Voorbereiding van 3D gedecellulariseerde matrices van foetale muis skeletspieren voor celkweek
Summary
In dit werk werd een decellularisatieprotocol geoptimaliseerd om gedecellulariseerde matrices van foetale skeletspieren van muizen te verkrijgen. C2C12-myoblasten kunnen deze matrices koloniseren, prolifereren en differentiëren. Dit in vitro model kan worden gebruikt om celgedrag te bestuderen in de context van skeletspierziekten zoals spierdystrofieën.
Abstract
De extracellulaire matrix (ECM) speelt een cruciale rol bij het bieden van structurele ondersteuning voor cellen en het overbrengen van signalen die belangrijk zijn voor verschillende cellulaire processen. Tweedimensionale (2D) celcultuurmodellen vereenvoudigen de complexe interacties tussen cellen en de ECU te veel, omdat het ontbreken van een volledige driedimensionale (3D) ondersteuning het celgedrag kan veranderen, waardoor ze ontoereikend zijn voor het begrijpen van in vivo processen. Tekortkomingen in de samenstelling van ECM en cel-ECM interacties zijn belangrijke bijdragen aan een verscheidenheid van verschillende ziekten.
Een voorbeeld is LAMA2-congenitale spierdystrofie (LAMA2-CMD), waarbij de afwezigheid of vermindering van functionele laminine 211 en 221 kan leiden tot ernstige hypotonie, detecteerbaar bij of kort na de geboorte. Eerder werk met behulp van een muismodel van de ziekte suggereert dat het begin ervan optreedt tijdens foetale myogenese. De huidige studie was gericht op het ontwikkelen van een 3D in vitro model dat de studie van de interacties tussen spiercellen en de foetale spier-ECM mogelijk maakt, waarbij de inheemse micro-omgeving wordt nagebootst. Dit protocol maakt gebruik van diepe rugspieren ontleed van E18.5 muizenfoetussen, behandeld met een hypotone buffer, een anionisch reinigingsmiddel en DNase. De resulterende gedecellulariseerde matrices (dECM’s) behielden alle geteste ECM-eiwitten (laminine α2, totale laminines, fibronectine, collageen I en collageen IV) in vergelijking met het inheemse weefsel.
Toen C2C12-myoblasten bovenop deze dECM’s werden gezaaid, drongen ze de dECM’s binnen en koloniseerden ze, wat hun proliferatie en differentiatie ondersteunde. Bovendien produceerden de C2C12-cellen ECM-eiwitten, wat bijdroeg aan de remodellering van hun niche binnen de dECM’s. De oprichting van dit in vitro platform biedt een nieuwe veelbelovende aanpak om de processen te ontrafelen die betrokken zijn bij het ontstaan van LAMA2-CMD, en heeft het potentieel om te worden aangepast aan andere skeletspierziekten waarbij tekortkomingen in de communicatie tussen de ECM en skeletspiercellen bijdragen aan de progressie van de ziekte.
Introduction
De extracellulaire matrix (ECM) is een belangrijk bestanddeel van weefsels, die hun niet-cellulaire component vertegenwoordigen. Deze driedimensionale (3D) structuur biedt niet alleen fysieke ondersteuning voor cellen, maar speelt ook een cruciale rol in de biochemische processen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van organismen1. De vorming van een weefselspecifieke ECM vindt plaats tijdens de ontwikkeling, als gevolg van de complexe interacties tussen cellen en hun niches, beïnvloed door verschillende intra- en extracellulaire stimuli. De ECM is een zeer dynamische structuur die chemische en mechanische herschikkingen ondergaat op een temporeel-ruimtelijke manier en direct van invloed is op het lot van de cel2. Een van de meest opvallende kenmerken van de ECM is de functionele diversiteit, omdat elke weefsel-ECM een unieke combinatie van moleculen vertoont die verschillende topologieën en eigenschappen bieden die zijn afgestemd op de cellen die het bevat1.
ECM-signalering en -ondersteuning zijn cruciaal voor ontwikkeling en homeostase en kunnen bij verstoring leiden tot meerdere pathologische aandoeningen 3,4. Een voorbeeld is LAMA2-deficiënte congenitale dystrofie (LAMA2-CMD), de meest voorkomende vorm van congenitale spierdystrofie. Het LAMA2-gen codeert voor de laminine α2-keten, die aanwezig is in laminine 211 en laminine 221, en wanneer gemuteerd kan leiden tot LAMA2-CMD 5. Laminine 211 is de belangrijkste isovorm die wordt aangetroffen in het keldermembraan rond skeletspiervezels. Wanneer laminine 211 abnormaal of afwezig is, wordt de verbinding tussen het keldermembraan en spiercellen verstoord, wat leidt tot het begin van de ziekte6. Patiënten met LAMA2-CMD vertonen een mild tot ernstig fenotype, afhankelijk van het type mutatie in het LAMA2-gen.
