Summary

إعداد مصفوفات 3D Decellularized من العضلات الهيكلية للفأر الجنيني لزراعة الخلايا

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

في هذا العمل ، تم تحسين بروتوكول إزالة الخلايا للحصول على مصفوفات منزوعة الخلايا لعضلات الهيكل العظمي للفأر الجنيني. يمكن للخلايا العضلية C2C12 استعمار هذه المصفوفات والتكاثر والتمايز. يمكن استخدام هذا النموذج في المختبر لدراسة سلوك الخلية في سياق أمراض العضلات الهيكلية مثل ضمور العضلات.

Abstract

تلعب المصفوفة خارج الخلية (ECM) دورا مهما في توفير الدعم الهيكلي للخلايا ونقل الإشارات المهمة لمختلف العمليات الخلوية. تبالغ نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) في تبسيط التفاعلات المعقدة بين الخلايا و ECM ، حيث أن عدم وجود دعم ثلاثي الأبعاد (3D) كامل يمكن أن يغير سلوك الخلية ، مما يجعلها غير كافية لفهم العمليات في الجسم الحي . تعد أوجه القصور في تكوين ECM وتفاعلات الخلايا ECM من المساهمين المهمين في مجموعة متنوعة من الأمراض المختلفة.

أحد الأمثلة على ذلك هو الحثل العضلي الخلقي LAMA2 (LAMA2-CMD) ، حيث يمكن أن يؤدي غياب أو تقليل اللامينين الوظيفي 211 و 221 إلى نقص شديد في التوتر ، يمكن اكتشافه عند الولادة أو بعدها بفترة وجيزة. يشير العمل السابق باستخدام نموذج فأر للمرض إلى أن ظهوره يحدث أثناء تكوين عضل الجنين. تهدف الدراسة الحالية إلى تطوير نموذج 3D في المختبر يسمح بدراسة التفاعلات بين خلايا العضلات وعضلة الجنين ECM ، ومحاكاة البيئة المكروية الأصلية. يستخدم هذا البروتوكول عضلات الظهر العميقة التي تم تشريحها من أجنة الفئران E18.5 ، ومعالجتها بمخزن مؤقت منخفض التوتر ، ومنظف أنيوني ، و DNase. احتفظت المصفوفات الناتجة عن إزالة الخلايا (dECMs) بجميع بروتينات ECM التي تم اختبارها (laminin α2 ، و laminins الكلي ، و fibronectin ، والكولاجين I ، والكولاجين IV) مقارنة بالأنسجة الأصلية.

عندما تم زرع الخلايا العضلية C2C12 فوق هذه dECMs ، اخترقت واستعمرت dECMs ، مما دعم انتشارها وتمايزها. علاوة على ذلك ، أنتجت خلايا C2C12 بروتينات ECM ، مما ساهم في إعادة تشكيل مكانتها داخل dECMs. يوفر إنشاء هذه المنصة في المختبر نهجا واعدا جديدا لكشف العمليات التي ينطوي عليها ظهور LAMA2-CMD ، ولديه القدرة على التكيف مع أمراض العضلات الهيكلية الأخرى حيث تساهم أوجه القصور في الاتصال بين ECM وخلايا العضلات الهيكلية في تطور المرض.

Introduction

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي مكون رئيسي للأنسجة ، تمثل مكونها غير الخلوي. لا يوفر هذا الهيكل ثلاثي الأبعاد (3D) الدعم المادي للخلايا فحسب ، بل يلعب أيضا دورا حاسما في العمليات الكيميائية الحيوية التي ينطوي عليها تطور الكائناتالحية 1. يحدث تكوين ECM خاص بالأنسجة أثناء التطور ، نتيجة للتفاعلات المعقدة بين الخلايا ومنافذها ، والتي تتأثر بمحفزات مختلفة داخل وخارج الخلية. ECM هو هيكل ديناميكي للغاية يخضع لإعادة ترتيب كيميائية وميكانيكية بطريقة زمنية مكانية ويؤثر بشكل مباشر على مصير الخلية2. واحدة من أبرز خصائص ECM هي تنوعها الوظيفي ، حيث يعرض كل نسيج ECM مزيجا فريدا من الجزيئات التي توفر طوبولوجيا وخصائص مختلفة مصممة خصيصا للخلايا التي تحتوي عليها1.

