Summary
Denna artikel beskriver ett protokoll för att förenkla processen och göra beredningen av autologt konditionerat serum (ACS) billigare. Inga speciella sprutor eller ytbelagda glaspärlor behövs. Dessutom har den modifierade ACS (mACS) konkurrensfördelar jämfört med konventionellt autologt serum vid sårläkning av murina ögon ex vivo.
Abstract
Mänskliga blod-härledda aktuella terapier har varit en välsignelse för kliniker under de senaste decennierna. Autologt serum (AS) och trombocytrik plasma (PRP) är anrikade i epiteliotropa tillväxtfaktorer som är väsentliga vid sårläkning i hornhinnan. Till skillnad från AS är PRP baserat på ett differentiellt centrifugeringssystem, vilket ger fler trombocytbaserade tillväxtfaktorer. Autologt konditionerat serum (ACS) bevarar inte bara beredningen av AS och PRP, utan fokuserar också på immunmodulerande egenskaper, som är viktiga vid inflammatoriska sjukdomar.
Bristen på standardiserade protokoll och höga förberedelsekostnader är begränsningar för klinisk tillämpning av ACS. Detta videoexperiment visar en standardprocedur för beredning av modifierade autologa konditionerade serum (mACS) ögondroppar. Först tillsattes glycerol i heparinsprutor som blodcellsstabilisator under hypoxisk inkubation. För att aktivera blodkropparna initierades en 4 h inkubation vid 37 °C. Därefter centrifugerades blodproverna vid 3 500 × g i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter filtrering av supernatanten genom ett 0,22 μm filter var mACS ögondroppar fullt förberedda.
En tentativ undersökning av den terapeutiska effekten av mACS visade att det kan ha konkurrensfördelar jämfört med konventionell AS vid sårläkning i hornhinnans sår i mus ex vivo . AS som användes i denna studie utarbetades enligt publicerade studier och klinisk praxis på vårt sjukhus. Därför kan effekten av mACS på sjukdomar på ögonytan utvärderas i framtida forskning genom in vivo-djurstudier och kliniska prövningar.
Introduction
De terapeutiska effekterna av autologt serum (AS) vid torra ögonsjukdomar rapporterades först på 1980-talet av Fox et al.1. Man tror att både smörjegenskapen och de väsentliga epiteliotropa biokemiska komponenterna i AS, som efterliknar naturliga tårar, gynnar spridningen av hornhinneepitelceller. Under de senaste decennierna har flera studier utförts på grundval av detta. Trofiska komponenter inkluderar epidermal tillväxtfaktor (EGF), vitamin A, transformerande tillväxtfaktor β (TGF-β) och andra cytokiner. Intressant nog är serumet rikt på TGF-β och vitamin A, som tros spela en avgörande roll i epidermal proliferation 2,3,4,5. Vid behandling av patienter med ögonytesjukdomar har dessutom flera studier visat vissa fördelar med AS-ögondroppar i patientrapporterade resultat, andra objektiva parametrar för torra ögon 6,7 och mikroskopiska fynd såsom celldensitet8. Metaanalysstudier visade att det kan finnas vissa fördelar med att förbättra patientens syndrom med AS-ögondroppsbehandling, men långsiktiga resultat och observationer saknas fortfarande 9,10.
Till skillnad från AS härrör trombocytrik plasma (PRP) från tillsats av ett antikoagulantia under beredningen, med ytterligare differentialcentrifugering och kemisk aktivering av blodplättarna. Jämfört med AS finns många kemikalier och tillväxtfaktorer, såsom TGF-β, vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och EGF, närvarande i PRP. Det har också tillämpats på ögonytesjukdomar med kliniska fördelar vid symtomlindring11.
Tvärbindningen mellan epiteldefekter och inflammation är komplex. I synnerhet är immunopatofysiologi en annan viktig fråga vid ögonytsjukdomar. Proinflammatoriska cytokiner, såsom IL-1β och IFN-γ, tros vara pivotala mediatorer i inflammatoriska kaskader12. Nya behandlingsvägar öppnas därmed baserat på förståelse av immunmekanismen. Strategier för att stoppa denna inflammatoriska process, inklusive produktion av interleukin-1-receptorantagonist (IL-1Ra) och andra antiinflammatoriska cytokiner, kan också spela en viktig roll vid ögonytsjukdomar13,14,15.
