세포 배양을 위한 태아 마우스 골격근의 3D 탈세포화 매트릭스 준비
Summary
이 작업에서, 태아 마우스 골격근의 탈세포화된 매트릭스를 얻기 위해 탈세포화 프로토콜이 최적화되었습니다. C2C12 근모세포는 이러한 매트릭스를 식민지화하고 증식하며 분화할 수 있습니다. 이 시험관 내 모델은 근이영양증과 같은 골격근 질환의 맥락에서 세포 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
세포외 기질(ECM)은 세포에 대한 구조적 지지를 제공하고 다양한 세포 과정에 중요한 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 합니다. 2차원(2D) 세포 배양 모델은 완전한 3차원(3D) 지지체가 부족하여 세포 거동을 변화시켜 생체 내 공정을 이해하기에 부적절할 수 있기 때문에 세포와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 지나치게 단순화합니다. ECM 구성 및 세포-ECM 상호 작용의 결핍은 다양한 질병의 중요한 원인입니다.
한 가지 예는 LAMA2-선천성 근이영양증(LAMA2-CMD)이며, 여기서 기능성 라미닌 211 및 221의 부재 또는 감소는 출생 시 또는 출생 직후에 감지할 수 있는 심각한 저조를 유발할 수 있습니다. 이 질환의 마우스 모델을 사용한 이전 연구는 태아 근 발생 중에 발병이 발생한다는 것을 시사합니다. 본 연구는 천연 미세 환경을 모방하여 근육 세포와 태아 근육 ECM 간의 상호 작용을 연구할 수 있는 3D 시험관 내 모델을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 프로토콜은 E18.5 마우스 태아에서 해부된 등 깊은 근육을 사용하여 저삼투압 완충액, 음이온성 세제 및 DNase로 처리합니다. 그 결과 탈세포화 매트릭스(dECM)는 천연 조직과 비교하여 테스트된 모든 ECM 단백질(라미닌 α2, 총 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV)을 유지했습니다.
C2C12 근모세포가 이러한 dECM 위에 시드되었을 때, 그들은 dECM에 침투하여 식민지화하여 증식과 분화를 지원했습니다. 또한, C2C12 세포는 ECM 단백질을 생산하여 dECM 내에서 틈새 시장의 리모델링에 기여했습니다. 이 시험관 내 플랫폼의 구축은 LAMA2-CMD의 발병과 관련된 과정을 밝히기 위한 새로운 유망한 접근 방식을 제공하며 ECM과 골격근 세포 사이의 통신 결함이 질병 진행에 기여하는 다른 골격근 질환에 적응할 가능성이 있습니다.
Introduction
세포외 기질(ECM)은 조직의 주요 구성 요소로, 비세포 구성 요소를 나타냅니다. 이 3차원(3D) 구조는 세포에 대한 물리적 지지를 제공할 뿐만 아니라 유기체1의 발달과 관련된 생화학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 조직 특이적 ECM의 형성은 다양한 세포 내 및 세포 외 자극의 영향을 받는 세포와 틈새 사이의 복잡한 상호 작용의 결과로 발달 중에 발생합니다. ECM은 시간적-공간적 방식으로 화학적, 기계적 재배열을 거쳐 세포 운명2에 직접적인 영향을 미치는 매우 역동적인 구조입니다. ECM의 가장 주목할만한 특징 중 하나는 기능적 다양성으로, 각 조직 ECM은 ECM이 포함하는 세포에 맞게 조정된 다양한 토폴로지와 특성을 제공하는 고유한 분자 조합을 표시하기 때문입니다1.
ECM 신호전달과 지원은 발달과 항상성에 매우 중요하며, 중단될 경우 여러 병리학적 상태를 유발할 수 있다 3,4. 한 가지 예는 선천성 근이영양증의 가장 흔한 형태인 LAMA2 결핍 선천성 이영양증(LAMA2-CMD)입니다. LAMA2 유전자는 라미닌 211 및 라미닌 221에 존재하는 라미닌 α2 사슬을 암호화하며, 돌연변이되면 LAMA2-CMD 5를 유발할 수 있습니다. 라미닌 211은 골격근 섬유를 둘러싸고 있는 기저막에서 발견되는 주요 동형입니다. 라미닌(211)이 비정상적이거나 부재하는 경우, 기저막과 근육 세포 사이의 연결이 끊어져 질병이 발병하게 된다6. LAMA2-CMD 환자는 LAMA2 유전자의 돌연변이 유형에 따라 경증에서 중증의 표현형을 보입니다.