تعد إشارات ودعم ECM أمرا بالغ الأهمية للتطور والتوازن ، وعندما تتعطل يمكن أن تؤدي إلى حالات مرضية متعددة 3,4. أحد الأمثلة على ذلك هو الحثل الخلقي الناقص LAMA2 (LAMA2-CMD) ، وهو الشكل الأكثر شيوعا للضمور العضلي الخلقي. يشفر جين LAMA2 لسلسلة laminin α2 ، الموجودة في laminin 211 و laminin 221 ، وعندما يتحور يمكن أن يؤدي إلى LAMA2-CMD 5. Laminin 211 هو الشكل المتماثل الرئيسي الموجود في الغشاء القاعدي المحيط بألياف العضلات الهيكلية. عندما يكون laminin 211 غير طبيعي أو غائب ، يتم تعطيل الرابط بين الغشاء القاعدي وخلايا العضلات ، مما يؤدي إلى ظهور المرض6. يظهر المرضى الذين يعانون من LAMA2-CMD نمطا ظاهريا خفيفا إلى شديد اعتمادا على نوع الطفرة في جين LAMA2.

عندما تتأثر وظيفة بروتين laminin α2 ، يمكن للمرضى تجربة نقص التوتر العضلي الشديد عند الولادة وتطوير التهاب مزمن وتليف وضمور العضلات ، مما يؤدي إلى انخفاض متوسط العمر المتوقع. حتى الآن ، لم يتم تطوير أي علاجات مستهدفة وتقتصر الأساليب العلاجية على تخفيف أعراض المرض7. لذلك ، فإن فهم الآليات الجزيئية الأساسية التي ينطوي عليها ظهور هذا المرض أمر بالغ الأهمية لتطوير الاستراتيجيات العلاجية المناسبة 6,8. يشير العمل السابق باستخدام فأر dyW 9 ، وهو نموذج ل LAMA2-CMD ، إلى أن ظهور المرض يبدأ في الرحم ، وتحديدا أثناء تكوين عضل الجنين10. إن الفهم الأفضل لكيفية ظهور عيب تكوين عضل الجنين سيكون بمثابة تغيير لقواعد اللعبة في توليد مناهج علاجية جديدة ل LAMA2-CMD.

توفر الأنظمة في المختبر بيئة خاضعة للرقابة لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM ، لكن نماذج ثقافة 2D تفتقر إلى تعقيد الأنسجة الأصلية. ينتج عن إزالة الخلايا من الأنسجة سقالات ECM غير الخلوية الخاصة بالأنسجة ومرحلة النمو والتي تحاكي بدقة أكبر البيئة الدقيقة للخلايا الطبيعية مقارنة بنماذج 2D والسقالات الهندسية / الاصطناعية. المصفوفات منزوعة الخلايا (dECMs) لديها القدرة على الحفاظ على الإشارات الجزيئية والميكانيكية للأنسجة المضيفة ، مما يجعلها نماذج بديلة أفضل لفهم العمليات في الجسم الحي 11.

هناك العديد من التقنيات والكواشف والظروف التي يمكن استخدامها لإزالة الخلايا12,13. في هذه الدراسة ، تم تكييف بروتوكول إزالة الخلايا لقلب فأر الجنين ، الذي وصفه Silva et al.14،15 ، مع العضلات الهيكلية للفأر الجنيني ووجد أنه يحتفظ بجميع مكونات ECM المختبرة (laminin α2 ، الصفيحات الكلية ، الفبرونيكتين ، الكولاجين I ، والكولاجين IV). يتضمن البروتوكول ثلاث خطوات: تحلل الخلايا عن طريق الصدمة التناضحية (العازلة منخفضة التوتر) ، وانحلال غشاء البلازما وتفكك البروتين (0.05٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم [SDS]) ، والتدمير الأنزيمي للحمض النووي (علاج DNase). على حد علمنا ، هذا هو أول بروتوكول تم إنشاؤه لإزالة الخلايا من العضلات الهيكلية الجنينية للفأر.

لاستخدام هذا النظام ثلاثي الأبعاد في المختبر لدراسة LAMA2-CMD ، من الضروري الحفاظ على سلسلة laminin α2 بعد إزالة الخلايا. لذلك ، تم تنفيذ بروتوكول التحسين حيث تم اختبار المنظفات المختلفة (SDS و Triton X-100) والتركيزات (0.02٪ و 0.05٪ و 0.1٪ و 0.2٪ و 0.5٪) (البيانات غير معروضة). تم العثور على الخيار الأمثل لإزالة الخلايا والحفاظ على بروتين laminin α2 ليكون 0.05 ٪ SDS. تم استخدام خلايا C2C12 ، وهي خط خلايا عضلية راسخة16,17 ، لزرع dECMs. تغزو هذه الخلايا dECM ، وتتكاثر ، وتتمايز داخل هذه السقالات ، وتوليف بروتينات ECM جديدة. يوفر الإنتاج الناجح لهذا النموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر نهجا جديدا لفهم العمليات الجزيئية والخلوية التي ينطوي عليها تكوين عضل الجنين ، وبداية LAMA2-CMD ، ويمكن أن يمتد إلى أمراض العضلات الأخرى حيث يتم تعطيل الاتصال بين ECM وخلايا العضلات الهيكلية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع المنهجيات الموصوفة من قبل لجنة رعاية الحيوان (ORBEA) التابعة لكلية العلوم ، جامعة لشبونة ، و Direção Geral de Veterinária (DGAV ؛ المرجع 0421/000/000/2022) ، وهي متوافقة مع التوجيه الأوروبي 2010/63 / EU. 1. إعداد المخازن المؤقتة لإزالة الخلايا والكواشف ملاحظة: …

