Summary
Dit artikel beschrijft een protocol om het proces te vereenvoudigen en de bereiding van autoloog geconditioneerd serum (ACS) goedkoper te maken. Er zijn geen speciale spuiten of glasparels met een oppervlaktecoating nodig. Bovendien heeft het gemodificeerde ACS (mACS) concurrentievoordelen ten opzichte van conventioneel autoloog serum in de hoornvlieswondgenezing van muriene ogen ex vivo.
Abstract
Van menselijk bloed afgeleide topische therapieën zijn de afgelopen decennia een zegen geweest voor clinici. Autoloog serum (AS) en bloedplaatjesrijk plasma (PRP) zijn verrijkt met epitheliotrope groeifactoren die essentieel zijn bij de genezing van hoornvlieswonden. In tegenstelling tot AS is PRP gebaseerd op een differentieel centrifugatiesysteem, wat meer van bloedplaatjes afgeleide groeifactoren oplevert. Autoloog geconditioneerd serum (ACS) behoudt niet alleen de bereiding van AS en PRP, maar richt zich ook op immuunmodulerende eigenschappen, die belangrijk zijn bij ontstekingsziekten.
Het ontbreken van gestandaardiseerde protocollen en hoge voorbereidingskosten zijn beperkingen voor de klinische toepassing van ACS. Dit video-experiment demonstreert een standaard werkwijze voor het bereiden van gemodificeerde autologe geconditioneerde serum (mACS) oogdruppels. Eerst werd glycerol toegevoegd aan heparinespuiten als de bloedcelstabilisator tijdens hypoxische incubatie. Om de bloedcellen te activeren, werd een incubatie van 4 uur bij 37 °C gestart. Vervolgens werden de bloedmonsters gecentrifugeerd bij 3.500 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na filtratie van het supernatant door een filter van 0,22 μm werden de mACS-oogdruppels volledig voorbereid.
Een voorzichtige try-out van het therapeutische effect van mACS toonde aan dat het concurrentievoordelen kan hebben ten opzichte van conventionele AS in de hoornvlieswondgenezing in ex vivo muizenogen. De AS die in deze studie werd gebruikt, werd opgesteld volgens gepubliceerde studies en de klinische praktijk in ons ziekenhuis. Daarom kan de werkzaamheid van mACS op oculaire oppervlakteziekten in toekomstig onderzoek worden geëvalueerd door middel van in vivo dierstudies en klinische proeven.
Introduction
De therapeutische effecten van autoloog serum (AS) bij droge ogen werden voor het eerst gemeld in de jaren 1980 door Fox et al.1. Er wordt aangenomen dat zowel de smerende eigenschap als de essentiële epitheliotrope biochemische componenten in AS, die natuurlijke tranen nabootsen, de proliferatie van cornea-epitheelcellen ten goede komen. In de afgelopen decennia zijn op basis hiervan verschillende onderzoeken uitgevoerd. Trofische componenten omvatten epidermale groeifactor (EGF), vitamine A, transformerende groeifactor β (TGF-β) en andere cytokines. Interessant is dat het serum rijk is aan TGF-β en vitamine A, waarvan wordt aangenomen dat ze een cruciale rol spelen bij epidermale proliferatie 2,3,4,5. Bovendien hebben verschillende studies bij de behandeling van patiënten met oculaire oppervlakteziekten enkele voordelen van AS-oogdruppels aangetoond in door de patiënt gerapporteerde uitkomsten, andere objectieve droge ogenparameters 6,7 en microscopische bevindingen zoals celdichtheid8. Meta-analyse studies toonden aan dat er enkele voordelen kunnen zijn bij het verbeteren van de syndromen van patiënten met AS-oogdruppelbehandeling, maar langetermijnresultaten en observaties ontbreken nog steeds 9,10.