Sedan 1998 har Orthokine, ett kommersialiserat autologt konditionerat serum (ACS), använts kliniskt hos ortopediska patienter som lider av artros (OA), reumatoid artrit (RA) och ryggradssjukdomar13. Jämfört med AS och PRP är behandling med kemiskt belagda glaspärlor och hypoxisk inkubation för att aktivera monocyter de specifika egenskaperna hos ACS16. Teoretiskt kan mer antiinflammatoriska faktorer utsöndras genom att lägga till överlevnadsstress i cellerna, vilket resulterar i en högre koncentration av väsentliga immunmodulerande komponenter, inklusive IL-1Ra. De förbättrade terapeutiska fördelarna med ACS vid OA, jämfört med AS, har också rapporterats17. Ögonytsjukdomar delar liknande immunbakgrund med ortopediska inflammatoriska sjukdomar i vissa avseenden. Baserat på de framgångsrika resultaten av human blodbaserad terapi inom det ortopediska området kan ACS därför ha fördelar jämfört med konventionella behandlingar i klinisk praxis genom epiteliotropa och immunmodulerande egenskaper. Även om ACS har använts i stor utsträckning vid ortopediska inflammatoriska sjukdomar, behöver dess kliniska tillämpningar inom oftalmologi fortfarande utforskas, vilket kan hindras av dess höga kostnad, brist på litteraturstöd och brist på standardisering av beredningsprocessen, vilket resulterar i olika prestanda.
I den här videoartikeln demonstrerades en ny, kostnadseffektiv och bekväm metod för att generera modifierad ACS (mACS), eller plasma rik på tillväxtfaktorer (PRGF), vilket ger en ögondroppslösning med ett jämförbart praktiskt värde med kommersialiserade ACS. De viktigaste idéerna att tillsätta antikoagulantia och utlösa blodkropparna för att utsöndra antiinflammatoriska cytokiner genom stressad inkubation behölls, men till skillnad från de kemiskt inducerade metoderna, såsom de baserade på CrSO4-belagda glaspärlor och kommersiella kit, induceras den kritiska stressstatusen fysiskt av hypoxisk inkubation i denna metod. Dessutom tillsattes glycerol för att ge extra fördelar, inklusive en ökning av stabiliteten hos membranet i blodkroppar, upprätthållande av ett korrekt osmotiskt extracellulärt vätsketryck18 och en lämplig källa till näringsämnen vid hypoxiska förhållanden som undviker överbelastning av cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer i början av protokollavsnittet. Alla protokoll och procedurer utfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och granskades och godkändes av Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Alla frivilliga informerades om studiens karaktär och undertecknade ett formulär för informerat samtycke innan de inkluderades. De förbrukningsvaror som krävs för hela försöksförfarandet presenteras i figur 1 och figur 2 samt i materialtabellen.
1. Beredning av de material som behövs för att producera mACS ögondroppar
- Bered 250 ml 10 % glycerollösning och håll ett 21 G fjärilsvinnat infusionsset, en 3 ml spruta utan nål och sex 10 ml vacutainerrör innehållande heparin 158 USP-enheter redo (figur 1).
- Anslut 21 G bloduppsamlingsnål till 3 ml spruta och dra upp 3 ml 10% glycerollösning i den förberedda sprutan.
OBS: Allt material måste steriliseras innan nålen sätts in. - Fördela 10% glycerollösningen i vacutainerrören i följd, med cirka 0,5 ml 10% glycerollösning i varje (figur 3A).
OBS: På grund av undertrycket i provröret måste nålen komma ut omedelbart efter att den går in för att jämnt fördela 3 ml glycerollösning till de sex provrören. - Sterilisera patientens hud med 75% alkoholsterila bomullspinne. Punktera den ytliga venen i patientens övre extremiteter med 18 G bloduppsamlingsnål. Dra totalt 60-70 ml venöst blod från den ytliga venen.
2. Förberedelse för mACS ögondroppar
- Injicera sekventiellt 10 ml av det dragna venösa blodet i vart och ett av de sex vakutainerrören (figur 3B).
