Preparazione di matrici decellularizzate 3D da muscolo scheletrico fetale di topo per coltura cellulare
Summary
In questo lavoro, un protocollo di decellularizzazione è stato ottimizzato per ottenere matrici decellularizzate del muscolo scheletrico fetale del topo. I mioblasti C2C12 possono colonizzare queste matrici, proliferare e differenziarsi. Questo modello in vitro può essere utilizzato per studiare il comportamento cellulare nel contesto di malattie del muscolo scheletrico come le distrofie muscolari.
Abstract
La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo cruciale nel fornire supporto strutturale per le cellule e trasmettere segnali importanti per vari processi cellulari. I modelli di coltura cellulare bidimensionale (2D) semplificano eccessivamente le complesse interazioni tra cellule e ECM, poiché la mancanza di un supporto tridimensionale completo (3D) può alterare il comportamento cellulare, rendendoli inadeguati per la comprensione dei processi in vivo . Le carenze nella composizione della ECM e nelle interazioni cellula-ECM sono importanti contributori a una varietà di malattie diverse.
Un esempio è la distrofia muscolare congenita LAMA2 (LAMA2-CMD), dove l’assenza o la riduzione della laminina funzionale 211 e 221 può portare a grave ipotonia, rilevabile alla nascita o subito dopo. Lavori precedenti che utilizzano un modello murino della malattia suggeriscono che la sua insorgenza si verifica durante la miogenesi fetale. Il presente studio mirava a sviluppare un modello 3D in vitro che permettesse lo studio delle interazioni tra cellule muscolari e ECM muscolare fetale, imitando il microambiente nativo. Questo protocollo utilizza muscoli profondi della schiena sezionati da feti di topo E18.5, trattati con un tampone ipotonico, un detergente anionico e DNasi. Le matrici decellularizzate risultanti (dECM) hanno mantenuto tutte le proteine ECM testate (laminina α2, laminine totali, fibronectina, collagene I e collagene IV) rispetto al tessuto nativo.
Quando i mioblasti C2C12 sono stati seminati sopra questi dECM, sono penetrati e hanno colonizzato i dECM, che hanno supportato la loro proliferazione e differenziazione. Inoltre, le cellule C2C12 hanno prodotto proteine ECM, contribuendo al rimodellamento della loro nicchia all’interno delle dECM. L’istituzione di questa piattaforma in vitro fornisce un nuovo approccio promettente per svelare i processi coinvolti nell’insorgenza di LAMA2-CMD e ha il potenziale per essere adattato ad altre malattie del muscolo scheletrico de cui le carenze nella comunicazione tra la ECM e le cellule muscolari scheletriche contribuiscono alla progressione della malattia.
Introduction
La matrice extracellulare (ECM) è un costituente importante dei tessuti, che rappresenta la loro componente non cellulare. Questa struttura tridimensionale (3D) non solo fornisce supporto fisico per le cellule, ma svolge anche un ruolo cruciale nei processi biochimici coinvolti nello sviluppo degli organismi1. La formazione di una ECM tessuto-specifica avviene durante lo sviluppo, come risultato delle complesse interazioni tra le cellule e le loro nicchie, influenzate da vari stimoli intra ed extracellulari. L’ECM è una struttura altamente dinamica che subisce riarrangiamenti chimici e meccanici in modo temporale-spaziale e influisce direttamente sul destino cellulare2. Una delle caratteristiche più notevoli della MEC è la sua diversità funzionale, poiché ogni ECM tissutale mostra una combinazione unica di molecole che forniscono diverse topologie e proprietà adattate alle cellule che contiene1.
La segnalazione e il supporto della ECM sono cruciali per lo sviluppo e l’omeostasi e, se interrotti, possono portare a molteplici condizioni patologiche 3,4. Un esempio è la distrofia congenita con deficit di LAMA2 (LAMA2-CMD), che è la forma più comune di distrofia muscolare congenita. Il gene LAMA2 codifica per la catena α2 della laminina, che è presente nella laminina 211 e nella laminina 221, e quando mutato può portare a LAMA2-CMD 5. La laminina 211 è l’isoforma principale presente nella membrana basale che circonda le fibre muscolari scheletriche. Quando la laminina 211 è anormale o assente, il legame tra la membrana basale e le cellule muscolari viene interrotto, portando all’insorgenza della malattia6. I pazienti con LAMA2-CMD mostrano un fenotipo da lieve a grave a seconda del tipo di mutazione nel gene LAMA2.