In tegenstelling tot AS wordt bloedplaatjesrijk plasma (PRP) afgeleid van het toevoegen van een antistollingsmiddel tijdens de bereiding, met verdere differentiële centrifugatie en chemische activering van de bloedplaatjes. In vergelijking met AS zijn tal van chemicaliën en groeifactoren, zoals TGF-β, vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en EGF, aanwezig in PRP. Het is ook toegepast op oculaire oppervlakteziekten met klinische voordelen bij symptoomverlichting11.
Het verband tussen epitheeldefecten en ontsteking is complex. Met name immunopathofysiologie is een ander belangrijk probleem bij oculaire oppervlakteziekten. Pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-1β en IFN-γ, worden verondersteld cruciale mediatoren te zijn in inflammatoire cascades12. Nieuwe wegen van behandeling worden dus geopend op basis van het begrijpen van het immuunmechanisme. Strategieën om dit ontstekingsproces te stoppen, waaronder de productie van interleukine-1 receptorantagonist (IL-1Ra) en andere ontstekingsremmende cytokines, kunnen ook een belangrijke rol spelen bij oculaire oppervlakteziekten13,14,15.
Sinds 1998 wordt Orthokine, een gecommercialiseerd autoloog geconditioneerd serum (ACS), klinisch gebruikt bij orthopedische patiënten die lijden aan artrose (OA), reumatoïde artritis (RA) en spinale aandoeningen13. In vergelijking met AS en PRP zijn behandeling met chemisch gecoate glasparels en hypoxische incubatie om monocyten te activeren de specifieke kenmerken van ACS16. Theoretisch kunnen meer ontstekingsremmende factoren worden uitgescheiden door overlevingsstress aan de cellen toe te voegen, wat resulteert in een hogere concentratie van essentiële immuunmodulerende componenten, waaronder IL-1Ra. De verbeterde therapeutische voordelen van ACS bij artrose, vergeleken met AS, zijn ook gemeld17. Oculaire oppervlakteziekten delen in sommige opzichten vergelijkbare immuunachtergronden met orthopedische ontstekingsziekten. Daarom, op basis van de succesvolle resultaten van van menselijk bloed afgeleide therapie op orthopedisch gebied, kan ACS voordelen hebben ten opzichte van conventionele behandelingen in de klinische praktijk door epitheliotrope en immuunmodulerende eigenschappen. Hoewel ACS op grote schaal is gebruikt bij orthopedische ontstekingsziekten, moeten de klinische toepassingen in de oogheelkunde nog worden onderzocht, wat kan worden belemmerd door de hoge kosten, het gebrek aan literatuurondersteuning en het gebrek aan standaardisatie van het voorbereidingsproces, wat resulteert in diverse prestaties.
In dit videoartikel werd een nieuwe, kosteneffectieve en handige methode gedemonstreerd om de gemodificeerde ACS (mACS) of plasma rijk aan groeifactoren (PRGF) te genereren, waardoor een oogdruppeloplossing ontstaat met een vergelijkbare praktische waarde als gecommercialiseerde ACS'en. De belangrijkste ideeën over het toevoegen van anticoagulantia en het triggeren van de bloedcellen om ontstekingsremmende cytokines af te scheiden door gestreste incubatie werden behouden, maar in tegenstelling tot de chemisch geïnduceerde methoden, zoals die op basis van CrSO 4-gecoate glasparels en commerciële kits, wordt de kritieke stressstatus fysiek geïnduceerd door hypoxische incubatie in deze methode. Bovendien werd glycerol toegevoegd om extra voordelen te bieden, waaronder een toename van de stabiliteit van het membraan van bloedcellen, behoud van een goede osmotische extracellulaire vloeistofdruk18 en een geschikte bron van voedingsstoffen in hypoxische omstandigheden die overbelasting van de cellen voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen aan het begin van het protocolgedeelte. Alle protocollen en procedures werden uitgevoerd volgens de Verklaring van Helsinki en werden beoordeeld en goedgekeurd door de Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Alle vrijwilligers werden geïnformeerd over de aard van deze studie en ondertekenden een geïnformeerd toestemmingsformulier voorafgaand aan hun opname. De verbruiksartikelen die nodig zijn voor de gehele experimentele procedure zijn weergegeven in figuur 1 en figuur 2, evenals in de materiaaltabel.
