحي لظهارة القرنية الفئران
ملاحظة: استند النموذج الحيواني خارج الجسم الحي التالي إلى خبرة سابقة من Hung et al. على الإصابات الميكانيكية لظهارة القرنية20. يجب تنفيذ الخطوات التالية تحت المجهر لإنشاء جرح ظهاري للقرنية محدد جيدا ومتناسق.
- تخدير الفئران C57BL / 6 مع 3٪ -4٪ إيزوفلوران. ضع مسافة بادئة لكمة خزعة الجلد فوق القرنية المركزية للفأر ، تاركا دائرة ضحلة على الظهارة كهامش جرح موحد.
ملاحظة: كن لطيفا لتجنب تمزق مقلة العين. - قم بإزالة ظهارة القرنية داخل المنطقة المؤكدة وصولا إلى طبقة بومان ، باستخدام مزيل حلقة صدأ القرنية المجهز بلدغ 0.5 مم.
- لإنشاء نموذج حيواني خارج الجسم الحي لجرح القرنية الميكانيكي ، قم بحصاد مقلة العين وإعداد الثقافة جيدا.
- القتل الرحيم للفئران أولا ؛ بعد ذلك ، اضغط برفق على الحافات المدارية العلوية والسفلية للفئران ، وأدخل طرف الملقط فوق الفضاء الخلفي ، وأخرج مقلة العين وأمسكها بالملقط.
- قطع العصب البصري والأنسجة الرخوة حول الحجاج بمقص القرنية لعزل مقلة العين بشكل مثالي.
- تحضير لوحة 96 بئرا مع الشمع المذاب بداخله. قم بإنشاء ثقب دائري بسرعة باستخدام أطراف الملقط ثم انتظر التصلب.
- تحضير الوسائط المراد اختبارها: 0.5٪ mACS ، 0.5٪ AS للمقارنة ، محلول ملحي عادي كعنصر تحكم سلبي ، ووسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM).
ملاحظة: يتم الحصول على mACS باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه. - بالنسبة للثقافة خارج الجسم الحي ، ضع مقلة العين المحصودة على اللوحة المعدة المكونة من 96 بئرا. أضف 200 ميكرولتر من كل وسيط إلى لوحة 96 بئرا.
- ضع صفيحة الاستزراع المكونة من 96 بئرا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. التأكد من تغيير الإعلام الثقافي كل 24 ساعة.
- لتأكيد تأثير التئام الجروح المتسلسل ، راقب منطقة الجرح الظهاري تحت المجهر كل 8 ساعات عن طريق تلطيخ الفلوريسين.
- حل الفلوريسئين على ورقة الفلوريسئين مع المياه المالحة العادية.
- أسقط صبغة الفلوريسئين على القرنية المركزية للفأر ، ثم راقبها ووثقها تحت المجهر. تظهر نتيجة نموذجية في الشكل 4.
ملاحظة: قطرة واحدة (حوالي 0.05 مل) من صبغة الفلوريسئين كافية للمراقبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 والشكل 2 المواد اللازمة للتجربة ، ويعرض الشكل 3 الخطوات المتسلسلة والمنتجات المتوسطة الناجحة أثناء تحضير mAcs. أولا ، تمت إضافة 0.5 مل من محلول الجلسرين بنسبة 10٪ إلى كل أنبوب اختبار معقم سعة 10 مل (الشكل 3 أ). ثم ، تم الحصول على 60-70 مل من الدم الوريدي من المريض ، وتم حقن 10 مل من الدم في كل أنبوب (الشكل 3 ب). يجب أن يخضع دم المريض لفحوصات مخبرية شاملة ومنتظمة قبل التحضير للتأكد من أن جودة الدم تصل إلى المستوى القياسي. يرجع منتج الدم منخفض الجودة الأكثر شيوعا إلى دسليبيدميا ، مما يؤدي إلى طبقة عليا غائمة من المصل بعد الطرد المركزي يصعب إزالتها. لا يمكن الاستمرار في تحضير قطرات العين (الشكل 5 أ).
بعد ذلك ، يتم وضع أنبوب الاختبار المختوم في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات (الشكل 3C). بعد الحضانة والطرد المركزي ، يمكن فصل العينة إلى طبقة عليا تحتوي على المنتج الأولي ل mACS وطبقة خلايا الدم السفلية (الشكل 3D). ثم تم جمع سائل الطبقة العليا. تقنيات التعقيم ضرورية فيما بعد. نظرا لأن المصل هو بيئة تكاثر مغذية للغاية للكائنات الحية الدقيقة ، يجب تطهير أي سطح يتلامس مع الإبرة بنسبة 75٪ كحول أولا ، ويجب استخدام قفازات معقمة أثناء العملية. الأهم من ذلك ، يجب تجنب اضطراب خلايا الدم من الطبقة السفلى عند إزالة المادة الطافية (الشكل 3E).