OBS: Detta steg är beroende av vakuumets undertryck för att fylla rören. För att undvika störningar i blodkroppar och hemolys, applicera inte något positivt tryck. - Placera de sex vacutainerrören i inkubatorn med en konstant temperatur på 37 °C i 4 timmar (figur 3C).
OBS: Den hypoxiska statusen upprätthålls och stabiliseras av det återstående undertrycket i ett förseglat rör som fick glycerol. - Ta bort rören från inkubatorn efter 4 timmar och centrifugera dem vid 3 500 × g i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Förbered nu materialen för mACS-extraktion, inklusive steriliserade ögondroppsflaskor, en 3 ml spruta med nålen, ett 0,22 μm filter, en 18 G nål och ett par sterila handskar (figur 2).
OBS: Operationsbordet ska torkas med 75% alkohol för att säkerställa en aseptisk miljö. Supernatanten, efter centrifugering, är redan en halvfabrikat av mACS. - Placera de sex rören på rörstället och öppna locken efter fullständig centrifugering (figur 3D).
OBS: Sterilitet krävs inte i detta steg. - Sätt på sterila handskar och dra ut mACS en efter en med en 3 ml spruta med en 18 G nål.
OBS: Var försiktig så att du inte drar det nedre blodkroppsskiktet under detta steg (figur 3E). - Dra ut nålen, anslut den till 0,22 μm-filtret och anslut 23 G, 1,5 tum bloduppsamlingsnålen med den ursprungliga 3 ml sprutan till utloppet nedan (figur 3F).
- Tryck försiktigt nålen genom 0,22 μm-filtret in i de förberedda sterila ögondroppsflaskorna (figur 3G).
- Upprepa stegen ovan tills alla mACS har filtrerats och förvarats i ögondroppsflaskor (bild 3H).
- Förvara mACS ögondroppar vid 4 °C för omedelbar användning. förvaras vid -20 °C för långvarig konservering.
OBS: Förvara dem inte i mer än 2 veckor vid 4 °C eller längre än 3 månader vid -20 °C 9,19.
3. Ex vivo sårläkningsmodell av murint hornhinneepitel
OBS: Följande ex vivo djurmodell baserades på tidigare erfarenheter från Hung et al. på mekaniska skador på hornhinnans epitel20. Följande steg bör utföras under mikroskopet för att skapa ett väl avgränsat och konsekvent hornhinneepitelsår.
- Bedöva C57BL/6-mössen med 3%-4% isofluran. Dra in hudbiopsistansen över murina centrala hornhinnan och lämna en grund cirkel på epitelet som en enhetlig sårmarginal.
OBS: Var försiktig för att undvika ögonglobsbrott. - Debridera hornhinnans epitel inom det bekräftade området ner till Bowmans lager, med en hornhinnerostringborttagare utrustad med en 0,5 mm gradering.
- För att fastställa ex vivo-djurmodellen för det mekaniska hornhinnesåret, skörda ögongloben och förbered kulturen väl.
- Avliva mössen först; Tryck sedan försiktigt på mössens överlägsna och underlägsna orbitalfälgar, för in spetsen på pincetten över retrobulbarutrymmet och ut ögongloben och håll den i pincetten.
- Skär synnerven och periorbital mjukvävnad med hornhinnesax för att isolera ögongloben perfekt.
- Förbered en 96-brunnsplatta med smält vax inuti den. Skapa snabbt ett runt hål med spetsarna på pincett och vänta sedan på stelning.
- Förbered mediet som ska testas: 0,5% mACS, 0,5% AS för jämförelse, normal saltlösning som negativ kontroll och Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM).
OBS: mACS erhålls med hjälp av protokollet som nämns ovan. - För ex vivo-kulturen , placera den skördade ögongloben på den förberedda 96-brunnsplattan. Tillsätt 200 μL av varje medium i plattan med 96 brunnar.
- Placera odlingsplattan med 96 brunnar i inkubatorn vid 37 °C med 5 %CO2. Se till att kulturmediet byts ut var 24:e timme.
- För att bekräfta den sekventiella sårläkningseffekten, övervaka epitelsårområdet under mikroskopet var 8: e timme genom fluoresceinfärgning.
- Lös upp fluoresceinet på fluoresceinpapperet med normal saltlösning.