1. Bereiding van de materialen die nodig zijn om mACS-oogdruppels te produceren
- Bereid 250 ml 10% glyceroloplossing en houd een infusieset van 21 G met vlindervleugels, een spuit van 3 ml zonder naald en zes vacutainerbuizen van 10 ml met heparine 158 USP-eenheden klaar (figuur 1).
- Sluit de bloedafnamenaald van 21 G aan op de spuit van 3 ml en zuig 3 ml 10% glyceroloplossing op in de bereide spuit.
OPMERKING: Alle materialen moeten worden gesteriliseerd voordat de naald wordt ingebracht. - Verdeel de 10% glyceroloplossing achtereenvolgens in de vacutainerbuizen, met ongeveer 0,5 ml 10% glyceroloplossing in elk (figuur 3A).
OPMERKING: Vanwege de negatieve druk in de reageerbuis moet de naald er onmiddellijk na het ingaan uitkomen om 3 ml glyceroloplossing gelijkmatig over de zes reageerbuizen te verdelen. - Steriliseer de huid van de patiënt met 75% alcohol steriele wattenstaafjes. Doorprik de oppervlakkige ader van de bovenste ledematen van de patiënt met de 18 G bloedafnamenaald. Trek in totaal 60-70 ml veneus bloed uit de oppervlakkige ader.
2. Voorbereiding voor mACS oogdruppels
- Injecteer achtereenvolgens 10 ml van het getrokken veneuze bloed in elk van de zes vacutainerbuizen (figuur 3B).
OPMERKING: Deze stap is afhankelijk van de onderdruk van het vacuüm om de buizen te vullen. Om verstoring van bloedcellen en hemolyse te voorkomen, mag u geen positieve druk uitoefenen. - Plaats de zes vacutainerbuizen gedurende 4 uur in de incubator met een constante temperatuur van 37 °C (figuur 3C).
OPMERKING: De hypoxische status wordt gehandhaafd en gestabiliseerd door de resterende negatieve druk in een afgesloten buis die glycerol heeft ontvangen. - Verwijder de buizen na 4 uur uit de incubator en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 3.500 × g .
- Bereid op dit punt de materialen voor mACS-extractie voor, inclusief de gesteriliseerde oogdruppelflessen, een spuit van 3 ml met de naald, een filter van 0,22 μm, een naald van 18 G en een paar steriele handschoenen (figuur 2).
OPMERKING: De operatietafel moet worden afgeveegd met 75% alcohol om een aseptische omgeving te garanderen. Het supernatant is na centrifugeren al een halffabricaat van mACS. - Plaats de zes buizen op het buizenrek en open de doppen na volledige centrifugatie (figuur 3D).
OPMERKING: Steriliteit is niet vereist in deze stap. - Trek steriele handschoenen aan en trek de mACS één voor één uit met een spuit van 3 ml met een naald van 18 G.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u tijdens deze stap niet de onderste bloedcellaag tekent (figuur 3E). - Trek de naald eruit, sluit deze aan op het 0,22 μm filter en sluit de 23 G, 1,5 in bloedafnamenaald met de originele 3 ml spuit aan op de uitlaat hieronder (figuur 3F).
- Duw de naald voorzichtig door het filter van 0,22 μm in de voorbereide steriele oogdruppelflessen (figuur 3G).
- Herhaal de bovenstaande stappen totdat alle mACS is gefilterd en opgeslagen in oogdruppelflessen (figuur 3H).
- Bewaar de mACS oogdruppels bij 4 °C voor onmiddellijk gebruik; bewaren bij -20 °C voor langdurige bewaring.