في هذه الخطوة ، من المتوقع أن يكون الطافي صافيا أو أصفر باهتا. ومع ذلك ، إذا شوهد لون أحمر طفيف ، فقد يحدث انحلال الدم ، وقد لا يكون التحضير مناسبا للخطوات اللاحقة (الشكل 5 ب). يمكن طرد المصل الذي تم جمعه مرة أخرى لضمان خلو المادة الطافية من خلايا الدم الحمراء. تم ترشيح المصل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر في زجاجة قطرة معقمة للعين (الأشكال 3F ، G). ثم تم تبريد المنتج النهائي ، قطرات العين mACS ، أو تجميده في أسرع وقت ممكن ، اعتمادا على الغرض (الشكل 3H). لا يمكن تخزين قطرات العين لفترة طويلة بسبب ثرائها في العناصر الغذائية المرنة ونقص المواد الحافظة.
في نموذج الشفاء السطحي خارج الجسم الحي ، أظهرت قطرة العين mACS نتيجة متفوقة في التئام جروح القرنية مقارنة بقطرة العين AS. تم حصاد مقل العيون من الفئران C57BL / 6 بعد إنشاء جرح القرنية متحدة المركز عن طريق التآكل الجسدي تحت المجهر. بعد ذلك ، تم استزراع عيون الفئران التي تم التضحية بها في أربع وسائط مختلفة ، بما في ذلك محلول ملحي طبيعي نقي ، DMEM ، 0.5٪ AS ، و 0.5٪ mACS.
تم إعداد وسيط AS المستخدم هنا بناء على الأدبيات21 والممارسة السريرية في مستشفى Chang Gung Memorial Linkou. تم سحب الدم الوريدي ، 40 مل في المجموع ، إلى أنابيب فراغية من المتطوعين بعد تعقيم الجلد. لم تتم إضافة أي مضادات للتخثر إلى الأنابيب. ثم تم تخزين الدم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لضمان التخثر الكامل يليه الطرد المركزي عند 3500 × غرام لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، احتلت AS النقية الطبقة العليا من الأنابيب ، والتي تم تخفيفها بواسطة BSS (محلول الري المعقم) إلى 0.5٪ في هذا النموذج الحيواني خارج الجسم الحي .
لوحظت جروح القرنية بالتتابع في ست نقاط زمنية مختلفة ، وهي 0 و 8 و 16 و 24 و 32 و 48 ساعة. أظهرت النتائج الأولية أنه في الساعة 16 ، تلتئم جروح القرنية بشكل أسرع تحت قطرة العين mACS بنسبة 0.5٪ مقارنة بالمجموعات الأخرى. في 24 ساعة ، كان لمجموعات 0.5٪ AS و DMEM تأثيرات علاجية مماثلة مع قطرة العين 0.5٪ mACS. لوحظ شفاء جروح القرنية ، بالقرب من الشفاء التام ، في 32 ساعة ، باستثناء المجموعة المالحة الطبيعية (الشكل 4).