- Släpp fluoresceinfärgen på murina centrala hornhinnan, observera och dokumentera det sedan under ett mikroskop. Ett typiskt resultat visas i figur 4.
OBS: En droppe (cirka 0,05 ml) fluoresceinfärgämne räcker för observationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 och figur 2 visar de material som behövs för experimentet, och figur 3 visar de sekventiella stegen och de framgångsrika mellanprodukterna under beredningen av mACS. Först tillsattes 0,5 ml 10% glycerollösning i varje 10 ml sterilt provrör (figur 3A). Därefter erhölls 60-70 ml venöst blod från patienten och 10 ml blod injicerades i varje rör (figur 3B). Patientens blod måste genomgå grundliga, regelbundna laboratorieundersökningar före beredningen för att säkerställa att blodets kvalitet är upp till standard. Den vanligaste blodprodukten av låg kvalitet beror på dyslipidemi, vilket resulterar i ett grumligt övre lager av serum efter centrifugering som är svårt att ta bort; ytterligare beredning av ögondroppar kan inte fortsätta (figur 5A).
Därefter placeras det förseglade provröret i en inkubator vid 37 °C i 4 timmar (figur 3C). Efter inkubation och centrifugering kan provet separeras i ett övre skikt innehållande den preliminära produkten av mACS och ett nedre blodcellsskikt (figur 3D). Den övre lagervätskan samlades sedan upp. Aseptiska tekniker är viktiga i det följande. Eftersom serumet är en mycket näringsrik avelsmiljö för mikroorganismer måste alla ytor som kommer i kontakt med nålen desinficeras med 75% alkohol först och sterila handskar måste användas under processen. Viktigt är att störningar av blodkropparna från det nedre lagret bör undvikas när supernatanten avlägsnas (figur 3E).
Vid detta steg förväntas supernatanten vara klar eller blekgul. Om en liten röd färg ses kan hemolys ha inträffat och preparatet kanske inte är lämpligt för de efterföljande stegen (figur 5B). Det uppsamlade serumet kan centrifugeras igen för att säkerställa att supernatanten är fri från röda blodkroppar. Serumet filtrerades genom ett 0,22 μm filter till en steril ögondroppsflaska (figur 3F,G). Slutprodukten, mACS ögondroppar, kyldes eller frystes sedan så snart som möjligt, beroende på syftet (figur 3H). Ögondropparna kunde inte lagras för länge på grund av deras rikedom i labila näringsämnen och bristen på konserveringsmedel.
I ex vivo-ytläkningsmodellen visade mACS ögondroppe ett överlägset resultat vid sårläkning i hornhinnan jämfört med AS-ögondroppen. Skörd av ögongloberna hos C57BL / 6-möss gjordes efter att ha skapat ett koncentriskt hornhinnessår genom fysisk nötning under mikroskopet. Därefter odlades de offrade mössögonen i fyra olika medier, inklusive ren normal saltlösning, DMEM, 0,5% AS och 0,5% mACS.
AS-mediet som används här bereddes baserat på litteraturen21 och den kliniska praxisen i Chang Gung Memorial Hospital Linkou. Venöst blod, totalt 40 ml, drogs in i vacutainerrör från frivilliga efter hudsterilisering. Inget antikoagulantia tillsattes till rören. Blodet lagrades sedan i 30 minuter vid rumstemperatur för att säkerställa fullständig koagulering följt av centrifugering vid 3 500 × g i 10 minuter. Efter centrifugering upptog den rena AS det övre lagret av rören, som späddes med BSS (steril bevattningslösning) till 0,5% i denna ex vivo-djurmodell .
Hornhinnesår observerades sekventiellt vid sex olika tidpunkter, nämligen 0, 8, 16, 24, 32 och 48 timmar. De preliminära resultaten visade att hornhinnans sår vid 16 timmar läkte snabbare under 0,5% mACS ögondroppe än de andra grupperna. Vid 24 timmar hade 0,5 % AS- och DMEM-grupperna jämförbara terapeutiska effekter med 0,5 % mACS ögondroppe. Läkning av hornhinnans sår, nära full återhämtning, observerades vid 32 timmar, med undantag för den normala saltlösningsgruppen (figur 4).
