Подготовка 3D децеллюляризованных матриц из скелетных мышц плода мыши для культивирования клеток
Summary
В данной работе был оптимизирован протокол децеллюляризации для получения децеллюляризированных матриц скелетных мышц плода мыши. Миобласты C2C12 могут колонизировать эти матрицы, размножаться и дифференцироваться. Эта модель in vitro может быть использована для изучения поведения клеток в контексте заболеваний скелетных мышц, таких как мышечные дистрофии.
Abstract
Внеклеточный матрикс (ECM) играет решающую роль в обеспечении структурной поддержки клеток и передаче сигналов, которые важны для различных клеточных процессов. Двумерные (2D) модели клеточных культур чрезмерно упрощают сложные взаимодействия между клетками и ECM, поскольку отсутствие полной трехмерной (3D) поддержки может изменить поведение клеток, делая их неадекватными для понимания процессов in vivo . Недостатки в составе ECM и взаимодействиях между клетками и ECM являются важными факторами, способствующими множеству различных заболеваний.
Одним из примеров является врожденная мышечная дистрофия LAMA2 (LAMA2-CMD), при которой отсутствие или снижение функционального ламинина 211 и 221 может привести к тяжелой гипотонии, обнаруживаемой при рождении или вскоре после него. Предыдущая работа с использованием мышиной модели заболевания предполагает, что его начало происходит во время миогенеза плода. Настоящее исследование было направлено на разработку 3D-модели in vitro , позволяющей изучать взаимодействия между мышечными клетками и ECM мышц плода, имитируя нативное микроокружение. В этом протоколе используются глубокие мышцы спины, рассеченные из плодов мыши E18.5, обработанные гипотоническим буфером, анионным моющим средством и ДНКазой. Полученные децеллюляризованные матрицы (dECM) сохранили все протестированные белки ECM (ламинин α2, общие ламинины, фибронектин, коллаген I и коллаген IV) по сравнению с нативной тканью.
Когда миобласты C2C12 были посеяны поверх этих dECM, они проникли и колонизировали dECM, что поддерживало их пролиферацию и дифференцировку. Кроме того, клетки C2C12 продуцируют белки ECM, способствуя ремоделированию их ниши в dECM. Создание этой платформы in vitro обеспечивает новый многообещающий подход к разгадке процессов, связанных с возникновением LAMA2-CMD, и может быть адаптировано к другим заболеваниям скелетных мышц, где недостатки в коммуникации между ECM и клетками скелетных мышц способствуют прогрессированию заболевания.
Introduction
Внеклеточный матрикс (ECM) является основным компонентом тканей, представляя их неклеточный компонент. Эта трехмерная (3D) структура не только обеспечивает физическую поддержку клеток, но и играет решающую роль в биохимических процессах, участвующих в развитии организмов1. Формирование тканеспецифической ЭКМ происходит в процессе развития, в результате сложных взаимодействий между клетками и их нишами, на которые влияют различные внутри- и внеклеточные раздражители. ECM представляет собой высокодинамичную структуру, которая претерпевает химические и механические перестройки временно-пространственным образом и напрямую влияет на судьбу клетки2. Одной из наиболее примечательных характеристик ECM является его функциональное разнообразие, поскольку каждая тканевая ECM отображает уникальную комбинацию молекул, которые обеспечивают различные топологии и свойства, адаптированные к содержащимся в ней клеткам1.
Передача сигналов и поддержка ECM имеют решающее значение для развития и гомеостаза, и при нарушении могут привести к множественным патологическим состояниям 3,4. Одним из примеров является врожденная дистрофия с дефицитом LAMA2 (LAMA2-CMD), которая является наиболее распространенной формой врожденной мышечной дистрофии. Ген LAMA2 кодирует цепь ламинина α2, которая присутствует в ламинине 211 и ламинине 221, и при мутации может привести к LAMA2-CMD 5. Ламинин 211 является основной изоформой, обнаруженной в базальной мембране, окружающей волокна скелетных мышц. Когда ламинин 211 является аномальным или отсутствует, связь между базальной мембраной и мышечными клетками нарушается, что приводит к возникновению заболевания6. Пациенты с LAMA2-CMD демонстрируют фенотип от легкой до тяжелой степени в зависимости от типа мутации в гене LAMA2.