OPMERKING: Bewaar ze niet langer dan 2 weken bij 4 °C of langer dan 3 maanden bij -20 °C 9,19.
3. Ex vivo wondgenezingsmodel van muriene cornea-epitheel
OPMERKING: Het volgende ex vivo diermodel was gebaseerd op eerdere ervaringen van Hung et al. met mechanische verwondingen van het hoornvliesepitheel20. De volgende stappen moeten onder de microscoop worden uitgevoerd om een goed omschreven en consistente cornea-epitheelwond te creëren.
- Verdoof de C57BL/6 muizen met 3%-4% isofluraan. Steek de huidbiopsie over het centrale hoornvlies van de muizen, waardoor een ondiepe cirkel op het epitheel achterblijft als een uniforme wondrand.
OPMERKING: Wees voorzichtig om oogbolbreuk te voorkomen. - Debride het cornea-epitheel binnen het bevestigde gebied tot aan de Bowman's laag, met een corneale roestringverwijderaar uitgerust met een 0,5 mm braam.
- Om het ex vivo diermodel van de mechanische hoornvlieswond vast te stellen, oogst je de oogbol en bereid je de cultuur goed voor.
- Euthanaseer de muizen eerst; Druk vervolgens voorzichtig op de superieure en inferieure orbitale randen van de muizen, breng de punt van de tang over de retrobulbaire ruimte en uit de oogbol en houd deze bij de tang.
- Knip de oogzenuw en het periorbitale zachte weefsel af met een hoornvliesschaar om de oogbol perfect te isoleren.
- Maak een bord met 96 putten met gesmolten was erin. Maak snel een rond gat met behulp van de uiteinden van de tang en wacht vervolgens op stolling.
- Bereid de te testen media voor: 0,5% mACS, 0,5% AS ter vergelijking, normale zoutoplossing als negatieve controle en Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM).
OPMERKING: mACS wordt verkregen met behulp van het hierboven genoemde protocol. - Voor de ex vivo cultuur plaats je de geoogste oogbol op de voorbereide 96-well plaat. Voeg 200 μL van elk medium toe aan de 96-well plaat.
- Plaats de 96-well kweekplaat in de incubator bij 37 °C met 5% CO2. Zorg ervoor dat de cultuurmedia elke 24 uur worden vervangen.
- Om het sequentiële wondgenezingseffect te bevestigen, controleert u het epitheliale wondgebied elke 8 uur onder de microscoop door fluoresceïnekleuring.
- Los de fluoresceïne op het fluoresceïnepapier op met een normale zoutoplossing.
- Laat de fluoresceïnekleurstof op het centrale hoornvlies van de muizen vallen en observeer en documenteer het vervolgens onder een microscoop. Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 4.
OPMERKING: Eén druppel (ongeveer 0,05 ml) fluoresceïnekleurstof is voldoende voor de waarneming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 en figuur 2 tonen de materialen die nodig zijn voor het experiment en figuur 3 toont de opeenvolgende stappen en de succesvolle tussenproducten tijdens de bereiding van mACS. Eerst werd 0,5 ml 10% glyceroloplossing toegevoegd aan elke steriele reageerbuis van 10 ml (figuur 3A). Vervolgens werd 60-70 ml veneus bloed van de patiënt verkregen en 10 ml bloed in elke buis geïnjecteerd (figuur 3B). Het bloed van de patiënt moet vóór het preparaat worden onderworpen aan grondig, regelmatig laboratoriumonderzoek om ervoor te zorgen dat de kwaliteit van het bloed op peil is. Het meest voorkomende bloedproduct van lage kwaliteit is te wijten aan dyslipidemie, wat resulteert in een troebele bovenste laag serum na centrifugatie die moeilijk te verwijderen is; verdere bereiding van oogdruppels kan niet worden voortgezet (figuur 5A).