Figur 1: Material som behövs för att tillsätta 10 % glycerollösning i rören . a) 21 G fjärilsvingat infusionsset. (B) 250 ml 10% glycerollösning. (C) Sex 10 ml vacutainerrör innehållande heparin 158 USP-enheter. (D) 3,0 ml spruta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Material för extraktion och filtrering av blodprovets supernatant . a) Ett filter på 0,22 μm. (B) En 5 ml steriliserad ögondroppsflaska. (C) Ett par sterila handskar. d) En 3 ml spruta med 23 G nål. (E) En 20 ml spruta. F) 18 G nålar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förfaranden för blodcentrifugering och beredning för framställning av modifierade autologa konditionerade serumögondroppar . (A) 0,5 ml 10% glycerollösning tillsattes i varje provrör. (B) Blodprovet som samlats in från patienten delades lika i sex provrör (endast ett visas på bilden). C) Provrörets utseende efter att ha placerats i en inkubator vid 37 °C i 4 timmar. D) Serum- och blodkroppsskikten efter centrifugering. (E) Återstoden efter aspirering av supernatanten. Man bör vara försiktig så att man inte aspirerar det nedre blodkroppsskiktet. (F) Supernatanten samlas upp i 3 ml spruta och ett 0,22 μm filter och 23 G nål sätts in under den. (G) Nålen trycks försiktigt in i den sterila ögondroppsflaskan. (H) Slutprodukten av de modifierade ACS-ögondropparna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Sekventiella förändringar av hornhinnesår (gröna områden i figurerna efter fluoresceinfärgning) i murina ögon i fyra olika odlingsmedier över tid. Ingen signifikant skillnad observerades i saltlösningsgruppen, medan sårläkning (pilar) över tid observerades i DMEM-, 0,5% AS- och 0,5% mACS-grupperna. I gruppen med 0,5 % mACS var sårläkningen (pilarna) signifikant mer fullständig vid 16 timmar än de som behandlades med AS och DMEM. Vid 24 timmar visade DMEM-, 0,5% mACS- och 0,5% AS-grupperna ytterligare läkande effekter (pilar), särskilt i mACS-gruppen. Nästan total återhämtning observerades vid 32 timmar för alla grupper, förutom saltlösningsgruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Exempel på dåliga blodprodukter efter centrifugering . a) Dyslipidemi. De vanligaste defekta produkterna beror på fetma eller diabetes mellitus, eftersom det övre serumet innehåller högt fett och kolesterol. b) Hemolys. Detta är också en vanlig suboptimal produkt. Den främsta orsaken kan hänföras till att använda nålar med liten borrning för bloddragning eller använda olämplig extern kraft vid injektion av blodprodukter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskrivs ett protokoll för beredning av mACS och nyttan av mACS ögondroppar vid sårläkning av djurmodeller visas vidare. Den avgörande modifieringen av detta mACS-protokoll är tillsatsen av cirka 0,5 ml 10% glycerollösning i varje provrör, vilket skapar lämpliga hypoxiska förhållanden under 4 timmars inkubation vid 37 ° C. Denna inställning ger AS rätt stress och uppmanar celler att utsöndra nödvändiga tillväxtfaktorer som hjälper sårläkning. Filtret på 0,22 μm kan hjälpa till att eliminera makromolekylära proteiner, blodkroppar och föroreningar, vilket gör slutprodukten ren och mindre vidhäftande.
Blodet inkuberas i 4 timmar vid 37 °C och ytterligare centrifugering och filtrering utförs. Strikt uppmärksamhet på sterilitet under beredning och lagring av slutprodukterna vid rätt temperatur är också avgörande. Det höga näringsinnehållet i de slutliga serumprodukterna är ett utmärkt odlingsmedium för bakterierna. Således kan felaktig lagring eller förorening under beredningen förstöra ögondropparna. Förorenade mACS kan orsaka sjukdomar som konjunktivit eller infektiös keratit.