الشكل 1: المواد اللازمة لإضافة 10٪ من محلول الجليسرول إلى الأنابيب . (أ) مجموعة ضخ مجنحة فراشة 21 جم. ب: 250 mL من محلول الجليسرول 10٪. (ج) ستة أنابيب مفرغة سعة 10 مل تحتوي على وحدات الهيبارين 158 USP. د: حقنة سعة 3.0 مل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مواد استخلاص وترشيح المادة الطافية لعينة الدم. أ: مرشح 0.22 ميكرومتر. (ب) زجاجة قطرة عين معقمة سعة 5 مل. ج: زوج من القفازات المعقمة. د: حقنة 3 mL بإبرة 23 G. ه: حقنة سعة 20 مل. (و) 18 جم إبرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إجراءات الطرد المركزي للدم والتحضير لإنتاج قطرات مصل الدم المكيفة ذاتية المعدلة . (أ) أضيف 0.5 mL من محلول الجليسرول بنسبة 10٪ إلى كل أنبوب اختبار. (ب) قسمت عينة الدم التي جمعت من المريض بالتساوي إلى ستة أنابيب اختبار (أنبوب واحد فقط موضح في الصورة). ج: ظهور أنبوب الاختبار بعد وضعه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. د: طبقات المصل وخلايا الدم بعد الطرد المركزي. ه: البقايا بعد شفط المادة الطافية. يجب على المرء أن يكون حريصا على عدم استنشاق طبقة خلايا الدم السفلى. (F) يتم جمع المادة الطافية في حقنة سعة 3 مل ويتم إدخال مرشح 0.22 ميكرومتر وإبرة 23 G تحتها. (ز) يتم دفع الإبرة برفق في زجاجة قطرة العين المعقمة. (H) المنتج النهائي لقطرات العين ACS المعدلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التغيرات المتسلسلة لجروح القرنية (المساحات الخضراء في الأشكال بعد تلطيخ الفلورسين) في عيون الفئران في أربعة وسائط استزراع مختلفة بمرور الوقت. لم يلاحظ أي فرق كبير في المجموعة المالحة ، في حين لوحظ التئام الجروح (الأسهم) بمرور الوقت في مجموعات DMEM ، 0.5٪ AS ، و 0.5٪ mACS. في مجموعة mACS 0.5٪ ، كان التئام الجروح (الأسهم) أكثر اكتمالا بشكل ملحوظ عند 16 ساعة من أولئك الذين عولجوا ب AS و DMEM. في 24 ساعة ، أظهرت مجموعات DMEM و 0.5٪ mACS و 0.5٪ AS تأثيرات علاجية أخرى (الأسهم) ، خاصة في مجموعة mACS. لوحظ الشفاء شبه التام عند 32 ساعة لجميع المجموعات ، باستثناء المجموعة المالحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أمثلة على ضعف منتجات الدم بعد الطرد المركزي. أ: دسليبيدميا. المنتجات المعيبة الأكثر شيوعا هي بسبب السمنة أو داء السكري ، حيث يحتوي المصل العلوي على نسبة عالية من الدهون والكوليسترول. ب: انحلال الدم. هذا هو أيضا منتج شائع دون المستوى الأمثل. يمكن أن يعزى السبب الرئيسي إلى استخدام إبر صغيرة لسحب الدم أو استخدام قوة خارجية غير مناسبة في حقن منتجات الدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول لإعداد mACS وتظهر فائدة قطرات العين mACS في التئام الجروح للنماذج الحيوانية. التعديل الحاسم لبروتوكول mACS هذا هو إضافة ما يقرب من 0.5 مل من محلول الجلسرين بنسبة 10٪ في كل أنبوب اختبار ، مما يخلق ظروفا مناسبة لنقص الأكسجين خلال فترة الحضانة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. يوفر هذا الإعداد ل AS الضغط المناسب والخلايا السريعة لإفراز عوامل النمو الضرورية التي تساعد على التئام الجروح. يمكن أن يساعد مرشح 0.22 ميكرومتر في القضاء على البروتينات الجزيئية الكبيرة وخلايا الدم والشوائب ، مما يجعل المنتج النهائي نقيا وأقل التصاقا.
يتم تحضين الدم لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية ، ويتم إجراء مزيد من الطرد المركزي والترشيح. الاهتمام الصارم بالعقم أثناء إعداد وتخزين المنتجات النهائية في درجة حرارة مناسبة أمر بالغ الأهمية أيضا. المحتوى الغذائي العالي في منتجات المصل النهائية هو وسيلة زراعة ممتازة للبكتيريا. وبالتالي ، فإن التخزين غير السليم أو التلوث أثناء التحضير قد يفسد قطرات العين. يمكن أن يسبب mACS الملوث أمراضا مثل التهاب الملتحمة أو التهاب القرنية المعدي.
نوعية دم المريض مهمة أيضا. لذلك ، هناك حاجة إلى اختبارات معملية قبل إعداد mACS لضمان سلامة منتجات الدم. أثناء السحب وعند تشغيل عينات دم المريض ، يجب أن يكون المشغلون على دراية بانحلال الدم. أي ضغط أثناء التحضير يمكن أن يسبب بسهولة انحلال الدم. لذلك ، يجب سحب المحقنة ودفعها ببطء أثناء جمع الدم. يجب أيضا التحكم في نقص الأكسجة للحصول على تركيزات عالية من عوامل النمو والسيتوكينات المضادة للالتهابات. استنادا إلى الخبرة والدراسات المنشورة سابقا22,23 ، فإن تطبيق حضانة نقص الأكسجين لمدة 4 ساعات هو الإعداد النهائي. يمكن أن يوفر الجلسرين ضغطا أكثر ملاءمة لنقص الأكسجين للخلية ، بسبب تأثير التثبيت وضغط السائل خارج الخلية التناضحي المناسب الذي يمكن أن يوفره18. ومع ذلك ، لا يزال يتعين التحقق من التركيز الأمثل للجلسرين وكيفية ارتباطه بتركيز السيتوكين. في المستقبل ، سيكون هناك ما يبرر الدراسات الحيوانية في الجسم الحي لالتئام الجروح وتجربة مراقبة عشوائية واسعة النطاق لتأكيد فعاليتها.