Vervolgens wordt de verzegelde reageerbuis gedurende 4 uur bij 37 °C in een incubator geplaatst (figuur 3C). Na incubatie en centrifugatie kon het monster worden gescheiden in een bovenste laag met het voorlopige product van mACS en een onderste bloedcellaag (figuur 3D). De bovenste laag vloeistof werd vervolgens verzameld. Aseptische technieken zijn hierna essentieel. Omdat het serum een zeer voedzame kweekomgeving is voor micro-organismen, moet elk oppervlak dat in contact komt met de naald eerst worden gedesinfecteerd met 75% alcohol en moeten steriele handschoenen worden gebruikt tijdens het proces. Belangrijk is dat verstoring van de bloedcellen uit de onderste laag moet worden vermeden bij het verwijderen van het supernatant (figuur 3E).
Bij deze stap wordt verwacht dat het supernatant helder of lichtgeel is. Als echter een lichte rode kleur wordt gezien, kan hemolyse zijn opgetreden en is het preparaat mogelijk niet geschikt voor de volgende stappen (figuur 5B). Het verzamelde serum kan opnieuw worden gecentrifugeerd om ervoor te zorgen dat het supernatant vrij is van rode bloedcellen. Het serum werd door een filter van 0,22 μm in een steriele oogdruppelfles gefilterd (figuren 3F,G). Het eindproduct, mACS-oogdruppels, werd vervolgens zo snel mogelijk gekoeld of ingevroren, afhankelijk van het doel (figuur 3H). De oogdruppels konden niet te lang bewaard worden vanwege hun rijkdom aan labiele voedingsstoffen en het gebrek aan conserveermiddelen.
In het ex vivo oppervlaktegenezingsmodel vertoonde de mACS-oogdruppel een superieur resultaat bij hoornvlieswondgenezing in vergelijking met de AS-oogdruppel. Het oogsten van de oogbollen van C57BL / 6-muizen werd gedaan na het creëren van een concentrische hoornvlieswond door fysieke slijtage onder de microscoop. Vervolgens werden de geofferde muizenogen gekweekt in vier verschillende media, waaronder pure normale zoutoplossing, DMEM, 0,5% AS en 0,5% mACS.
Het AS-medium dat hier wordt gebruikt, is bereid op basis van literatuur21 en de klinische praktijk in Chang Gung Memorial Hospital Linkou. Veneus bloed, 40 ml in totaal, werd na huidsterilisatie door vrijwilligers in vacutainerbuizen getrokken. Er werd geen antistollingsmiddel aan de buisjes toegevoegd. Het bloed werd vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur opgeslagen om volledige stolling te garanderen, gevolgd door centrifugatie bij 3.500 × g gedurende 10 minuten. Na centrifugatie bezette de zuivere AS de bovenste laag van de buizen, die door BSS (steriele irrigerende oplossing) werd verdund tot 0,5% in dit ex vivo diermodel.
Hoornvlieswonden werden achtereenvolgens waargenomen op zes verschillende tijdstippen, namelijk 0, 8, 16, 24, 32 en 48 uur. De voorlopige resultaten toonden aan dat de hoornvlieswonden na 16 uur sneller genazen onder de 0,5% mACS-oogdruppel dan de andere groepen. Na 24 uur hadden de 0,5% AS- en DMEM-groepen vergelijkbare therapeutische effecten met de 0,5% mACS-oogdruppel. Genezing van de hoornvlieswonden, bijna volledig herstel, werd waargenomen na 32 uur, behalve voor de normale zoutgroep (figuur 4).