Kvaliteten på patientens blod är också viktigt; Därför behövs laboratorietester före beredningen av mACS för att säkerställa säkerheten hos blodprodukter. Under ritning och vid användning av patientens blodprover bör operatörerna vara medvetna om hemolys. Eventuellt tryck under beredningen kan lätt orsaka hemolys; Därför ska sprutan dras och tryckas långsamt under blodinsamlingen. Hypoxi bör också kontrolleras för att uppnå höga koncentrationer av tillväxtfaktorer och antiinflammatoriska cytokiner. Baserat på erfarenhet och tidigare publicerade studier22,23 är tillämpningen av en 4 h hypoxisk inkubation den ultimata inställningen. Glycerol kan ge mer lämplig hypoxisk stress till cellen på grund av stabiliseringseffekten och det korrekta osmotiska extracellulära vätsketrycket som det kan ge18. Den optimala koncentrationen av glycerol och hur den korrelerar med cytokinkoncentrationen måste dock fortfarande kontrolleras. I framtiden kommer in vivo-djurstudier av sårläkning och en storskalig randomiserad kontrollstudie att vara motiverade för att bekräfta dess effekt.
Hittills har forskningen främst fokuserat på att applicera serumprodukter på ögonytesjukdomar med traditionell AS och de framväxande PRP-ögondropparna24,25,26,27. Traditionell AS utan antikoagulantia och utan filter under beredningen är bärnsten i sin rena form, men gör ofta patienter obekväma på grund av dess vidhäftning. Som ett resultat används vanligtvis utspädd AS (20% -50%), vilket sänker koncentrationerna av näringsämnena. PRP är dock mindre vidhäftande och används vanligtvis i sin rena form (100%). Nya litteraturrapporter pekar mest på att PRP ger bättre antiinflammatoriska och sårläkande effekter än AS, främst på grund av dess rika innehåll i antiinflammatoriska cytokiner, tillväxtfaktorer och dess förmåga att dämpa IL-1β-inducerad inflammation16,26. En randomiserad kontrollerad studie utförd av García-Conca et al. har redan funnit att tillämpningen av PRP vid svåra eller måttliga hyposekretoriska torra ögonsjukdomar visar tillfredsställande resultat28. Även om ACS, som en förbättring jämfört med AS, sällan har rapporterats vid inflammatoriska och degenerativa okulära ytsjukdomar, har det använts i stor utsträckning vid behandling av degenerativ artrit och sårläkning inom ortopedi 29,30,31. Den vanligaste ACS har tillverkats och patenterats som ett kommersiellt kit13,32. mACS utformades efter justering av ACS-förberedelseprocessen för att kombinera styrkorna hos både ACS och PRP. mACS kan produceras till en mer ekonomisk kostnad eftersom inga speciella reagens behövs, såsom CrSO 4-belagda glaspärlor eller några patenterade kit, som behövs vid framställning av både ACS och PRP.
Bortsett från den ekonomiska oron gav mACS-ögondropparna också tillfredsställande preliminära resultat i ett ex vivo-experiment och kan vara ett revolutionerande alternativ till de nuvarande, framväxande PRP-ögondropparna. Observera att ACS har visat bättre resultat än de flesta etablerade behandlingar vid inflammatoriska ledsjukdomar både kvalitativt och kvantitativt på grund av dess antiinflammatoriska förmåga och förbättrade endogena reparationsmekanismer17. Även om det hittills inte finns några litteraturbevis för terapeutiska effekter av ACS i oftalmologi, är det rimligt att anta potentialen i dess tillämpning på patienter med hornhinneepiteldefekter på grund av dess antiinflammatoriska mekanism och framgången i ortopedi33. Endast AS jämfördes med mACS i vår ex vivo-studie ; PRP och ACS som produceras via kommersiella kit kan dock också jämföras. Framtida forskning för att analysera serumnivåerna av antiinflammatoriska cytokiner och tillväxtfaktorer i mACS skulle vara användbar för att bekräfta dess likhet med ACS eller PRP och potentiell överlägsenhet mot AS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna tackar Ya-Lan Chien och Chia-Ying Lee för utmärkt teknisk hjälp, och OnLine English Company för den språkliga utgåvan. Denna studie finansierades delvis av Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3L1491).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
- Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
- Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
- Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
- Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
- Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
- Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
- Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
- Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
- Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
- Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
- Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
- Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
- Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
- Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
- Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
- Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
- Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
- Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
- Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
- Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
- Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
- Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
- NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
- Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
- Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
- Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
- Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
- Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
- Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).