Wanneer de functie van het laminine α2-eiwit wordt beïnvloed, kunnen patiënten bij de geboorte ernstige spierhypotonie ervaren en chronische ontsteking, fibrose en spieratrofie ontwikkelen, wat leidt tot een verminderde levensverwachting. Tot op heden zijn er geen gerichte behandelingen ontwikkeld en zijn therapeutische benaderingen beperkt tot het verlichten van de symptomen van de ziekte7. Daarom is het begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij het ontstaan van deze ziekte cruciaal voor het ontwikkelen van geschikte therapeutische strategieën 6,8. Eerder werk met behulp van de dyW-muis 9, een model voor LAMA2-CMD, suggereert dat het begin van de ziekte begint in utero, met name tijdens foetale myogenese10. Een beter begrip van hoe het foetale myogenesedefect ontstaat, zou een game changer zijn bij het genereren van nieuwe therapeutische benaderingen voor LAMA2-CMD.
In vitro systemen bieden een gecontroleerde omgeving voor het bestuderen van cel-cel en cel-ECM interacties, maar 2D-cultuurmodellen missen de complexiteit van inheemse weefsels. Decellularisatie van weefsels produceert weefsel- en ontwikkelingsstadiumspecifieke acellulaire ECM-scaffolds die de natuurlijke celmicro-omgeving nauwkeuriger nabootsen in vergelijking met 2D-modellen en gemanipuleerde / synthetische steigers. Gedecellulariseerde matrices (dECM’s) hebben het potentieel om de moleculaire en mechanische signalen van het gastheerweefsel te behouden, waardoor ze betere alternatieve modellen zijn voor het begrijpen van in vivo processen11.
Er zijn verschillende technieken, reagentia en aandoeningen die kunnen worden gebruikt voor decellularisatie12,13. In deze studie wordt een decellularisatieprotocol voor het foetale muizenhart, beschreven door Silva et al.14,15, aangepast aan de skeletspieren van de foetale muis en blijkt het alle geteste ECM-componenten (laminine α2, totale laminines, fibronectine, collageen I en collageen IV) te behouden. Het protocol omvat drie stappen: cellyse door osmotische shock (hypotone buffer), plasmamembraanoplossing en eiwitdissociatie (0,05% natriumdodecylsulfaat [SDS]) en enzymatische vernietiging van DNA (DNase-behandeling). Voor zover wij weten, is dit het eerste vastgestelde protocol voor het decellulariseren van foetale skeletspieren van muizen.
Om dit 3D in vitro systeem te gebruiken voor het bestuderen van LAMA2-CMD, is het cruciaal om de laminine α2 keten te behouden na decellularisatie. Daarom werd een optimalisatieprotocol geïmplementeerd waarbij verschillende detergentia (SDS en Triton X-100) en concentraties (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% en 0,5%) werden getest (gegevens niet getoond). De optimale keuze voor celverwijdering en conservering van het laminine α2-eiwit bleek 0,05% SDS te zijn. C2C12-cellen, een gevestigde myoblastcellijn16,17, werden gebruikt om de dECM’s te zaaien. Deze cellen dringen de dECM binnen, prolifereren en differentiëren in deze steigers, waardoor nieuwe ECM-eiwitten worden gesynthetiseerd. De succesvolle productie van dit 3D in vitro model biedt een nieuwe benadering voor het begrijpen van de moleculaire en cellulaire processen die betrokken zijn bij foetale myogenese, het begin van LAMA2-CMD, en kan worden uitgebreid naar andere spierziekten waar de communicatie tussen de ECM en skeletspiercellen wordt verstoord.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ECM is een complex netwerk van macromoleculen dat in alle weefsels aanwezig is en een cruciale rol speelt bij het reguleren van celgedrag en -functie2. De ECU fungeert als een fysieke steiger voor cellen om zich aan te hechten en biedt signalen die actief cellulaire processen moduleren, zoals proliferatie, motiliteit, differentiatie en apoptose. Een goede vorming en onderhoud van de ECM is dus essentieel voor zowel de ontwikkeling als de homeostase1.
<p class="jove_c…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; contract nr. 23049), het MATRIHEALTH-project en cE3c-eenheidsfinanciering UIDB/00329/2020. We willen graag onze donateur Henrique Meirelles bedanken die ervoor heeft gekozen om het MATRIHEALTH-project te ondersteunen. Dit werk profiteerde van de infrastructuren van de Faculteit Wetenschappen Microscopie Faciliteit, een knooppunt van het Portugese Platform van BioImaging (referentie PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), en we danken Luís Marques voor zijn hulp bij beeldacquisitie en -verwerking. Tot slot bedanken we Marta Palma voor de technische ondersteuning en ons onderzoeksteam voor hun genereuze bijdragen.
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