Figuur 1: Materialen die nodig zijn voor het toevoegen van 10% glyceroloplossing in de buizen . (A) 21 G infusieset met vlindervleugels. (B) 250 ml 10% glyceroloplossing. (C) Zes vacutainerbuizen van 10 ml die heparine 158 USP-eenheden bevatten. (D) 3,0 ml spuit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De materialen voor extractie en filtratie van het supernatant van het bloedmonster . (A) Een filter van 0,22 μm. (B) Een 5 ml gesteriliseerde oogdruppelfles. (C) Een paar steriele handschoenen. (D) Een spuit van 3 ml met de naald van 23 G. E) Een spuit van 20 ml. F) naalden van 18 G. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Procedures voor bloedcentrifugatie en voorbereiding voor de productie van gemodificeerde autologe geconditioneerde serumoogdruppels . (A) 0,5 ml 10% glyceroloplossing werd toegevoegd aan elke reageerbuis. (B) Het bloedmonster dat bij de patiënt werd afgenomen, werd gelijkelijk verdeeld in zes reageerbuizen (slechts één op de afbeelding). (C) Verschijning van de reageerbuis na plaatsing in een couveuse van 37 °C gedurende 4 uur. (D) Het serum en de bloedcellagen na centrifugering. (E) Het residu na het opzuigen van het supernatant. Men moet voorzichtig zijn om de onderste bloedcellaag niet op te zuigen. (F) Het supernatant wordt opgevangen in de spuit van 3 ml en er worden een filter van 0,22 μm en een naald van 23 g onder ingebracht. (G) De naald wordt voorzichtig in de steriele oogdruppelfles geduwd. H) Eindproduct van de gemodificeerde ACS-oogdruppels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Sequentiële veranderingen van hoornvlieswonden (groene gebieden in de figuren na fluoresceïnekleuring) in murine ogen in vier verschillende kweekmedia in de loop van de tijd. Er werd geen significant verschil waargenomen in de zoutoplossingsgroep, terwijl wondgenezing (pijlen) in de loop van de tijd werd waargenomen in de DMEM-, 0,5% AS- en 0,5% mACS-groepen. In de 0,5% mACS-groep was de wondgenezing (pijlen) significant completer na 16 uur dan die behandeld met AS en DMEM. Na 24 uur vertoonden de DMEM-, 0,5% mACS- en 0,5% AS-groepen verdere helende effecten (pijlen), vooral in de mACS-groep. Bijna volledig herstel werd waargenomen na 32 uur voor alle groepen, behalve voor de zoutoplossingsgroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van slechte bloedproducten na centrifugatie . (A) Dyslipidemie. De meest voorkomende defecte producten zijn te wijten aan obesitas of diabetes mellitus, omdat het bovenste serum veel vet en cholesterol bevat. b) hemolyse. Dit is ook een veel voorkomend suboptimaal product. De belangrijkste reden kan worden toegeschreven aan het gebruik van naalden met een kleine boring voor bloedafname of het gebruik van ongepaste externe kracht bij het injecteren van bloedproducten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie wordt een protocol voor de bereiding van mACS beschreven en wordt het voordeel van mACS oogdruppels bij de wondgenezing van diermodellen verder aangetoond. De cruciale wijziging van dit mACS-protocol is de toevoeging van ongeveer 0,5 ml 10% glyceroloplossing in elke reageerbuis, die geschikte hypoxische omstandigheden creëert tijdens de incubatie van 4 uur bij 37 °C. Deze instelling voorziet de AS van de juiste stress en zet cellen ertoe aan om de nodige groeifactoren af te scheiden die de wondgenezing helpen. Het 0,22 μm-filter kan helpen de macromoleculaire eiwitten, bloedcellen en onzuiverheden te elimineren, waardoor het eindproduct zuiver en minder klevend wordt.
Het bloed wordt gedurende 4 uur bij 37 °C geïncubeerd en verdere centrifugatie en filtratie worden uitgevoerd. Strikte aandacht voor steriliteit tijdens de bereiding en opslag van de eindproducten op een juiste temperatuur is ook cruciaal. Het hoge gehalte aan voedingsstoffen in de uiteindelijke serumproducten is een uitstekend kweekmedium voor de bacteriën. Onjuiste opslag of verontreiniging tijdens de bereiding kan de oogdruppels dus bederven. Besmette mACS kan ziekten veroorzaken zoals conjunctivitis of infectieuze keratitis.