Когда нарушается функция белка ламинина α2, пациенты могут испытывать тяжелую мышечную гипотонию при рождении и развивать хроническое воспаление, фиброз и мышечную атрофию, что приводит к сокращению продолжительности жизни. На сегодняшний день не разработано таргетных методов лечения, а терапевтические подходы ограничиваются облегчением симптомов заболевания7. Таким образом, понимание основных молекулярных механизмов, участвующих в возникновении этого заболевания, имеет решающее значение для разработки соответствующих терапевтических стратегий 6,8. Предыдущая работа с использованием мыши dyW 9, модели для LAMA2-CMD, предполагает, что начало заболевания начинается в утробе матери, особенно во время миогенезаплода 10. Лучшее понимание того, как возникает дефект миогенеза плода, изменит правила игры в создании новых терапевтических подходов для LAMA2-CMD.
Системы in vitro обеспечивают контролируемую среду для изучения межклеточных и клеточно-ECM-взаимодействий, но 2D-моделям культур не хватает сложности нативных тканей. Децеллюляризация тканей производит тканеспецифические и стадия развития бесклеточные каркасы ECM, которые более точно имитируют естественное микроокружение клеток по сравнению с 2D-моделями и инженерными/синтетическими каркасами. Децеллюлярные матрицы (dECM) обладают потенциалом для сохранения молекулярных и механических сигналов ткани хозяина, что делает их лучшими альтернативными моделями для понимания процессов in vivo 11.
Существуют различные методы, реагенты и условия, которые могут быть использованы для децеллюляризации12,13. В этом исследовании протокол децеллюляризации сердца плода мыши, описанный Silva et al.14,15, адаптирован к скелетным мышцам плода мыши и, как было обнаружено, сохраняет все протестированные компоненты ECM (ламинин α2, общие ламинины, фибронектин, коллаген I и коллаген IV). Протокол включает три этапа: лизис клеток осмотическим шоком (гипотонический буфер), растворение плазматической мембраны и диссоциацию белка (0,05% додецилсульфата натрия [SDS]) и ферментативное разрушение ДНК (обработка ДНКазой). Насколько нам известно, это первый установленный протокол децеллюляризации скелетных мышц плода мыши.
Чтобы использовать эту 3D-систему in vitro для изучения LAMA2-CMD, крайне важно поддерживать цепь ламинина α2 после децеллюляризации. Поэтому был реализован протокол оптимизации, в котором тестировались различные моющие средства (SDS и Triton X-100) и концентрации (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% и 0,5%) (данные не показаны). Было обнаружено, что оптимальным выбором для удаления клеток и сохранения белка ламинина α2 является 0,05% SDS. Клетки C2C12, хорошо зарекомендовавшая себя линияклеток миобластов 16,17, были использованы для посева dECM. Эти клетки вторгаются в dECM, размножаются и дифференцируются внутри этих каркасов, синтезируя новые белки ECM. Успешное создание этой 3D-модели in vitro предлагает новый подход к пониманию молекулярных и клеточных процессов, участвующих в миогенезе плода, начале LAMA2-CMD, и может быть распространено на другие мышечные заболевания, при которых нарушается связь между ECM и клетками скелетных мышц.
Protocol
Representative Results
Discussion
ECM представляет собой сложную сеть макромолекул, которая присутствует во всех тканях и играет решающую роль в регуляции поведения и функции клеток2. ECM действует как физический каркас для прикрепления клеток и обеспечивает сигналы, которые активно модулируют клеточные про…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Французской ассоциацией борьбы с миопатиями (AFM-Téléthon; контракт No 23049), проектом MATRIHEALTH и финансированием подразделения cE3c UIDB/00329/2020. Мы хотели бы поблагодарить нашего донора Энрике Мейреллеса, который решил поддержать проект MATRIHEALTH. В этой работе использовалась инфраструктура Центра микроскопии факультета естественных наук, узла Португальской платформы биовизуализации (ссылка PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), и мы благодарим Луиса Маркеса за его помощь в получении и обработке изображений. Наконец, мы благодарим Марту Пальму за техническую поддержку и нашу исследовательскую группу за их щедрый вклад.
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