Representative Results

الهدف من بروتوكول إزالة الخلايا هو إنتاج dECMs التي تشبه إلى حد كبير تكوين الأنسجة الأصلية. لتحديد فعالية عملية إزالة الخلايا ، تم استخدام طرق مختلفة ، بما في ذلك فحص مورفولوجيا الأنسجة ، وقياس مستويات الحمض النووي ، وتلطيخ F-actin ، وتحليل مكونات ECM الرئيسية باستخدام الكيمياء الهيستولوجية الم?…

Discussion

ECM عبارة عن شبكة معقدة من الجزيئات الكبيرة الموجودة في جميع الأنسجة وتلعب دورا حاسما في تنظيم سلوك الخلية ووظيفتها2. يعمل ECM بمثابة سقالة مادية للخلايا للالتصاق بها ويوفر إشارات تعدل بنشاط العمليات الخلوية مثل الانتشار والحركة والتمايز وموت الخلايا المبرمج. وبالتالي ، فإن ال?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل الجمعية الفرنسية لمكافحة الاعتلال العضلي (AFM-Téléthon ؛ عقد رقم 23049) ، ومشروع MATRIHEALTH ، وتمويل وحدة cE3c UIDB / 00329/2020. نود أن نشكر المتبرع هنريك ميريليس الذي اختار دعم مشروع MATRIHEALTH. استفاد هذا العمل من البنى التحتية لمرفق الفحص المجهري بكلية العلوم ، وهو عقدة تابعة للمنصة البرتغالية للتصوير الحيوي (المرجع PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) ، ونشكر لويس ماركيز على مساعدته في الحصول على الصور ومعالجتها. أخيرا ، نشكر مارتا بالما على الدعم الفني وفريق البحث لدينا على مساهماتهم السخية.

Materials

12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Merck D8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile Abdos Labware P21024
Bovine Serum Albumin, Fraction V NZYtech MB04601
BX60 fluorescence microscope Olympus
Cryostat CM1860 UV Leica
Dithiothreitol ThermoFisher R0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate Biowest L0103-500
DNase I PanReac AppliChem A3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck 108418
Fetal bovine serum Biowest S1560-500
Fine tip transfer pipette ThermoFisher 15387823
Goat serum Biowest S2000-100
Hera Guard Flow Cabinet Heraeus
Heracell 150 CO2 Incubator Thermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein Standard Invitrogen
Horse Serum, New Zealand origin Gibco 16050122
HRP-α- Rabbit IgG abcam ab205718
HRP-α- Rat IgG abcam ab205720
HRP-α-Mouse IgG abcam ab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl Green Sigma-Aldrich 67060
MM400 Tissue Lyser Retsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar 043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSP GTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci. A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) Greiner Bio-One 628161
Qubit dsDNA HS kit Thermo Scientific Q32851
Qubit™ 3 Fluorometer Invitrogen 15387293
S6E Zoom Stereo microscope Leica
Sodium Dodecyl Sulfate Merck 11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slides Thermo Scientific 631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 15626144
TCS SPE confocal microscope Leica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% VWR Chemicals 28811.295
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) GRiSP GTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution) ThermoFisher 3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) Advansta L-08024-001
α-Collagen I abcam ab21286
α-Collagen IV Millipore AB756P
α-Collagen IV Santa Cruz Biotechnology sc-398655
α-Fibronectin Sigma F-3648
α-Laminin α2 Sigma L-0663
α-MHC D.S.H.B. MF20
α-Mouse Alexa 488 Molecular Probes A11017
α-Mouse Alexa 568 Molecular Probes A11019
α-pan-Laminin Sigma L- 9393
α-phospho-histone 3 Merk Millipore 06-570
α-Rabbit Alexa 568 Molecular Probes A21069
α-Rabbit Alexa 488 Molecular Probes A11070
α-Rat Alexa 488 Molecular Probes A11006

References

  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

Play Video

Citer Cet Article
Gameiro dos Santos, P., Soares, A. R., Thorsteinsdóttir, S., Rodrigues, G. Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture. J. Vis. Exp. (193), e65069, doi:10.3791/65069 (2023).

View Video