Quando la funzione della proteina α2 della laminina è compromessa, i pazienti possono sperimentare una grave ipotonia muscolare alla nascita e sviluppare infiammazione cronica, fibrosi e atrofia muscolare, portando a una ridotta aspettativa di vita. Ad oggi, non sono stati sviluppati trattamenti mirati e gli approcci terapeutici sono limitati ad alleviare i sintomi della malattia7. Pertanto, la comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti coinvolti nell’insorgenza di questa malattia è cruciale per lo sviluppo di strategie terapeutiche appropriate 6,8. Precedenti lavori che utilizzano il topo dyW 9, un modello per LAMA2-CMD, suggeriscono che l’insorgenza della malattia inizia in utero, in particolare durante la miogenesi fetale10. Una migliore comprensione di come emerge il difetto della miogenesi fetale sarebbe un punto di svolta nella generazione di nuovi approcci terapeutici per LAMA2-CMD.
I sistemi in vitro forniscono un ambiente controllato per lo studio delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM, ma i modelli di coltura 2D mancano della complessità dei tessuti nativi. La decellularizzazione dei tessuti produce scaffold ECM acellulari specifici per il tessuto e lo stadio di sviluppo che imitano in modo più accurato il microambiente cellulare naturale rispetto ai modelli 2D e agli scaffold ingegnerizzati / sintetici. Le matrici decellularizzate (dECM) hanno il potenziale di preservare i segnali molecolari e meccanici del tessuto ospite, rendendoli migliori modelli alternativi per la comprensione dei processi in vivo 11.
Esistono varie tecniche, reagenti e condizioni che possono essere utilizzate per la decellularizzazione12,13. In questo studio, un protocollo di decellularizzazione per il cuore fetale di topo, descritto da Silva et al.14,15, è adattato al muscolo scheletrico fetale del topo e si trova a conservare tutti i componenti ECM testati (laminina α2, laminine totali, fibronectina, collagene I e collagene IV). Il protocollo prevede tre fasi: lisi cellulare mediante shock osmotico (tampone ipotonico), dissoluzione della membrana plasmatica e dissociazione proteica (0,05% sodio dodecilsolfato [SDS]) e distruzione enzimatica del DNA (trattamento con DNasi). Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo stabilito per decellularizzare il muscolo scheletrico fetale del topo.
Per utilizzare questo sistema 3D in vitro per lo studio di LAMA2-CMD, è fondamentale mantenere la catena α2 della laminina dopo la decellularizzazione. Pertanto, è stato implementato un protocollo di ottimizzazione in cui sono stati testati diversi detergenti (SDS e Triton X-100) e concentrazioni (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% e 0,5%) (dati non mostrati). La scelta ottimale per la rimozione cellulare e la conservazione della proteina laminina α2 è risultata essere lo 0,05% di SDS. Le cellule C2C12, una linea cellulare di mioblasti ben consolidata16,17, sono state utilizzate per seminare i dECM. Queste cellule invadono la dECM, proliferano e si differenziano all’interno di questi scaffold, sintetizzando nuove proteine ECM. Il successo della produzione di questo modello 3D in vitro offre un nuovo approccio alla comprensione dei processi molecolari e cellulari coinvolti nella miogenesi fetale, l’insorgenza di LAMA2-CMD e può essere esteso ad altre malattie muscolari de cui la comunicazione tra la ECM e le cellule muscolari scheletriche viene interrotta.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ECM è una complessa rete di macromolecole che è presente in tutti i tessuti e svolge un ruolo cruciale nella regolazione del comportamento e della funzione cellulare2. L’ECM agisce come un’impalcatura fisica a cui le cellule possono attaccarsi e fornisce segnali che modulano attivamente i processi cellulari come proliferazione, motilità, differenziazione e apoptosi. Pertanto, una corretta formazione e mantenimento della ECM è essenziale sia per lo sviluppo che per l’omeostasi<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dall’Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; contratto n. 23049), dal progetto MATRIHEALTH e dal finanziamento dell’unità cE3c UIDB/00329/2020. Vorremmo ringraziare il nostro donatore Henrique Meirelles che ha scelto di sostenere il progetto MATRIHEALTH. Questo lavoro ha beneficiato delle infrastrutture della Facoltà di Scienze Microscopy Facility, un nodo della piattaforma portoghese di BioImaging (riferimento PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), e ringraziamo Luís Marques per la sua assistenza con l’acquisizione e l’elaborazione delle immagini. Infine, ringraziamo Marta Palma per il supporto tecnico e il nostro team di ricerca per il loro generoso contributo.
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
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