De kwaliteit van het bloed van de patiënt is ook belangrijk; daarom zijn laboratoriumtests nodig vóór de bereiding van mACS om de veiligheid van bloedproducten te waarborgen. Tijdens het afnemen en bij het bedienen van de bloedmonsters van de patiënt, moeten operators zich bewust zijn van hemolyse. Elke druk tijdens de bereiding kan gemakkelijk hemolyse veroorzaken; Daarom moet de spuit langzaam worden getrokken en geduwd tijdens het bloedafname. Hypoxie moet ook worden gecontroleerd om hoge concentraties groeifactoren en ontstekingsremmende cytokines te verkrijgen. Op basis van ervaring en eerder gepubliceerde studies22,23 is de toepassing van een hypoxische incubatie van 4 uur de ultieme setting. Glycerol zou meer geschikte hypoxische stress aan de cel kunnen bieden, vanwege het stabilisatie-effect en de juiste osmotische extracellulaire vloeistofdruk die het kan bieden18. De optimale concentratie van glycerol en hoe deze correleert met de cytokineconcentratie moet echter nog steeds worden gecontroleerd. In de toekomst zullen in vivo dierstudies naar wondgenezing en een grootschaliger gerandomiseerd controleonderzoek gerechtvaardigd zijn om de werkzaamheid ervan te bevestigen.
Tot nu toe heeft het onderzoek zich voornamelijk gericht op het aanbrengen van serumproducten op oogoppervlakaandoeningen met behulp van traditionele AS en de opkomende PRP-oogdruppels24,25,26,27. Traditionele AS zonder antistollingsmiddel en zonder filter tijdens de bereiding is amber in zijn pure vorm, maar maakt patiënten vaak ongemakkelijk vanwege de kleefkracht. Als gevolg hiervan wordt meestal verdund AS (20% -50%) gebruikt, wat de concentraties van de voedingsstoffen verlaagt. PRP is echter minder klevend en wordt meestal in zijn pure vorm gebruikt (100%). Recente literatuurrapporten wijzen er meestal op dat PRP betere ontstekingsremmende en wondgenezende effecten biedt dan AS, voornamelijk vanwege het rijke gehalte aan ontstekingsremmende cytokines, groeifactoren en het vermogen om IL-1β-geïnduceerde ontsteking te verzwakken16,26. Een gerandomiseerde gecontroleerde studie uitgevoerd door García-Conca et al. heeft al aangetoond dat de toepassing van PRP bij ernstige of matige hyposecretoire droge ogen bevredigende resultaten laat zien28. Hoewel ACS, als een verbetering ten opzichte van AS, zelden is gemeld bij inflammatoire en degeneratieve oogoppervlakaandoeningen, is het op grote schaal gebruikt bij de behandeling van degeneratieve artritis en wondgenezing in orthopedie 29,30,31. De meest voorkomende ACS is vervaardigd en gepatenteerd als een commerciële kit 13,32. mACS is ontworpen na het aanpassen van het proces van ACS-voorbereiding om de sterke punten van zowel ACS als PRP te combineren. mACS kan tegen een goedkopere prijs worden geproduceerd omdat er geen speciale reagentia nodig zijn, zoals CrSO4-gecoate glasparels of gepatenteerde kits, die nodig zijn bij de bereiding van zowel ACS als PRP.