حتى الآن ، ركزت الأبحاث بشكل أساسي على تطبيق منتجات المصل على أمراض سطح العين باستخدام AS التقليدي وقطرات العين PRP الناشئة24،25،26،27. AS التقليدي بدون أي مضاد للتخثر ولا يستخدم أي مرشح أثناء التحضير هو العنبر في شكله النقي ، ولكنه غالبا ما يجعل المرضى غير مرتاحين بسبب التصاقه. نتيجة لذلك ، عادة ما يتم استخدام AS المخفف (20٪ -50٪) ، مما يقلل من تركيزات العناصر الغذائية. ومع ذلك ، فإن PRP أقل التصاق وعادة ما يستخدم في شكله النقي (100٪). تشير تقارير الأدبيات الحديثة في الغالب إلى أن PRP يوفر تأثيرات أفضل مضادة للالتهابات والتئام الجروح من AS ، ويرجع ذلك أساسا إلى محتواه الغني في السيتوكينات المضادة للالتهابات ، وعوامل النمو ، وقدرته على تخفيف الالتهاب الناجم عن IL-1β16,26. وجدت تجربة معشاة ذات شواهد أجراها García-Conca et al. بالفعل أن تطبيق PRP في أمراض جفاف العين شديدة أو معتدلة الإفراز يظهر نتائج مرضية28. على الرغم من أن ACS ، كتحسن على AS ، نادرا ما تم الإبلاغ عنه في أمراض سطح العين الالتهابية والتنكسية ، فقد تم استخدامه على نطاق واسع في علاج التهاب المفاصل التنكسي والتئام الجروح في جراحة العظام29،30،31. تم تصنيع ACS الأكثر شيوعا وبراءة اختراعه كمجموعة تجارية13,32. تم تصميم mACS بعد تعديل عملية إعداد ACS للجمع بين نقاط القوة لكل من ACS و PRP. يمكن إنتاج mACS بتكلفة أكثر اقتصادا لأنه لا توجد حاجة إلى كواشف خاصة ، مثل الخرز الزجاجي المطلي ب CrSO4 أو أي مجموعات حاصلة على براءة اختراع ، والتي تكون ضرورية في إعداد كل من ACS و PRP.
بصرف النظر عن القلق الاقتصادي ، قدمت قطرات العين mACS أيضا نتائج أولية مرضية في تجربة خارج الجسم الحي ، وقد تكون بديلا ثوريا لقطرات العين الحالية الناشئة PRP. وتجدر الإشارة إلى أن ACS أظهرت نتائج أفضل من معظم العلاجات الراسخة في أمراض المفاصل الالتهابية نوعيا وكميا بسبب قدرتها المضادة للالتهابات وتحسين آليات الإصلاح الداخلية17. على الرغم من عدم وجود أدلة أدبية على الآثار العلاجية ل ACS في طب العيون حتى الآن ، فمن المعقول افتراض إمكانية تطبيقه على المرضى الذين يعانون من عيوب ظهارية في القرنية بسبب آليته المضادة للالتهابات والنجاح في جراحة العظام33. تمت مقارنة AS فقط مع mACS في دراستنا خارج الجسم الحي . ومع ذلك ، يمكن أيضا مقارنة PRP و ACS المنتجة عبر مجموعات تجارية. ستكون الأبحاث المستقبلية في تحليل مستويات السيتوكينات المضادة للالتهابات في المصل وعوامل النمو في mACS مفيدة في تأكيد تشابهها مع ACS أو PRP ، والتفوق المحتمل على AS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون Ya-Lan Chien و Chia-Ying Lee على المساعدة الفنية الممتازة ، وشركة OnLine English على الطبعة اللغوية. تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل مشروع تشانغ غونغ للبحوث الطبية (رقم المنحة CMRPG3L1491).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
- Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
- Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
- Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
- Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
- Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
- Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
- Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
- Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
- Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
- Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
- Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
- Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
- Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
- Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
- Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
- Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
- Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
- Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
- Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
- Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
- Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
- Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
- NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
- Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
- Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
- Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
- Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
- Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
- Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).