라미닌 α2 단백질의 기능이 영향을 받으면 환자는 출생 시 심각한 근긴장저하를 경험하고 만성 염증, 섬유증 및 근육 위축이 발생하여 기대 수명이 단축될 수 있습니다. 현재까지 표적 치료법은 개발되지 않았으며 치료적 접근은 질병의 증상을 완화하는 데 국한되어 있다7. 따라서 이 질병의 발병과 관련된 기본 분자 메커니즘을 이해하는 것은 적절한 치료 전략을 개발하는 데 중요합니다 6,8. LAMA2-CMD의 모델인 dyW 마우스9를 사용한 이전 연구에서는 질병의 발병이 자궁 내에서, 특히 태아 근형성 동안 시작된다는 것을 시사한다10. 태아 근형성 결함이 어떻게 나타나는지에 대한 더 나은 이해는 LAMA2-CMD에 대한 새로운 치료 접근법을 생성하는 게임 체인저가 될 것입니다.
체외 시스템은 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용을 연구하기 위한 제어된 환경을 제공하지만, 2D 배양 모델은 천연 조직의 복잡성이 부족합니다. 조직의 탈세포화는 2D 모델 및 엔지니어링/합성 스캐폴드에 비해 자연 세포 미세 환경을 보다 정확하게 모방하는 조직 및 발달 단계별 무세포 ECM 스캐폴드를 생성합니다. 탈세포화 매트릭스(decellularized matrice, dECM)는 숙주 조직의 분자 및 기계적 신호를 보존할 수 있는 잠재력을 가지고 있어, 생체 내 공정을 이해하기 위한 더 나은 대안 모델이 된다11.
탈세포화(decellularization)를 위해 사용될 수 있는 다양한 기술, 시약 및 조건이 존재한다12,13. 이 연구에서 Silva et al.14,15에 의해 설명된 태아 마우스 심장에 대한 탈세포화 프로토콜은 태아 마우스 골격근에 적용되었으며 테스트된 모든 ECM 구성 요소(라미닌 α2, 총 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV)를 유지하는 것으로 밝혀졌습니다. 프로토콜에는 삼투압 쇼크에 의한 세포 용해(저삼투압 완충액), 원형질막 용해 및 단백질 해리(0.05% 도데실 황산나트륨[SDS]), DNA의 효소 파괴(DNase 처리)의 세 단계가 포함됩니다. 우리가 아는 한, 이것은 마우스 태아 골격근을 탈세포화하기 위해 확립된 최초의 프로토콜입니다.
LAMA2-CMD를 연구하기 위해 이 3D 체외 시스템을 사용하려면 탈세포화 후 라미닌 α2 사슬을 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 다양한 세제(SDS 및 Triton X-100)와 농도(0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% 및 0.5%)를 테스트하는 최적화 프로토콜이 구현되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 라미닌 α2 단백질의 세포 제거 및 보존을 위한 최적의 선택은 0.05% SDS인 것으로 밝혀졌다. 잘 확립된 근원모세포 세포주인 C2C12 세포주16,17을 사용하여 dECM을 시딩했습니다. 이 세포는 dECM을 침범하여 이 스캐폴드 내부에서 증식 및 분화하여 새로운 ECM 단백질을 합성합니다. 이 3D 체외 모델의 성공적인 생산은 태아 근 발생, LAMA2-CMD의 시작과 관련된 분자 및 세포 과정을 이해하는 새로운 접근 방식을 제공하며 ECM과 골격근 세포 간의 통신이 중단되는 다른 근육 질환으로 확장될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ECM은 모든 조직에 존재하는 거대분자의 복잡한 네트워크로, 세포 거동과 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 한다2. ECM은 세포가 부착할 물리적 스캐폴드 역할을 하며 증식, 운동성, 분화 및 세포자멸사와 같은 세포 과정을 능동적으로 조절하는 신호를 제공합니다. 따라서 ECM의 적절한 형성과 유지는 발달과 항상성 모두에 필수적이다1.
2D 세…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Association Française contre les Myopathies(AFM-Téléthon, 계약 번호 23049), MATRIHEALTH 프로젝트 및 cE3c 단위 자금 지원 UIDB/00329/2020의 자금 지원을 받았습니다. MATRIHEALTH 프로젝트를 지원하기로 선택한 기부자 Henrique Meirelles에게 감사드립니다. 이 작업은 포르투갈 바이오이미징 플랫폼(PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 참조)의 노드인 과학부 현미경 시설의 인프라를 활용했으며, 이미지 획득 및 처리에 도움을 준 Luís Marques에게 감사드립니다. 마지막으로, 기술 지원에 대해 Marta Palma와 관대 한 기여에 대해 연구팀에 감사드립니다.
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
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