Afgezien van de economische zorg, leverden de mACS-oogdruppels ook bevredigende voorlopige resultaten op in een ex vivo experiment en kunnen ze een revolutionair alternatief zijn voor de huidige, opkomende PRP-oogdruppels. Acs heeft betere resultaten laten zien dan de meeste gevestigde behandelingen bij inflammatoire gewrichtsaandoeningen, zowel kwalitatief als kwantitatief, vanwege het ontstekingsremmende vermogen en de verbeterde endogene herstelmechanismen17. Hoewel er tot op heden geen literatuurbewijs is voor therapeutische effecten van ACS in de oogheelkunde, is het redelijk om het potentieel aan te nemen bij de toepassing ervan op patiënten met cornea-epitheeldefecten vanwege het ontstekingsremmende mechanisme en het succes in de orthopedie33. Alleen AS werd vergeleken met de mACS in onze ex vivo studie; PRP en ACS geproduceerd via commerciële kits kunnen echter ook worden vergeleken. Toekomstig onderzoek bij het analyseren van de serumspiegels van ontstekingsremmende cytokines en groeifactoren in mACS zou nuttig zijn bij het bevestigen van de gelijkenis met ACS of PRP en potentiële superioriteit met AS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Ya-Lan Chien en Chia-Ying Lee voor de uitstekende technische assistentie, en OnLine English company voor de taalkundige editie. Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3L1491).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well culture plate | Merck KGaA, Germany | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| BD 10.0 mL vacutainer tubes containing heparin 158 USP units | Becton,Dickinson and Company, US | 367880 | At least 6 tubes, necessary to collect blood for subsequent experiments and to avoid blood agglutination |
| BD 21 G butterfly-winged infusion set | Becton,Dickinson and Company, US | 367281 | For even distribution of glycerol solution |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | for mouse model |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5811000428 | 3,500 x g for 10 min |
| Cheng Yi 10.0 mL sterilized eye dropper bottle | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Must be sterile and as the storage container for the final product |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Dulbecco's modified minimal essential medium | Merck KGaA, Germany | D6429 | |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Incubator | Firstek, Taiwan | S300S | 37 °C for 4 h |
| Kanam sterile gloves | Kanam Latex Industries, India | EN455 | For aseptic operation |
| Merck 0.22 µm filter | Merck KGaA, Germany | PR05359 | At least 2 filters for mACS filtration |
| Nang Kuang 250 mL 10% glycerol solution | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | To offer suitable membrane stabilization effect and extracellular osmotic pressure for blood cells |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Terumo 18 G needle | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | 3.0 mL syringe with 18 G needle to extract the supernatant after centrifugation |
| Terumo 20.0 mL syringe | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Could be used to collect serum after initial centrifugation and use it for secondary centrifugation. |
| Terumo 3.0 mL syringe with the 23 G needle | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | 3.0 mL syringe is used to extract the supernatant after centrifugation. Then connect the filter and the 23 G needle for injection into the eye drop bottles. |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 |
References
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).
- Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. Serum growth factor analysis in dry eye syndrome. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).
- Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis. Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).
- Tsubota, K., et al. Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome. The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).
- Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome. Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).
- Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).
- Jirsova, K., et al. The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment. Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).
- Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. Autologous serum eye drops for dry eye. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).
- Wang, L., et al. Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).
- Soni, N. G., Jeng, B. H. Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases. The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).
- Solomon, A., et al. anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).
- Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction. Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).
- Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. Emerging therapeutics for ocular surface disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).
- Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
- Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α. Tissue and Cell. 73, 101646 (2021).
- Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects. Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).
- Gull, M., Pasek, M. A. The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life. Catalysts. 11 (1), 86 (2021).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Hung, K. H., Yeh, L. K. Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (182), e63217 (2022).
- Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).
- Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114 (2010).
- Antebi, B., et al. Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265 (2018).
- Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects. BioMed Research International. 2022, 6600788 (2022).
- Diaz-Valle, D., et al. Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea. Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).
- Metheetrairut, C., et al. Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease. Scientific Reports. 12 (1), 8906 (2022).
- NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects. Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).
- Garcia-Conca, V., et al. Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma. Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).
- Gholian, S., et al. Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial. Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).
- Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review. Future Science OA. 8 (2), 776 (2022).
- Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review. Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).
- Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).
- Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study. Cureus. 14 (4), e24500 (2022).
